Detecção de “Restriction Fragment Length Polymorphism

A Southern Blot é uma técnica mais sensível para a análise intraespecífica que a de isoenzimas, porém, também demanda grande número de oocistos (FERNANDEZ et al., 2003a). A técnica consiste na utilização de enzimas de restrição para a digestão do DNA, separação dos fragmentos por meio de eletroforese em gel de agarose e a transferência desses para uma membrana, resultando em uma réplica dos fragmentos de DNA do gel na membrana. Em seguida aplica-se uma sonda marcada, geralmente derivada do mesmo DNA genômico, para hibridizar com as sequencias específicas, possibilitando a visualização do padrão (tamanho e disposição) e espaçamento entre os fragmentos (SHIRLEY, 1994). Essa técnica permite uma melhor visualização, pois,

no gel pode ocorrer uma grande quantidade de sinais de hibridização inespecífica que pode mascarar as específicas (BROWN, 2003). É uma técnica que fornece uma quantidade menor de informações, é mais trabalhosa e demorada, quando comparada com RAPD e AFLP (MUELLER; WOLFENBARGER, 1999). Shirley (1994) utilizou a transferência de Southern para RFLP com quatro sondas de DNA que repetem várias vezes no genoma de E. tenella para diferenciar oito amostras de E. tenella, três das quatro sondas hibridizaram apenas com o DNA de E. tenella enquanto uma sonda também hibridizou com o DNA de E. praecox e E. acervulina. No entanto, a detecção de RFLP por hibridização Southern Blot é trabalhosa, requer marcadores de DNA específicos e é relativamente dispendiosa (PROCUNIER, et al., 1993). 2.4.2.3 “Random Amplification of Polymorphic DNA” (RAPD)

A RAPD, ao contrário da PCR, é uma ferramenta que pode ser utilizada para a identificação das espécies sem a necessidade do conhecimento prévio da sequência da região a ser amplificada. Para essa técnica são empregados iniciadores arbitrários sob condições de baixa estringência, ou seja, pequenos oligonucleotídeos utilizados como “primers” são colocados para hibridizar a uma baixa temperatura, isso permite menores incompatibilidades de ligação. Após, são feitas comparações dos tamanhos das bandas geradas para a análise de marcadores que possam ser usados para a diferenciação entre as espécies (FERNANDEZ et al., 2003b; MACPHERSON; GAJADHAR, 1993; PROCUNIER et al., 1993). Possui como inconvenientes baixa reprodutibilidade e a possibilidade de ocorrerem sobreposições de bandas, o que diminui sua exatidão para diagnósticos de amostras de campo, que geralmente são compostos por mais de uma espécie (FERNANDEZ et al., 2003b). Essa técnica tem sido empregada para a diferenciação entre espécies de Eimeria e entre cepas de uma mesma espécie que parasitam aves da espécie G. gallus domesticus. Procunier et al., (1993) perceberam que as diferenças encontradas entre as espécies eram maiores que as observadas entre cepas de uma mesma espécie, também, observaram uma maior relação entre as amostras de E. tenella (98%) que de E. acervulina (61%). A mesma abordagem foi utilizada para a diferenciação de sete espécies de Eimeria, dentre estas, uma de aves e seis de mamíferos (MACPHERSON; GAJADHAR, 1993). Johnston e Fernando, (1995) utilizando a técnica de RAPD e comparando dois métodos para a visualização dos resultados, a Denaturing gradient-gel electrophoresis – DGGE (eletroforese em gel

com gradiente de desnaturação) e Polyacrylamide gel electrophoresis – PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida) não só confirmaram a maior proximidade de cepas de E. tenella quando comparadas com E. acervulina como também perceberam uma melhor resolução dos fragmentos quando utilizada a DGGE. A técnica de RAPD pode ser empregada para pesquisar marcadores moleculares conhecidos como SCAR, utilizados na identificação das espécies de Eimeria de galinhas, por meio da PCR (FERNANDEZ et al., 2003b; 2004). A partir dos SCAR são desenhados “primers” específicos, mais longos que os utilizados na RAPD, que são utilizados em condições mais rigorosas (alta temperatura de hibridação), tornando a PCR com esses “primers” mais confiáveis que a técnica de RAPD para o diagnóstico. Fernandez et al., (2004) identificaram 84 SCAR espécie-específicos e 67 com especificidade parcial para as espécies de Eimeria de galinhas.

2.4.2.4 “Amplified Fragment Length Polymorphysm” (AFLP) A técnica de AFLP, a exemplo da RAPD e da RFLP, também, pode ser utilizada para a identificação de marcadores moleculares. Para a elaboração dessa técnica, primeiramente são utilizadas enzimas de restrição que fazem a digestão do DNA em locais específicos, de acordo com a enzima utilizada, em seguida faz-se a ligação de adaptadores nas extremidades dos fragmentos resultantes dessa digestão enzimática, e a execução de uma AFLP-PCR com a utilização de “primers” específicos que se ligam às sequências dos adaptadores. Dessa forma são amplificados os fragmentos resultantes da digestão com as enzimas de restrição, e finalmente o material amplificado é visualizado em um gel de eletroforese (MUELLER; WOLFENBARGER, 1999). É uma técnica que, diferentemente da RAPD, é altamente replicável, pois, “primers” específicos são utilizados na reação da AFLP-PCR sob alta temperatura de hibridização, e possibilita uma melhor visualização, pois, a produção de artefatos é muito menor que na RAPD. Shirley e Harvey (2000), com o objetivo de investigar as bases genéticas da abreviação do ciclo de cepas precoces de Eimeria spp., cruzaram uma linhagem de E. tenella de menor período pré-patente com outra resistente ao anticoccidiano arprinocida. Nesse estudo, foram empregadas três abordagens para a identificação de marcadores de DNA, hibridização de RFLP por Southern Blot, RAPD-PCR e AFLPs. A técnica de AFLP gerou um número maior de informações, mais de 8.600 fragmentos foram amplificados, sendo que destes, 379 eram polimórficos. No mapa gerado foram identificados “loci” genéticos implicados na regulação do ciclo de

vida desse parasito no cromossomo 2 e “loci” para resistência à arprinocida no cromossomo 1. Uma limitação é que a AFLP requer DNA de alta qualidade, portanto, a dificuldade para reproduzir um grande número de parasitos recombinantes e a subsequente coleta do DNA genômico a partir de esporozoítos purificados torna-se um entrave para a execução da técnica.