Multiplex PCR

Fernandez et. al., (2003a), desenvolveram uma PCR múltipla para a identificação das sete espécies de Eimeria de galinhas em uma reação. Para isso, utilizaram marcadores SCAR, obtidos a partir da técnica de RAPD. A escolha dos marcadores foi feita de modo a permitir que os sete conjuntos de “primers” pudessem ser utilizados em uma PCR, com as mesmas condições de ciclo e com a geração de “amplicons” de tamanho específicos. O emprego desses “primers” foi padronizado, utilizando 33 cepas, no mínimo duas por continente, compreendendo as sete espécies de Eimeria isoladas de galinhas em várias regiões ao redor do mundo (América do Sul, América do Norte e Europa). Todas as cepas testadas foram detectadas, apresentaram bandas de amplificação do tamanho esperado e não foram relatadas reações cruzadas, demonstrando a aplicação universal desse ensaio. Gasser et al. (2001) desenvolveram uma PCR múltipla baseada no ITS-2 para a identificação das sete espécies de Eimeria de galinhas. Para esse teste, utilizam um único conjunto de marcadores gênero/família (primers WW2 / WW4r). Vrba et al. (2010) citaram que podem ocorrer variações intraespecíficas devido à característica polimórfica da região ITS-2.

Segundo Fernandez et al. (2003a) a Multiplex PCR possui uma sensibilidade de detecção de 2-8 oocistos esporulados (1 a 5pg) e percebeu-se apenas uma pequena variação na sensibilidade para a detecção de E. acervulina (1pg) e E. maxima (5pg) quando da realização do teste com os sete conjuntos de “primers”. Para as demais espécies não ocorreram alterações na sensibilidade do teste. Com o propósito de avaliar a sensibilidade da técnica em condições semelhantes ao campo, os autores testaram a Multiplex PCR em diluições contendo E. acervulina, E. maxima e E. tenella, e encontraram que o limite de detecção foi de 50, 500 e 100 oocistos para cada uma das espécies, respectivamente. Apesar da maior dificuldade na padronização da Multiplex PCR, devido a complexa interação molecular que pode alterar a eficiência de ligação dos “primers”, a técnica diminui a mão de obra e o tempo de execução dos diagnósticos, visto que seriam necessários sete reações de uma PCR convencional para a comprovação da existência ou não das sete espécies de Eimeria que parasitam aves do gênero G. gallus domesticus.

No Egito, Kutkat et al. (2009) empregaram a Multiplex PCR para identificação de protozoários do gênero Eimeria. Foram analisados 95 intestinos em 19 instalações avícolas no Egito. Dessas amostras, 66 foram positivas para Eimeria, e todas apresentaram infecções múltiplas, sendo que seis espécies (E. acervulina, E. maxima, E. tenella, E. praecox, E. mitis e E. necatrix) estavam presentes em 50% das amostras

positivas, e quatro espécies (exceto E. mitis e E. tenella) no restante. A E. brunetti não foi encontrada.

Carvalho et al. (2011) compararam o diagnóstico morfo-clínico com a Multiplex PCR para a identificação das sete espécies de Eimeria que parasitam galinhas, em 30 instalações avícolas em Feira de Santana, Bahia. O diagnóstico morfo-clínico, empregando apenas dois parâmetros (morfologia e tamanho de oocistos e o escore de lesões), forneceu resultados discrepantes daqueles obtidos pela técnica de Multiplex PCR. Por meio da técnica de Multiplex PCR todas as sete espécies de Eimeria de frangos foram encontradas em 13,7% das granjas, enquanto que utilizando a morfologia e medida dos oocistos, as sete espécies foram identificadas em 60% das propriedades. A Multiplex PCR foi sensível e específica e, utilizando essa técnica foram identificados oocistos de E maxima e E. praecox em 100% das granjas, E. mitis e E. necatrix (93,3%), E. acervulina (56,7%), E. tenella (76,7%) e, a E. brunetti (16,7%) foi a menos frequente. Porém, utilizando a morfologia e tamanho de oocistos, a E. brunetti foi identificada em 100% das granjas, esse mesmo percentual foi encontrado para E. tenella e E. praecox, já, a E. acervulina foi a menos frequente (63,3%). Com o escore de lesão, foram identificadas E. maxima em 46,7%, E. acervulina (30%), E. tenella (23,3%) e E. necatrix (10%), entretanto, E. mitis, E. praecox e E. brunetti não foram identificadas. Os autores concluíram que a morfologia e tamanho dos oocistos e, o escore de lesões, utilizados para a identificação, não foram eficientes, principalmente, o escore de lesão.

Ogedengbe et al. (2011) empregaram a Multiplex PCR para a identificação das espécies de Eimeria que parasitam galinha em um estudo de prevalência no Canadá. Segundo os autores, para a pesquisa foram coletados 360 intestinos, procedentes de 36 granjas comerciais e 77 intestinos de aves caipiras. Foram recuperados oocistos somente em 20 amostras, provenientes de oito granjas comerciais. Todas as amostras de granjas comerciais foram processadas pela Multiplex PCR e, apenas nas amostras em que oocistos estavam presentes foram visualizados amplicons, correspondentes a E. acervulina, E. maxima e E. tenella.

Rao et al. (2013) testaram a aplicabilidade da Multiplex PCR para a identificação molecular de espécies de Eimeria. Para isso, foram utilizados oocistos provenientes de onze amostras procedentes de várias regiões da Índia. Sendo que, os oocistos destas amostras foram previamente identificados, por outros autores, por meio de características morfológicas e o tamanho dos oocistos, sendo que nestas amostras foi relatada a presença das seguintes espécies de Eimeria por

amostra, 1 a 3 (E. maxima e E. tenella), 4 (E. maxima), 5 (E. acervulina e E. tenella), 6 (E. acervulina, E. maxima, E. tenella, E. mitis e E. brunetti), 7 (E. tenella), 8 e 9 (E. maxima, E. tenella e E. brunetti), 10 (E. tenella, E. necatrix e E. brunetti), 11 (E. acervulina, E. maxima, E. tenella, E. mitis E. necatrix e E. brunetti). Porém, utilizando a Multiplex PCR em amostras com múltiplas espécies, os autores relataram que foi possível amplificar somente os amplicons correspondentes a E. tenella e E. mitis, já, para as amostras, com outras combinações de espécies não se obteve sucesso. Também, comentaram que pequenas quantidades de DNA, obtidas de espécies presentes em um pequeno número de oocistos nas amostras, podem ter sofrido interferência de outras espécies predominantes, que não permitiram a identificação das espécies correspondentes aos oocistos presentes em pequenas quantidades, conforme observado para E. brunetti, que em todos os casos não sofreu amplificação. Logo, concluíram que a padronização dessa técnica é muito difícil.

Portanto, para a melhor adequação de um programa de controle das espécies de Eimeria em uma determinada região é fundamental o conhecimento das espécies circulantes e sua ocorrência, pois o grau de atividade dos anticoccidianos varia de acordo com a espécie de Eimeria e, principalmente, quando o objetivo for o controle da coccidiose por meio da vacinação, é fundamental a identificação das espécies, já que a imunidade contra Eimeria spp é espécie específica. Sendo assim, torna- se óbvio a importância do desenvolvimento e aprimoramento de métodos de diagnóstico que tornem a identificação das espécies de Eimeria, rápida, fácil, precisa e menos onerosa.

3 OBJETIVOS