Polymerase Chain Reaction (PCR)

A reação em cadeia da polimerase (PCR) consiste em uma amplificação seletiva de uma região da molécula de DNA que é selecionada por meio, da utilização de dois pequenos oligonucleotídeos (primers) que são desenhados para hibridizar com as extremidades de uma sequencia alvo (um para cada uma das fitas de DNA). Para isso é necessário o conhecimento das sequencias das extremidades (BROWN, 2003). Na maioria das vezes a amplificação é realizada por uma enzima termoestável, a Taq DNA-polimerase, purificada da bactéria termófila, Thermus aquaticus (Taq), que pode sobreviver à incubação prolongada a 95°C (SAIKI et al., 1988). Essa enzima promove a polimerização de novas fitas de DNA no sentido 5’-3’, durante a fase de extensão.

Prichard (1997) citou que a reação em cadeia da polimerase é uma ferramenta que possui alta sensibilidade e especificidade, torna possível que um fragmento específico de uma pequena quantidade de DNA seja multiplicado seletivamente em milhares de cópias, podendo dessa forma se determinar, por exemplo, a identidade de um parasito a partir de menos que 1 ng de DNA. Segundo Saiki (1988) o alvo específico multiplica-se em uma razão de 2n

, onde n é o número de ciclos de hibridização e extensão.

Stucki et al. (1993) com o objetivo de obter um marcador para a identificação de E. tenella, clonaram uma cópia do gene codificador da unidade 5S do RNA ribossômico dessa espécie e encontram uma região codificadora de 120 nucleotídeos e uma intergênica de 608 nucleotídeos. Nessa última existem muitas repetições contíguas de sequencias que são dispersas através do genoma (ex. o trinucleotídeo CAG e seu complemento CTG). Essas repetições fornecem algumas vantagens em um diagnóstico baseado em DNA, por exemplo, por estarem presentes em um grande número de cópias, melhoram a sensibilidade da prova, e a menor conservação das regiões do espaço entre os genes ribossômicos permite a discriminação entre as espécies. Depois de identificada a região alvo, um conjunto de “primers” foi desenhado e testado em uma PCR usando DNA genômico purificado de seis espécies de Eimeria,

incluindo quatro espécies de aves e duas de mamíferos, apenas um produto de 560 pb que corresponde a E. tenella foi amplificado.

2.4.2.5.1 PCR utilizando o primeiro e o segundo “Internal Transcribed Spacer” (ITS) do DNA ribossômico

Schnitzler et al. (1998, 1999) sequenciaram o ITS-1 do DNA ribossômico (rDNA) e perceberam que a sua heterogeneidade no comprimento e nas sequências de bases entre as espécies poderiam conceber marcadores para o desenho de “primers” espécie-específicos, para a utilização em uma PCR, para a identificação das sete espécies de Eimeria que parasitam aves da espécie G. gallus domesticus. Nesse estudo encontraram dois padrões de bandas para E. maxima, uma superior de 630 pb e outra inferior de 505 pb, e segundo os autores, estudos futuros poderão determinar sua aplicabilidade na identificação de cepas dessa espécie.

Lew et al. (2003) utilizaram o ITS-1 como gerador de alvos para PCR em um estudo para confirmar a presença de sete espécies de Eimeria de galinhas na Austrália e analisar as relações evolutivas de isolados australianos. Para isso, vinte e duas regiões distintas do ITS-1 de 15 isolados australianos de Eimeria de frangos foram sequenciadas e analisadas. Evidenciaram a presença de duas regiões ITS-1, uma curta e uma longa, que podem coexistir em uma cepa, como demonstrado em um clone de E. tenella. Para a PCR foram empregados marcadores ITS- 1 previamente publicados para as espécies de E. acervulina, E. tenella, E. necatrix e E. brunetti, combinados com novos marcadores elaborados para esse estudo (E. mitis, E. praecox e E. maxima australiana). O conjunto de “primers” designado para amplificar uma cepa americana de E. maxima não amplificou a cepa australiana da mesma espécie. Segundo os autores isso se deve pelo fato de que os dois tipos de ITS-1 não coexistem na amostra australiana. Isso reforça a ideia de que os ensaios de PCR utilizando ITS-1 devem ser avaliados em amostras de origens geográficas diferentes, para garantir que eles possam ser usados a nível mundial (HAUG et al., 2007). Lew et al. (2003) encontraram dois clones diferentes de E. mitis provenientes do isolado “A”, portanto, dois conjuntos de “primers” foram desenhados (AMit1 e AMit5) para a identificação dos três isolados australianos estudados dessa espécies, porém, enquanto a PCR empregando o conjunto AMit1 (328 pb) foi capaz de identificar todas as amostras. O mesmo não aconteceu com a PCR utilizando o par de iniciadores AMit5 (193 pb). Apesar da variação

inter e intraespecífica da região ITS-1, as sete espécies de Eimeria que parasitam galinhas foram identificadas na Austrália.

Su et al. (2003) avaliaram a PCR baseada em marcadores ITS-1 para a identificação das espécies de Eimeria contidas em duas vacinas comerciais e uma cepa de E. tenella originária de Taiwan. Empregaram para a PCR um conjunto de cinco “primers” previamente desenhados (E. acervulina, E. maxima, E. tenella, E. necatrix e E. brunetti,). Todos os conjuntos de “primers” amplificaram e não houve nenhuma amplificação inespecífica.

Estudos de prevalência e levantamentos de espécies de Eimeria têm sido executados por meio da PCR utilizando como alvo marcadores situados no ITS-1. Com o objetivo de verificar a presença de E. mitis e E. praecox, espécies de Eimeria até então pouco relatadas no Brasil, Meireles et al. (2004) submeteram à PCR (ITS-1) 156 amostras procedentes de sete estados produtores mais o Distrito Federal. E. praecox estava presente em todos os estados amostrados, enquanto a E. mitis não foi encontrada apenas nos Estados de Goiás e Minas Gerais.

Em um estudo para identificação de Eimeria spp. em instalações industriais de criação de frangos de corte, em Concórdia, Santa Catarina, foi empregado a PCR (ITS-1) para a detecção de E. acervulina, E. maxima, E. tenella e E. mitis. Sendo E. mitis a única espécie não encontrada (PRADO, 2005).

Haug et al. (2008) empregaram a análise morfométrica de oocistos e a PCR para um estudo epidemiológico das espécies de Eimeria que parasitam frangos na Noruega. Verificaram que cinco espécies de Eimeria estavam presentes nas criações de frango (E. acervulina, E. maxima, E. tenella, E. praecox e E. necatrix) e que a concordância da morfometria com a PCR na identificação das espécies foi de apenas 49%.

Aarthi et al. (2010) estudaram a prevalência molecular da coccidiose em frangos na Índia. Os marcadores utilizados foram desenhados a partir de alvos no ITS-1 e a amostragem foi feita de porções de tecidos de vários locais do intestino de aves que apresentavam sinais clínicos. Utilizaram nested PCR, com um conjunto de “primers” para a detecção do gênero Eimeria. O produto dessa reação foi clonado e o DNA extraído do plasmídeo foi submetido a sete reações da PCR para identificação das espécies que acometem frangos. Todas as sete espécies estavam presentes, geralmente em infecções múltiplas.

Na Coréia, Lee et al. (2010), conduziram um estudo epidemiológico das espécies de Eimeria que parasitam frangos. Com esse propósito foram coletadas amostras em 356 granjas, a identificação

das espécies foi realizada por meio da PCR (ITS-1). Todas as sete espécies que parasitam galinhas foram identificadas e geralmente as infecções eram ocasionadas por mais de uma espécie concomitantemente.

Com o objetivo de estudar o emprego do segundo espaçador transcrito interno do DNA ribossômico (ITS-2) na diferenciação específica e intraespécie de amostras australianas de E. acervulina, E. maxima, E. tenella, E. praecox, E. brunetti e E. necatrix, Woods et al. (2000) utilizaram a técnica de PCR-RFLP. Primeiro amplificaram o ITS-2 por meio da PCR, esses amplicons foram digeridos com endonucleases de restrição e então submetidos a desnaturação em uma eletroforese em gel para a análise do polimorfismo no comprimento dos fragmentos produzidos. Encontraram variação consistente de tamanho e número de bandas entre as espécies, demonstrando que o ITS-2 pode servir de alvo para o desenvolvimento de marcadores para a identificação das espécies de Eimeria de frangos.

Gasser et al. (2001) utilizaram como alvo para a identificação das sete espécies de Eimeria que parasitam galinhas, um único conjunto de iniciadores, “primer WW2 – forward”, marcado com 6-fluoresceina (para o gênero Eimeria) e “primer WW4r – reverse” (para família Eimeriidae), desenhados a partir da região ITS-2. Os produtos da amplificação foram termicamente desnaturados e, submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante, em um sequenciador ABI Prism 377®. Os cromatogramas produzidos foram analisados, por meio de um software. Para a padronização da técnica foram utilizadas amostras de DNA de linhas monoespecíficas, das sete espécies de Eimeria e, assim, definidas as regiões de cromatogramas para a identificação espécie-específica. Os autores observaram uma variação nos cromatogramas relacionada a diferentes cepas, em duas espécies. Esta técnica, também foi utilizada por Gasser et al. (2005), que submeteram amplicons termicamente desnaturados a uma eletroforese em capilar, acoplada em um sequenciador MegaBACE 1000®. Segundo os autores, a eletroforese em capilar elimina a necessidade de géis, possibilitando uma maior agilidade e menor mão de obra para a identificação das sete espécies de Eimeria que parasitam frangos.

Lien et al. (2007) empregaram marcadores da região ITS-2 (primer WW2 - frente e primer WW4r - reverso) para identificar e caracterizar nove cepas representando três espécies de Eimeria (E. acervulina, E. maxima e E. tenella), isoladas a partir de surtos em Taiwan. O produto da PCR foi clonado e sequenciado e, na análise

filogenética, encontraram a menor homologia entre as duas cepas de E. maxima (96.8-98.3%).