A determinação de resíduos de fármacos veterinários em solos é um desafio, devido algumas características do analito e da matriz, tais como, a baixa concentração dos analitos no solo, a complexidade e a variabilidade da matriz e a forte interação de alguns fármacos nas partículas de solo.
A etapa de preparo de amostras é fundamental para a determinação dos fármacos em solo, uma vez que os fármacos podem apresentar uma forte interação com as partículas de solo, exigindo técnicas de extração que forneçam eficiência de extração adequada dos analitos. É no preparo de amostras que a matriz é submetida aos processos de extração, limpeza e concentração dos analitos, com o objetivo de eliminar os concomitantes e/ou interferentes (DMITRIENKO et al., 2014). Devido à complexidade do solo a técnica de preparo de amostras deve ser seletiva para proporcionar um extrato livre de interferentes que possam prejudicar a quantificação dos analitos.
A Tabela I.3 mostra os principais métodos de extração e pré- concentração/clean-up utilizados para a determinação das 7 sulfonamidas utilizadas nesse trabalho. Como pode ser visto na maioria dos trabalhos publicados a etapa de preparo de amostras é dividida em duas etapas: a extração do fármaco do solo e o clean-up do extrato com concentração dos analitos. A escolha das técnicas de extração e clean-up utilizadas dependem da natureza do fármaco, do pKa e da
polaridade da molécula. O desafio e as tendências da etapa de preparo de amostras na determinação de fármacos veterinários em solo incluem alguns fatores, tais como, o aumento na eficiência de extração dos analitos do solo; a redução do efeito matriz; o baixo consumo de reagentes; a repetitividade, a reprodutibilidade, a seletividade da técnica e a automação do sistema.
O uso de técnicas como a extração assistida por ultrassom (UAE – Ultrasonic-Assisted Extraction), a extração por líquido pressurizado (PLE- Pressurized Liquid Extraction) e a extração assistida por micro-ondas (MAE- Microwave-Assisted Extraction) têm sido utilizadas para extração de fármacos em matrizes complexas, como o solo (Tabela I.3). No entanto, muitos destes procedimentos levam a uma coextração de interferentes que inviabilizam a quantificação dos analitos, mesmo quando detectores seletivos como o espectrômetro de massas sequencial é empregado.
Tabela I.3: Técnicas de preparo de amostras utilizadas para a extração das sulfonamidas do solo. Sulfonamida Preparo de amostras Técnica analítica Modo de ionização Modo de quantificação LOQ (ng/g) Referência Extração Quantidade de amostra Técnica Solvente extrator Clean-up Técnica Sorvente Solvente eluição SDZ, SDM, SMZ, SMX e STZ 4 g - LC-MS/MS > 50 Stoob, K. et al.; 2006 PLE ESI +
ACN:H2O com 0.1 mol L-1 Tris, 85:15, v/v SRM
SDZ e SQX
2 g SPE LC-MS/MS
7,2 - 16,0 Chen, L. et al.; 2009
MAE Alumina ESI +
ACN H2O com 0,3% ácido acético MRM
SMX, STZ, SDZ, SMZ, SCP, SDM e SQX - SPE LC-MS/MS - Shelver, W. L. et al.; 2010 SAX-HLB ESI +
MeOH: acetato de etila (50:50, v/v) e MeOH:
H2O com 2,5% NH4OH (50:50, v/v) SRM SQX, SDZ, SDM, SMZ, SMX e STZ 5 g SPE LC-MS/MS 0,08 - 13,98 García-Galán, M. J. et al.; 2013 PLE HLB ESI +
MeOH:H2O, 90:10, v/v MeOH:Acetona com 50 mmol L-1 ácido fórmico SRM
SDZ, SDM, SMX e SQX
1 g SPE
HPLC-UV - Chen, L. et al.; 2010 MAE HLB ACN ACN SQX e SMX 5 g SPE LC-MS/MS 1 Bian, K. et al; 2015 UAE HLB ESI +
SDZ, SMX, SMZ, SQX e SDM 2 g SPE LC-MS/MS 0,49 - 2,58 Huang, Y. et al.; 2013 UAE HLB ESI +
EDTA-SPB com ACN:Mg(NO3)2NH3.H2O, 3:1,
v/v MeOH MRM SDZ, STZ, SMZ e SDM 1 g LC-MS/MS - Balakrishnan, V. K. et al; 2014 MAE - ESI + MeOH MRM STZ, SDZ e SMX 3 g SPE LC-MS/MS - Martinez- Carballo, E. et al.; 2006 UAE C18 ESI + MeOH:EDTA-Tampão McIlvaine, pH 6, 90:10,
v/v H2O e MeOH com 0,01 mol L-1 ácido oxálico MRM
SCP, SDM, SMX e STZ
2 g SPE LC-MS/MS
0,2 - 4,6 Hu, W. et al.; 2011
UAE SAX-HLB ESI +
ACN:EDTA-tampão McIlvaine, pH 3,2, 50:50, v/v MeOH MRM STZ, SDZ, SCP, SMX e SDM 1 g SPE LC-MS/MS - Bialk-Bielinska, A. et al.; 2009
UAE Strata-X ESI +
MeOH MeOH:ACN, 50:50, v/v MRM SMX e SCP 1 g SPE LC-MS/MS - Hu, X. et al.; 2010 UAE HLB ESI +
ACN:EDTA-Tampão McIlvaine, 1:1, v/v MeOH MRM
SDZ, SDM, SMX e STZ 1 g SPE LC-MS/MS - Gao, L. et al.; 2105 UAE HLB ESI +
ACN:EDTA-Tampão McIlvaine, pH 4, 2:1, v/v MeOH com 5% NH4OH MRM
PLE: extração por líquido pressurizado; MAE: extração assistida por micro-ondas; UAE: extração assistida por ultrassom; SPE: extração em fase sólida; ACN: acetonitrila, H2O: água, MeOH: metanol; EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético; HLB: cartuchos a base de polímero
lipofílico-hidrofílico; SAX: cartuchos de troca aniônica; ESI: ionização por electrospray; MRM: monitoramento de reações múltiplas; SRM: monitoramento de reação selecionada.
As técnicas MAE e PLE baseiam-se nos efeitos do aumento da temperatura e da pressão do sistema para melhorar a eficiência da extração, uma vez que, o aumento da temperatura diminui a viscosidade do solvente, aumentando os coeficientes de difusão; já o aumento da pressão favorece a penetração do solvente na matriz (PROSEN, 2014).
A MAE baseia-se no aquecimento da amostra em contato com o solvente extrator pela energia micro-onda em um sistema fechado sob condições controladas de pressão e temperatura. O aumento na temperatura e pressão do sistema faz com que a partição dos analitos da matriz sólida para o solvente seja facilitada, aumentando, assim, a eficiência de extração dos analitos. Os solventes extratores disponíveis para a MAE são aqueles que absorvem energia micro-ondas, ou seja, solventes com dipolo permanente. No entanto, misturas de solventes com e sem dipolo também podem ser utilizados nas extrações. Apesar das altas temperaturas empregadas na MAE auxiliarem na extração dos analitos, muitos interferentes e concomitantes do solo são extraídos juntamente com os analitos, aumentando o efeito matriz, o que prejudica a detectabilidade e/ou seletividade da determinação dos mesmos. Dessa forma, as condições de extração, bem como a escolha do solvente extrator, são fundamentais para o sucesso da análise (SANCHEZ-PRADO et al., 2015).
Na PLE, também chamada de extração acelerada por solvente (ASE – Accelerated Solvent Extraction), a dessorção, a difusão, a solvatação e outros mecanismos de transporte dos analitos para o solvente são controlados pela temperatura e pressão. Enquanto que a temperatura elevada aumenta a solubilidade dos analitos, quebrando as interações matriz-analito e aumentando a taxa de difusão, o aumento na pressão mantém o solvente abaixo do seu ponto de ebulição. Já a viscosidade e tensão superficial do solvente são reduzidas em temperatura e pressão elevada, então ele penetra de forma mais eficiente na amostra sólida, facilitando a extração dos analitos da matriz (VAZQUEZ-ROIG, PABLO; PICÓ, 2015).
Alguns parâmetros devem ser avaliados na otimização da extração por PLE, dentre eles estão: o solvente extrator, a temperatura, a pressão, o tempo da extração, o número de ciclos, a quantidade de amostras, o modo de extração (estático ou dinâmico), o volume do solvente e o tempo de purga. Além disso, a seleção dos
parâmetros adequados para a extração dos fármacos do solo por PLE deve levar em consideração a estabilidade dos compostos em temperaturas altas, a solubilidade dos analitos, a afinidade dos analitos pelo solo e o volume de extrato desejado. A escolha do solvente extrator é um dos principais fatores a ser avaliado, uma vez que esse influencia diretamente o processo de extração. A polaridade do solvente deve ser próxima a polaridade dos analitos e as extrações podem ser realizadas com vários solventes ou com uma mistura de solventes (NIETO et al., 2008). A extração das sulfonamidas do solo tem sido realizada utilizando uma mistura de água e um solvente orgânico (Tabela I.3). Para o processo de clean-up e concentração, o extrato obtido no PLE deve ser seco ou diluído em água para sua posterior extração em fase sólida (SPE) quando são empregados sorventes de fase reversa.
Uma tendência do uso da PLE para a determinação de fármacos veterinários em solo consiste da adição de um material sorvente na cela de extração, ou seja, objetivando a extração e o clean-up em uma única etapa. Tal procedimento tem como propósito minimizar a co-extração de componentes indesejados da matriz (VAZQUEZ-ROIG, P. et al., 2010). Alguns sorventes têm sido utilizados para a determinação desses fármacos, como o óxido de alumínio, sílica gel, Florisil® e areia
lavada com EDTA dissódico (RUNNQVIST et al., 2010). No entanto, apesar do clean- up na cela diminuir a eluição de interferentes a etapa de clean-up por SPE ainda é necessária após a extração.
A extração sólido-líquido (SLE – Solid Liquid Extraction) baseia-se na transferência do analito da matriz para o solvente e é influenciada diretamente pela solubilidade do analito no solvente extrator, pela transferência de massa e pela matriz. A SLE pode ser realizada por: agitação, UAE ou Soxhlet, sendo que as mais importantes para a extração dos fármacos veterinários do solo são as extrações por agitação em vórtex e a UAE.
Na SLE por agitação, a amostra em contato com o solvente extrator apropriado é agitada (manualmente ou em vórtex) por um tempo determinado. Já na UAE a extração se dá pela aplicação da radiação ultrassom na amostra em contato com o solvente. O efeito do ultrassom induz uma maior penetração do solvente na amostra sólida, aumentando a transferência de massa e a eficiência da extração. Apesar da UAE ter um aumento na extração quando comparada as extrações por
agitação ela aumenta o número de interferentes e concomitantes que são extraídos da amostra, necessitando de etapas de clean-up após a extração (TADEO et al., 2012).
A dispersão da matriz em fase sólida (MSPD) tem se mostrado promissora para o preparo, extração e fracionamento de matrizes sólidas. A técnica consiste da dispersão homogênea da matriz em um suporte sólido como sílica, octadecil (C18), octil (C8), Florisil® ou alumina (BARKER, 2007). Os parâmetros como o tipo de
sorvente, o solvente de eluição devem ser avaliados, já que eles afetam diretamente a eficiência da extração (KRISTENSON; BRINKMAN; RAMOS, 2006). Não foram encontrados relatos na literatura utilizando a técnica de MSPD para a determinação de fármacos em solo, no entanto, estudos recentes no nosso grupo de pesquisa mostraram resultados promissores na extração de fármacos veterinários do solo utilizando a dispersão da matriz em fase sólida assistida por potencial elétrico (E- MSPD) (PERUCHI, 2015). A técnica alia os princípios cromatográficos da MSPD tradicional com os mecanismos eletroforéticos gerados pelo potencial elétrico na etapa de extração do analito do solo.
Devido à complexidade da matriz além da extração dos analitos do solo é necessário realizar uma etapa de clean-up que depende da técnica analítica empregada na etapa de quantificação. A extração em fase sólida (SPE) tem sido amplamente utilizada com essa finalidade. Nesta técnica, os analitos são particionados entre a fase sólida e a fase líquida. A escolha do sorvente depende principalmente dos analitos e das suas propriedades físico-químicas e é um parâmetro importante na SPE, uma vez que, ele pode controlar a seletividade, a afinidade e a capacidade da extração dos analitos da fase. Alguns sorventes têm sido utilizados na SPE, dentre eles estão as sílicas com grupos quimicamente ligados (C8 e C18), materiais com troca de íon e materiais poliméricos (PAVLOVIĆ et al., 2007). Os sorventes a base de sílica com grupos C18 quimicamente ligados e materiais poliméricos (HLB) foram amplamente utilizados para o clean-up de sulfonamidas em extratos de solo (CHEN et al., 2009; GARCIA-GALAN; DIAZ-CRUZ; BARCELO, 2013; MARTINEZ-CARBALLO et al., 2007).
A SPE pode ser realizada tanto na forma off-line como on-line a um sistema de detecção. Na SPE tradicional (off-line) a extração é realizada utilizando vácuo ou
pressão positiva em um manifold com cartuchos comerciais. Já as extrações on-line ocorrem em uma coluna de SPE ligada a um cromatógrafo a líquido (LC), ou seja, a extração e separação ocorrem no mesmo método cromatográfico. Com isso, as etapas como evaporação e reconstituição da amostra após o clean-up são eliminadas, diminuindo o tempo de análise, a manipulação da amostra e a incerteza do método. Além disso, a SPE on-line permite injeção de grandes volumes de amostra (em torno de mL), o que aumenta a detectabilidade dos analitos alvos (STOOB et al., 2005).
A extração em fase sólida assistida por potencial elétrico (E-SPE®) é uma
técnica de clean-up recente que tem como objetivo unir os mecanismos cromatográficos da SPE tradicional com os mecanismos eletroforéticos (eletromigração e fluxo eletroosmótico) gerados pela aplicação do potencial elétrico em uma mesma técnica para aumentar a seletividade da extração dos analitos de interesse em relação aos concomitantes da matriz (ORLANDO; RATH, 2009). A eficiência da E-SPE® foi demonstrada por meio da determinação de antimicrobianos
em leite (ORLANDO; ROHWEDDER; RATH, 2013) e resíduos de sulfonamidas e fluoroquinolonas em ovos (RIBEIRO, 2014).
Tendo em vista que os antimicrobianos veterinários se encontram no solo em concentrações na ordem de ng g-1 a pg g-1, que são compostos de caráter polar e
que a matriz é complexa, a técnica mais recomendada para a sua quantificação é a cromatografia líquida associada a espectrometria de massas sequencial.
A cromatografia líquida associada a espectrometria de massas sequencial tem sido amplamente utilizada para a determinação das sulfonamidas em amostras de solo (STOOB et al., 2006; SHELVER et al., 2010; BIAN et al., 2015). A interface entre o cromatógrafo a líquido e o espectrômetro de massas ocorre na fonte de ionização. Nesta etapa os analitos que foram separados na coluna cromatográfica são convertidos em íons na fase gasosa para serem analisados pelo espectrômetro. A ionização pode ocorrer tanto no modo positivo quanto negativo, dependendo das características do analito de interesse e, em geral, ocorre pela ejeção ou captura de elétrons, formando espécies conhecidas como íon molecular; ou pela protonação ou desprotonação, levando a formação de moléculas protonadas ou desprotonadas. A fonte de ionização mais utilizada para a análise de fármacos de uso veterinário é a
ionização por eletronebulização (ESI – Electrospray ionization) (LÓPES-SERNA et al., 2011; VAZQUEZ-ROIG et al., 2010).
Os tipos de analisadores de massas dependem dos objetivos a serem alcançados pela análise, bem como da detectabilidade e seletividade requerida. Os analisadores podem ser simples como um quadrupolo ou combinados. Para a análise de resíduos de fármacos de uso veterinário tem sido utilizado o espectrômetro de massas sequencial do tipo triplo quadrupolo (QqQ) (CHEN et al., 2009; BOURDAT- DESCHAMPS et al., 2014).
Embora o detector de massas seja seletivo, existe o desafio de minimizar o efeito matriz, que de modo geral pode suprimir o sinal e, consequente, prejudicar a detectabilidade.
O objetivo geral deste trabalho foi avaliar diferentes preparos de amostras visando à determinação de resíduos de sulfonamidas em diferentes tipos de solos característicos do Estado de São Paulo (textura arenosa e argilosa).
Os objetivos específicos compreenderam:
Avaliação de diferentes preparos de amostras como: dispersão da matriz em fase sólida assistida por potencial elétrico (E-MSPD) e extração por solvente seguida de extração em fase sólida.
Desenvolvimento de método para a determinação de resíduos de sulfonamidas por UHPLC-MS/MS, usando SPE off-line e on-line como estratégias no clean- up e concentração dos analitos.
Validação de um método para a determinação de sulfonamidas em solos característicos do estado de São Paulo.