UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
NATÁLIA FERNANDA TETZNER
TÉCNICAS DE PREPARO DE AMOSTRAS PARA A DETERMINAÇÃO DE SULFONAMIDAS EM SOLOS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ULTRA-ALTA EFICIÊNCIA - ESPECTROMETRIA DE MASSAS SEQUENCIAL
CAMPINAS 2016
NATÁLIA FERNANDA TETZNER
TÉCNICAS DE PREPARO DE AMOSTRAS PARA A DETERMINAÇÃO DE SULFONAMIDAS EM SOLOS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ULTRA-ALTA EFICIÊNCIA - ESPECTROMETRIA DE MASSAS SEQUENCIAL
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Química na área de Química Analítica
Orientadora: Profa. Dra. Susanne Rath
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA NATÁLIA FERNANDA TETZNER, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. SUSANNE RATH.
CAMPINAS 2016
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Profa Dra Susanne Rath, pela orientação, amizade e por todo aprendizado. É um privilégio ser sua aluna, à ela, meu agradecimento e admiração.
Aos professores que, gentilmente, aceitaram participar da banca de defesa de mestrado: Isabel Cristina Sales Fontes Jardim, Sérgio Henrique Monteiro, Carla Beatriz Grespan Bottoli e Sonia Cláudia do Nascimento de Queiroz.
Ao meu pai Ademir e a Marisa por todo amor, apoio, carinho, paciência e por nunca me deixarem desistir dos meus sonhos.
À minha família, em especial a minhas primas Bruna, Karina e Lariene e ao meu pequeno Emanuel.
Aos colegas, companheiros e amigos do grupo Paracelsus que contribuíram de forma direta ou indireta no desenvolvimento deste trabalho.
À Tamires, Andreza, Monica e Zuzana pelo companheirismo, amizade, conselhos, risadas e pelas contribuições durante o desenvolvimento deste trabalho.
À Milena pelo apoio, paciência, conversas e ajuda no decorrer deste trabalho.
À Lívia, Cyntia e ao Ricardo pela ajuda, explicações e ideias para a o sistema E-MSPD.
Às minhas amigas Gabriela e Lia e ao meu amigo Fábio pela amizade e por sempre estarem presentes de alguma forma em minha vida.
À UNICAMP em especial ao Instituto de Química pela infra-estrutura disponibilizada para a realização deste trabalho.
À CAPES pela bolsa de estudos concedida.
À todas as pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.
RESUMO
As sulfonamidas são antimicrobianos amplamente empregadas na medicina veterinária e sua presença tem sido observada em matrizes ambientais, como no solo. Devido à complexidade da matriz e às baixas concentrações das drogas veterinárias no solo (pg g-1 a ng g-1) a etapa de preparo de amostras é fundamental para a
subsequente quantificação. O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes preparos de amostras visando à determinação de resíduos de sulfonamidas (sulfadiazina, sulfatiazol, sulfametazina, sulfametoxazol, sulfadimetoxina e sulfaquinoxalina) em solos por cromatografia líquida de ultra-alta eficiência associada a espectrometria de massas sequencial (UHPLC-MS/MS). As técnicas avaliadas para o preparo de amostra foram: dispersão da matriz em fase sólida assistida por potencial elétrico (E-MSPD) seguida por clean-up com extração em fase sólida (SPE), extração sólido-líquido (SLE) seguida por clean-up por SPE off-line e SLE seguida de SPE-UHPLC-MS/MS. O último preparo de amostras foi o que apresentou melhores resultados de eficiência de extração e clean-up e por isso foi empregado para o desenvolvimento de um método para a determinação de sulfonamidas em solos. As condições ótimas foram: extração de 2 g de solo com 10 mL de água:acetonitrila 1:1 (v/v) e clean-up/concentração dos analitos utilizando sorvente da coluna SPE Oasis HLB (Waters), volume de injeção da amostra de 200 µL (dissolvida em água), eluição com a fase móvel água:metanol ambos com 0,1% ácido fórmico e coluna analítica Acquity UPLC BEH C18 (2,1 x 50 mm, 1,7 µm; Waters). A quantificação no modo monitoramento de reação selecionada (SRM) foi realizada por curva analítica na matriz branca de solo, usando a sulfacloropiridazina como padrão interno. A fonte de eletronebulização foi operada no modo positivo. O método foi validado para dois tipos de solos (LVe, argiloso e RQo, arenoso), tendo sido estabelecidos os seguintes parâmetros: faixa linear de 0,5 a 12,5 ng g-1, com linearidade (r) > 0,99; precisão intra- e inter-dias de
4,6 a 14,3%; exatidão de 92,5 a 111,9% e limite de quantificação de 0,5 ng g-1 para
ABSTRACT
Sulfonamides are antimicrobials widely used as veterinary drugs and residues have been detected in environmental samples, such as soils. Due to the complex soil matrix and low concentration of veterinary drugs in soil (pg g-1 to ng g-1), sample
preparation is fundamental prior quantitation. The aim of this work was to evaluate different sample preparation procedures in order to determine residues of sulfonamides (sulfadiazine, sulfathiazole, sulfamethazine, sulfamethoxazole, sulfadimethoxine, sulfaquinoxaline) in soils, using ultra-high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS). The sample preparation techniques evaluated were: electric field assisted matrix solid phase dispersion (E-MSPD) followed by solid phase extraction (SPE), solid-liquid extraction (SLE) followed by SPE off-line and SLE followed by SPE on-line to UHPLC-MS/MS. The last technique showed advantages regarding extraction efficiency and clean-up and was therefore used for the development of an analytical method for the determination of residues of sulfonamides in soil. The optima conditions were: extraction of 2 g of soil with 10 mL of water:acetonitrile, 1:1, v/v and clean-up on SPE sorbent Oasis HLB, sample injection volume of 200 µL (sample dissolved in water), analyte elution with mobile phase (water:methanol 40:60 v/v with 0.1% formic acid), and analytical column Acquity UPLC BEH C18 (2,1 x 50 mm, 1,7 µm; Waters). Quantitation was performed in selected reaction monitoring (SRM) mode using a matrix-matched calibration curve and sulfachloropyridazine as internal standard. The electrospray ionization source was operated in positive mode. The developed method was validated for two soils (LVe, clay and RQo, sandy) and the following parameters were determined: linear range of 0.5 a 12.5 ng g-1,linearity (r) > 0.99; intra-day and inter-day precisions in the
range of 4.6 to 14.3%, accuracy in the range 92.5 to 111.9 % and limit of quantitation of 0.5 ng g-1 for all sulfonamides.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
No Descrição Página
I.1 Porcentagem de cada classe terapêutica dos fármacos veterinários administrados no Brasil entre os anos de 2008 e 2014 (SINDAN, 2015).
22
I.2 Equilíbrio de dissociação das sulfonamidas. 23
I.3 Número de medicamentos veterinários à base de sulfonamidas comercializados no Brasil e registradas no SINDAN (SINDAN, 2015).
26
I.4 Triângulo textural do solo de acordo com as porcentagens de areia, silte e argila. Adaptado de (IBGE, 2007).
31
I.5 Mapa pedológico do Estado de São Paulo elaborado por tratamento dos dados em programa ARC-GIS, com a colaboração do Dr. Adelsom Soares Filho, do Instituto de Geociências da Unicamp.
32
III.1 Esquema do sistema utilizado para as extrações E-MSPD. Adaptado de Orlando, R.M. et al., (2014).
49
III.2 Montagem dos cartuchos de E-MSPD. 49
III.3 Esquema da extração por E-MSPD. 50
III.4 Esquema do clean-up por E-SPE. 52
III.5 Esquema do clean-up por SPE. 53
III.6 Esquema da extração por SLE. 54
III.7 Esquema do posicionamento das válvulas do sistema SPE on-line para o carregamento e eluição dos analitos nas colunas de SPE e analítica.
IV.1 Cromatograma característico das sulfonamidas: 1) SDZ, 2) STZ, 3) SMZ, 4) SMX, 5) SDM e 6) SQX, todas na concentração de 2000 ng mL-1. Condições cromatográficas:
Fase estacionária: XBrigdeTM. Fase móvel: FA- água com
0,1% ácido fórmico, FO- metanol com 0,1% de ácido fórmico. Eluição por gradiente – FA:FO (v/v) 90:10 - 62:38 → 0 - 10 min; 62:38 → 10 a 14 min; 62:38 - 90:10 → 15 - 20 min; 90:10 → 20 - 25 min . Vazão 1 mL min-1. Volume de
injeção: 20 μL. Temperatura da coluna: 40 oC. Detecção em
DAD no comprimento de onda de 270nm.
64
IV.2 Cromatogramas SRM das sulfonamidas: SDZ, STZ, SMZ, SMX, SDM e SQX, todas na concentração de 800 ng mL-1. Condições cromatográficas: Fase estacionária: ACQUITY UPLC BEH C18 (50 x 3,0 mm,1,7 μm). Fase móvel: FA- água com 0,1% ácido fórmico, FO- metanol com 0,1% de ácido fórmico. Eluição por gradiente – FA:FO (v/v) 90:10 - 62:38 → 0,0 -1,52 min; 62:38 → 1,62 - 2,43 min; 62:38 - 90:10 → 2,43 - 3,24; 90:10 → 3,24 – 4,0 min. Vazão 0,43 mL min-1. Volume
de injeção: 2 μL. Temperatura da coluna: 40 oC.
66
IV.3 Cromatogramas de solo branco e solo fortificado com sulfonamidas: 1) SDZ, 2) STZ, 3) SMZ, 4) SMX, 5) SDM e 6) SQX a uma concentração de 500 ng g-1. Condições cromatográficas: fase estacionária: XBrigdeTM. Fase móvel: FA- água com 0,1% ácido fórmico, FO- metanol com 0,1% de ácido fórmico. Eluição por gradiente – FA:FO (v/v) 90:10 - 62:38 → 0 - 10 min; 62:38 → 10 a 14 min; 62:38 - 90:10 (v/v) → 15 - 20 min; 90:10 → 20 - 25 min. Vazão 1 mL min-1.
Volume de injeção: 20 μL. Temperatura da coluna: 40 oC.
Detecção no comprimento de onda de 270 nm.
68
IV.4 Etapas do método a ser desenvolvido e técnicas empregadas para a determinação das sulfonamidas em solo.
69
IV.5 Valores de eficiência de extração da SDZ, STZ, SMZ, SMX, SDM e SQX; obtidos pela extração dos analitos do solo LVe por MSPD seguida de dois tipos diferentes de clean-up: E-SPE e E-SPE. Fortificação do solo: 500 ng g-1. Condições
cromatográficas utilizando UHPLC-MS/MS: coluna ACQUITY UPLC BEH C18 (50 x 3,0 mm,1,7 μm), fase móvel: FA- água com 0,1% ácido fórmico, FO- metanol com
0,1% de ácido fórmico, eluição por gradiente – FA:FO (v/v) 90:10 - 62:38 → 0,0 -1,52 min; 62:38 → 1,62 - 2,43 min; 62:38 - 90:10 → 2,43 - 3,24; 90:10 → 3,24 – 4,0 min. Vazão 0,43 mL min-1. Volume de injeção: 2 μL. Temperatura da
coluna: 40 oC.
IV.6 Valores de recuperação da SDZ, STZ, SMZ, SMX, SDM e SQX obtidos pela extração dos analitos em concentração de 500 ng g-1 do solo LVe por E-MSPD seguida pelo clean-up
por SPE, utilizando como solução de extração da E-MSPD: ACF:ACN na proporção 1:1, v/v ou ACF:ACN na proporção 1:2, v/v. Condições cromatográficas no UHPLC-MS/MS: coluna ACQUITY UPLC BEH C18 (50 x 3,0 mm,1,7 μm); fase móvel: FA- água com 0,1% ácido fórmico, FO- metanol com 0,1% de ácido fórmico; eluição por gradiente – FA:FO (v/v) 90:10 - 62:38 → 0,0 -1,52 min; 62:38 → 1,62 - 2,43 min; 62:38 - 90:10 → 2,43 - 3,24; 90:10 → 3,24 – 4,0 min; vazão 0,43 mL min-1; volume de injeção: 2 μL; temperatura da
coluna: 40 oC. ACF– tampão ácido cítrico/ fosfato bibasico
de sódio.
72
IV.7 Valores de recuperação da SDZ, STZ, SMZ, SMX, SDM e SQX obtidos pela extração dos analitos em concentração de 500 ng g-1 do solo LVe por SLE seguida de clean-up por SPE
utilizando diferentes soluções extratoras na etapa de extração MeOH, ACN e H2O:ACN na proporção 1:1, v/v.
Condições cromatográficas no UHPLC-MS/MS: coluna ACQUITY UPLC BEH C18 (50 x 3,0 mm,1,7 μm); fase móvel: FA- água com 0,1% ácido fórmico, FO- metanol com 0,1% de ácido fórmico; eluição por gradiente- FA:FO (v/v) 90:10 - 62:38 → 0,0 -1,52 min; 62:38 → 1,62 - 2,43 min; 62:38 - 90:10 → 2,43 - 3,24; 90:10 → 3,24 – 4,0 min; vazão 0,43 mL min-1; volume de injeção: 2 μL; temperatura da
coluna: 40 oC.
73
IV.8 Valores de recuperação da SDZ, STZ, SMZ, SMX, SDM e SQX obtidos pela extração dos analitos em concentração de 500 ng g-1 do solo LVe por SLE seguida de clean-up por SPE
utilizando diferentes soluções extratoras na etapa de extração: H2O:ACN, tampão McIlvaine pH4:ACN, tampão
McIlvaine pH7:ACN todos na proporção 1:1, v/v. Condições cromatográficas no UHPLC-MS/MS: coluna ACQUITY UPLC BEH C18 (50 x 3,0 mm,1,7 μm); fase móvel: FA- água com 0,1% ácido fórmico, FO- metanol com 0,1% de ácido fórmico; eluição por gradiente- FA:FO (v/v) 90:10 - 62:38 →
0,0 -1,52 min; 62:38 → 1,62 - 2,43 min; 62:38 - 90:10 → 2,43 - 3,24; 90:10 → 3,24 – 4,0 min; vazão 0,43 mL min-1; volume
de injeção: 2 μL; temperatura da coluna: 40 oC.
IV.9 Etapas do processo de extração e clean-up com detalhe das etapas de fortificação do solo e do extrato.
75
IV.10 Gráfico da recuperação das sulfonamidas do solo na extração (SLE), na extração seguida de clean-up (SLE + SPE) e no clean-up (SPE) utilizando diferentes soluções de extração: H2O:ACN, tampão McIlvaine pH4:ACN, tampão
McIlvaine pH7:ACN todos na proporção 1:1, v/v para (a) a sulfadiazina e (b) a sulfaquinoxalina. Fortificação: 500 ng g -1. Condições cromatográficas no UHPLC-MS/MS: coluna
ACQUITY UPLC BEH C18 (50 x 3,0 mm,1,7 μm); fase móvel: FA- água com 0,1% ácido fórmico, FO- metanol com 0,1% de ácido fórmico; eluição por gradiente - FA:FO (v/v) 90:10 - 62:38 → 0,0 -1,52 min; 62:38 → 1,62 - 2,43 min; 62:38 - 90:10 → 2,43 - 3,24; 90:10 → 3,24 – 4,0 min; vazão 0,43 mL min-1; volume de injeção: 2 μL; temperatura da
coluna: 40 oC.
76
IV.11 Gráfico do efeito matriz na extração das sulfonamidas do solo pela técnica de SLE seguida de clean-up por SPE utilizando diferentes solventes de extração: H2O:ACN,
tampão McIlvaine pH4:ACN, tampão McIlvaine pH7:ACN todos na na proporção 1:1, v/v. Fortificação: 500 ng g-1.
Condições cromatográficas no UHPLC-MS/MS: coluna ACQUITY UPLC BEH C18 (50 x 3,0 mm,1,7 μm); fase móvel: FA- água com 0,1% ácido fórmico, FO- metanol com 0,1% de ácido fórmico; eluição por gradiente FA:FO (v/v) 90:10 - 62:38 → 0,0 -1,52 min; 62:38 → 1,62 - 2,43 min; 62:38 - 90:10 → 2,43 - 3,24; 90:10 → 3,24 – 4,0 min; vazão 0,43 mL min-1; volume de injeção: 2 μL; temperatura da
coluna: 40 oC.
77
IV.12 Área dos picos cromatográficos das sulfonamidas obtidas com SPE-UHPLC-MS/MS usando dois tipos de sorventes: XBridge C8 e Oasis HLB. Condições do SPE: água como solvente de carregamento, injeção de 200 µL do extrato de solo fortificado com cada sulfonamida na concentração 12 ng mL-1 e sulfacloropiridazina 10 mg mL-1. A eluição foi feita
com água:metanol ambos com 0,1% ácido fórmico (40:60, v/v).Coluna analítica ACQUITY UPLCBEH C18.
IV.13 Curva no extrato para as sulfonamidas sulfadiazina (SDZ) e sulfatiazol (STZ) obtidas com SPE-UHPLC-MS/MS usando dois tipos de sorventes: XBridge C8 e Oasis HLB. Condições do SPE: água como solvente de carregamento, injeção de 200 µL do extrato de solo fortificado com cada sulfonamida na concentração 12 ng mL-1 e sulfacloropiridazina 10 mg mL -1. A eluição foi feita com água:metanol ambos com 0,1%
ácido fórmico (40:60, v/v).
80
IV.14 Área dos picos cromatográficos das sulfonamidas obtidas com SPE-UHPLC-MS/MS usando diferentes volumes de lavagem do sorvente: 0,19; 0,43 e 0,66 mL. Condições do SPE: coluna de SPE Oasis HLB, água como solvente de carregamento, injeção de 200 µL do extrato de solo fortificado com cada sulfonamida na concentração 12 ng mL -1 e sulfacloropiridazina 10 mg mL-1. A eluição foi feita com
água:metanol ambos com 0,1% ácido fórmico (40:60, v/v).Análises realizadas em triplicata.
81
IV.15 Área dos picos cromatográficos das sulfonamidas obtidas com SPE-UHPLC-MS/MS usando diferentes proporções do solvente de carregamento (água:metanol): 100:0; 99:1; 95:5; 90:10 e 80:20. Condições do SPE: coluna de SPE Oasis HLB, injeção de 200 µL do extrato de solo fortificado com cada sulfonamida na concentração 12 ng mL-1 e
sulfacloropiridazina 10 mg mL-1. A eluição foi feita com
água:metanol ambos com 0,1% ácido fórmico (40:60, v/v). Análises realizadas em triplicata.
82
IV.16 Cromatogramas SRM da sulfaquinoxalina (SQX) com diferentes proporções do solvente de carregamento (água:metanol, v/v): (a) 100:0, (b) 99:1 e (c) 95:5 (d) 90:10 e (e) 80:20.
83
IV.17 Área dos picos cromatográficos das sulfonamidas obtidas com SPE-UHPLC-MS/MS usando diferentes volumes de injeção: 100 µL, 150 µL, 200 µL, 2 x 150 µL e 2 x 200 µL. Condições do SPE: coluna de SPE Oasis HLB, água como solvente de carregamento, injeção de 200 µL do extrato de solo fortificado com cada sulfonamida na concentração 12 ng mL-1 e sulfacloropiridazina 10 mg mL-1. A eluição foi feita
com água:metanol ambos com 0,1% ácido fórmico (40:60, v/v). Análises realizadas em triplicata.
IV.18 Cromatogramas SRM das sulfonamidas (SDZ, STZ, SMZ, SMX, SDM e SQX) da injeção de metanol após a injeção da amostra obtidos com SPE-UHPLC-MS/MS. Condições do SPE: coluna de SPE Oasis HLB, água como solvente de carregamento, injeção de 200 µL do extrato de solo fortificado com cada sulfonamida na concentração 12 ng mL -1 e sulfacloropiridazina 10 mg mL-1. A eluição foi feita com
água:metanol ambos com 0,1% ácido fórmico (40:60, v/v).
85
IV.19 Cromatogramas SRM da sulfaquinoxalina (SQX) com diferentes proporções da fase móvel (água com 0,1% de ácido fórmico: metanol com 0,1 % de ácido fórmico, v/v) para a dessorção da SQX para a coluna analítica: (a) 60:40, (b) 50:50 e (c) 40:60.
86
IV.20 Cromatograma SRM para sulfadiazina (SDZ), sulfatiazol (STZ), sulfametazina (SMZ), sulfametoxazol (SMX), sulfadimetoxina (SDM) e sulfaquinoxalina (SQX) extraídas do solo LVe por SLE e clean-up por SPE-UHPLC-MS/MS. Condições do SPE: coluna de SPE Oasis HLB, água como solvente de carregamento, injeção de 200 µL do extrato de solo fortificado com cada sulfonamida na concentração 12 ng mL-1 e sulfacloropiridazina 10 mg mL-1. A eluição foi feita
com água:metanol ambos com 0,1% ácido fórmico (40:60, v/v).
87
IV.21 Estabilidade da sulfadiazina (SDZ), sulfatiazol (STZ), sulfametazina (SMZ), sulfametoxazol (SMX) sulfadimetoxina (SDM) e sulfaquinoxalina (SQX) no solo LVe. O solo foi mantido em temperatura ambiente e as sulfonamidas foram extraídas do solo pela técnica SLE após 12, 36 e 60 horas da fortificação do solo. “Média” corresponde a média dos valores medidos, “2S” corresponde à média ± 2 vezes o desvio padrão e “3S” corresponde à média ± 3 vezes o desvio padrão.
89
IV.22 Estabilidade da sulfadiazina (SDZ), sulfatiazol (STZ), sulfametazina (SMZ), sulfametoxazol (SMX) sulfadimetoxina (SDM) e sulfaquinoxalina (SQX) no solo RQo. O solo foi mantido em temperatura ambiente e as sulfonamidas foram extraídas do solo pela técnica SLE após 12, 36 e 60 horas da fortificação do solo. “Média” corresponde a média dos valores medidos, “2S” corresponde à média ± 2 vezes a
estimativa do desvio padrão e “3S” corresponde à média ± 3 vezes a estimativa do desvio padrão.
IV.23 Curvas analíticas preparadas no solvente (água:metanol + 0,1% ácido fórmico 80:20, v/v) e no extrato de solo LVe fortificado antes da etapa de clean-up on-line ao UHPLC-MS/MS.
93
IV.24 Curvas analíticas preparadas no solvente (água:metanol + 0,1% ácido fórmico 80:20, v/v) e no extrato de solo RQo fortificado antes da etapa de clean-up on-line ao UHPLC-MS/MS.
94
IV.25 Curvas analíticas e os respectivos gráficos de resíduos obtidos para as sulfonamidas: sulfadiazina (SDZ), sulfatiazol (STZ), sulfametazina (SMZ), sulfametoxazol (SMX), sulfadimetoxina (SDM) e sulfaquinoxalina (SQX) no solo LVe.
97
IV.26 Curvas analíticas e os respectivos gráficos de resíduos obtidos para as sulfonamidas: sulfadiazina (SDZ), sulfatiazol (STZ), sulfametazina (SMZ), sulfametoxazol (SMX), sulfadimetoxina (SDM) e sulfaquinoxalina (SQX) no solo RQo.
LISTA DE TABELAS
No Descrição Página
I.1 Estruturas e propriedades físico-químicas das sulfonamidas.
24
I.2 Ocorrência das sulfonamidas em solo. 28
I.3 Técnicas de preparo de amostras utilizadas para a extração das sulfonamidas do solo.
34
III.1 Propriedades físico-químicas dos solos RQo e LVe. 46
III.2 Etapas do SPE on-line: gradiente utilizado nas bombas binária e quaternária durante a injeção da amostra, eluição da coluna de SPE e etapas de lavagem e condicionamento da coluna. Vazão bomba quaternária: 0,95 mL min-1, vazão
bomba binária: 0,43 mL min-1.
56
IV.1 Condições do MS/MS para as sulfonamidas. 65
IV.2 Valores do efeito matriz para as sulfonamidas no solo LVe e RQo.
91
IV.3 Resultados dos parâmetros de validação do método de determinação das sulfonamidas no solo: faixa linear, sensibilidade, coeficiente de correlação e limite de quantificação (LQ).
96
IV.4 Valores de desvio padrão relativo (RSD, %) para a precisão intra-dia (n =6) e precisão inter-dia (n =12) para as sulfonamidas.
101
IV.5 Valores de exatidão (recuperação) para as sulfonamidas extraídas do solo.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACF Tampão ácido cítrico/ fosfato bibásico de sódio
ACN Acetonitrila As Fator de assimetria AV Antimicrobianos veterinários BB Bomba binária BQ Bomba quaternária CV Coeficiente de variação
DAD Detector por arranjo de fotodiodos
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EM Efeito matriz
EMA Agência Europeia de Medicamentos (European Medicines Agency)
E-MSPD Dispersão da matriz em fase sólida assistida por potencial elétrico
ESI Ionização por eletronebulização (Electrospray Ionization)
E-SPE® Extração em fase sólida assistida por potencial elétrico
FA Fase aquosa FD Detector de fluorescência FM Fase móvel FO Fase orgânica FV Fármacos veterinários H2O Água
HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência
k Fator de retenção
Koc Coeficiente de partição normalizado pelo carbono orgânico
Kow Coeficiente de partição octanol-água
LC Cromatografia líquida
LOQ Limite de quantificação
LVe Latossolo Vermelho eutrófico
MAE Extração assistida por micro-ondas (Microwave-Assisted Extraction)
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
MeOH Metanol
MMQO Método dos mínimos quadrados ordinários
MS Espectrometria de massas (Mass Spectometry)
MS/MS Espectrometria de massas sequencial (Tandem Mass Spectometry)
MSPD Dispersão da matriz em fase sólida (Matrix Solid Phase Dispersion)
N Número de pratos
pKa Constante de dissociação ácido-base
PLE Extração por Fluido Pressurizado (Pressurized Liquid Extraction)
RQo Neossolo Quartzarênico óptico
Rs Resolução
RSD Estimativa do desvio padrão relativo (Relative Standard Deviation)
SAX Fase sólida de troca aniônica
SDM Sulfadimetoxina
SDZ Sulfadiazina
SINDAN Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para a Saúde Animal
SLE Extração Sólido Líquido (Solid-Liquid Extraction)
SMX Sulfametoxazol
SMZ Sulfametazina
SPE Extração em fase sólida (Solid Phase Extraction)
SPE-UHPLC-MS/MS
SPE on-line ao sistema de cromatografia líquida de ultra-alta eficiência associada a espectrometria de massas sequencial
SQX Sulfaquinoxalina
SRM Monitoramento de reação selecionada (Selected Reaction Monitoring)
STZ Sulfatiazol
THF Tetraidrofurano
TQD Triplo quadrupolo
UAE Extração Assistida por Ultrassom (Ultrasonic-Assisted Extraction)
UHPLC Cromatografia líquida de ultra-alta eficiência
UV Ultravioleta
SÚMÁRIO
I – INTRODUÇÃO ... 21
I.1 Fármacos veterinários ... 22
I.2 Sulfonamidas ... 23
I.3 Antimicrobianos e o ambiente ... 26
I.4 Solo e suas características ... 29
I.5 Determinação de fármacos veterinários em solo ... 32
II – OBJETIVOS ... 41
III – PARTE EXPERIMENTAL ... 43
III.1 Padrões analíticos, reagentes e solventes ... 44
III.2 Materiais para cromatografia... 44
III.1 Equipamentos ... 45
III.4 Amostras de solo ... 46
III.3.2 Métodos ... 46
III.5.1 Preparo das soluções ... 46
III.5.2 Otimização dos métodos cromatográficos para a determinação das sulfonamidas ... 47
III.5.3 Dispersão da matriz em fase sólida assistida por potencial elétrico (E-MSPD) 48 III.5.4 Extração Sólido-Líquido (SLE) ... 54
III.5.5 SPE on-line acoplado ao UHPLC-MS/MS ... 55
III.5.6 Validação do método ... 58
IV – RESULTADOS E DISCUSSÃO... 62
IV.1 Otimização do método analítico para a determinação de sulfonamidas por HPLC-DAD ... 63
IV.2 Desenvolvimento do método analítico para a determinação de sulfonamidas por UHPLC-MS/MS ... 64
IV.3 Dispersão da matriz em fase sólida assistida por potencial elétrico (E-MSPD) ... 67
IV.3.1 Teste de eficiência de extração da técnica E-MSPD na extração de sulfonamidas do solo ... 67
IV.3.2 Otimização das condições de extração das sulfonamidas por E-MSPD e clean-up dos extratos por SPE ou E-SPE ... 69
IV.4 Extração sólido-líquido (SLE) seguida de clean-up por SPE off-line ... 73
IV.5 Otimização de método para a quantificação de sulfonamidas em solo por SPE-UHPLC-MS/MS ... 78
IV.6 Validação do método desenvolvido ... 87
IV.6.1 Estabilidade do analito na matriz ... 88
IV.6.2 Efeito matriz ... 91
IV.6.3 Faixa linear, linearidade e limite de quantificação... 95
IV.6.4 Precisão ... 100
IV.6.5 Exatidão ... 101
V – CONCLUSÕES... 103
I.1 Fármacos veterinários
Os fármacos veterinários têm sido amplamente utilizados na criação animal para tratar e/ou prevenir doenças. O uso de fármacos vem possibilitando o aumento na produção pecuária devido a uma maior eficiência do manejo dos animais. Segundo o Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento do Brasil (MAPA) o faturamento do mercado de medicamentos veterinários no ano de 2014 foi de aproximadamente 4,5 bilhões de reais (MAPA, 2015).
O Brasil é um dos maiores produtores de proteína animal e a produção vêm crescendo a cada ano. Segundo o MAPA a expectativa é que a produção nacional irá suprir 44,5% do mercado mundial em 2020, com a carne de frango representando 48,1% do mercado mundial seguida pelas produções de carne bovina (44,1%) e de carne suína (14,2%) (MAPA, 2015).
Os fármacos veterinários são administrados principalmente em ruminantes, aves, suínos, equinos e peixes. Várias classes terapêuticas têm sido empregadas no manejo desses animais, dentre elas estão os agentes biológicos, antiparasitários, antimicrobianos, terapêuticos, suplementos, entre outros. A Figura I.1 mostra as porcentagens de cada classe terapêutica dos fármacos veterinários administrada nos animais no Brasil entre os anos de 2008 e 2014.
Figura I.1: Porcentagem de cada classe terapêutica dos fármacos veterinários administrados no Brasil entre os anos de 2008 e 2014 (SINDAN, 2015).
Dentre os fármacos veterinários a classe dos antimicrobianos tem recebido especial atenção, uma vez que o amplo uso tem levado a resistência bacteriana.
0 20 40 60 80 100 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 33 31 30 28 26 27 27 24 24 25 25 24 25 22 19 19 18 18 18 17 17 8 8 9 10 10 10 11 5 5 10 11 12 12 13 11 13 7 8 9 9 10 Por ce n tagem
Biológicos Antiparasitários Antimicrobianos Terapêuticos Suplementos Outros
Os antimicrobianos são agentes quimioterápicos que inibem ou suprimem o crescimento de micro-organismos, como bactérias, fungos e protozoários. Eles têm sido utilizados para fins terapêuticos, profiláticos e metafiláticos. As principais subclasses de antimicrobianos empregados na saúde animal são sulfonamidas, fluoroquinolonas, aminoglicosídeos, anfenicóis, macrolídeos e tetraciclinas (KEMPER, 2008).
I.2 Sulfonamidas
As sulfonamidas são antimicrobianos sintéticos de amplo espectro utilizados para o tratamento de infecções, causadas por bactérias gram-positivas e gram-negativas (ACCINELLI et al., 2006). Elas têm como precursor a sulfanilamida (p-aminobenzenosulfonamida) e constituem a classe dos antimicrobianos sintéticos mais antigos que tem sido utilizada para o tratamento de doenças em humanos e animais (DMITRIENKO et al., 2014).
As sulfonamidas são compostos anfotéricos que apresentam dois valores de pKa (Figura I.2). O primeiro pKa1 (de 1 a 3) está relacionado a protonação do grupo
amino ligado ao anel benzeno e o segundo pKa2 (de 5 a 8) está relacionado a
desprotonação do grupo sulfonamida (DMITRIENKO et al., 2014). As estruturas químicas e as propriedades físico químicas das sulfonamidas, objeto de estudo deste trabalho, são apresentadas na Tabela I.1.
Figura I.2: Equilíbrio de dissociação das sulfonamidas.
As sulfonamidas são utilizadas para o tratamento e/ou prevenção de algumas patologias em animais, tais como infecções intestinais, respiratórias e urinárias, artrites, mastites, entre outras. Sabe-se que as propriedades farmacocinéticas dos antimicrobianos dependem das propriedades físico-químicas da
substância administrada, do modo de aplicação, da espécie animal e do tempo de tratamento. As sulfonamidas têm sido administradas principalmente em aves, bovinos, equinos, caprinos, cães e gatos.
Tabela I.1: Estruturas e propriedades físico-químicas das sulfonamidas.
Sulfonamida Propriedades físico-químicas
Sulfadiazina (SDZ) Fórmula Molecular: C10H10N4O2S
Massa molar (g mol-1): 250,3
pKa1/pKa2: 1,6/ 6,5
Solubilidade em água (mg L-1): 77 Kow: 0,81
Sulfatiazol (STZ) Fórmula Molecular: C9H9N3O2S2
Massa molar (g mol-1): 255,3 pKa1/pKa2: 2,4/ 7,1
Solubilidade em água (mg L-1): 373
Kow: 1,12
Sulfacloropiridazina (SCP) Fórmula Molecular: C10H9ClN4O2S
Massa molar (g mol-1): 284,7 pKa1/pKa2: 2,2/ 6,6
Solubilidade em água (mg L-1): 8235 Kow: 2,04
Sulfametazina (SMZ) Fórmula Molecular: C12H14N4O2S
Massa molar (g mol-1): 278,3 pKa1/pKa2: 2,8/ 7,6
Solubilidade em água (mg L-1): 1500 Kow: 6,3
Sulfametoxazol (SMX) Fórmula Molecular: C10H11N3O3S
Massa molar (g mol-1): 253,3 pKa1/pKa2: 1,6/ 6,4
Solubilidade em água (mg L-1): 610 Kow: 7,8
Sulfadimetoxina (SDM) Fórmula Molecular: C12H14N4O4S
Massa molar (g mol-1): 310,3 pKa1/pKa2: 1,9/ 6,1
Solubilidade em água (mg L-1): 340 Kow: 42,7
Sulfaquinoxalina (SQX) Fórmula Molecular: C14H12N4O2S
Massa molar (g mol-1): 300,3
pKa1/pKa2: 2,3/ 6,0
Solubilidade em água (mg L-1): 120 Kow: 47,9
pKa: constante de dissociação ácido-base; Kow: coeficiente de partição octanol-água. Fonte:
(SHELVER et al., 2010) e (STOOB et al., 2006).
No Brasil, as sulfonamidas de maior uso na medicina veterinária são: sulfadiazina, sulfametazina e sulfaquinoxalina (SINDAN, 2015). A Figura I.3 mostra o
número de medicamentos veterinários comercializados no Brasil, contendo sulfonamidas como insumos farmacêuticos na formulação.
Figura I.3: Número de medicamentos veterinários à base de sulfonamidas comercializados no Brasil e registradas no SINDAN (SINDAN, 2015).
I.3 Antimicrobianos e o ambiente
A disseminação dos antimicrobianos de uso veterinário no ambiente tem sido motivo de grande preocupação nos últimos anos, uma vez que esses fármacos proporcionam os maiores riscos para o ambiente e para a saúde humana em razão da sua toxidade e de seu potencial para induzir resistência bacteriana.
A taxa de excreção dos fármacos veterinários depende das propriedades físico-químicas da substância administrada, do modo de aplicação, da espécie animal e do tempo de tratamento. Uma vez que a absorção do fármaco é incompleta no organismo do animal, o fármaco pode ser eliminado no ambiente na sua forma não metabolizada ou como seus metabólitos ativos (PEREIRA et al., 2012). Estima-se que em alguns casos até 90% da dose administrada seja eliminada na forma não metabolizada ou como metabólitos ativos.
A principal rota de entrada dos antimicrobianos no ambiente provém do seu uso na criação intensiva de animais (bovinos, suínos e aves) e pelo uso de esterco como fertilizante na agricultura, sendo que a adubação consiste na principal forma de disseminação desses compostos no ambiente. Uma rota alternativa de entrada é a utilização do fármaco para o tratamento de peixes e camarões na aquicultura; neste
18 16 12 6 6 3 1 1 Sulfadiazina Sulfametazina Sulfaquinoxalina Sulfametoxazol Sulfadimetoxina Sulfadoxina Sulfacloropiridazina Sulfatiazol
caso o antimicrobiano é diretamente liberado na água superficial e pode ser acumulado no sedimento (BOXALL et al., 2003; HIRSCH et al., 1999).
Estudos recentes relatam a presença de antimicrobianos veterinários (AV) em matrizes ambientais, como em águas superficiais e subterrâneas e no solo (SHELVER et al., 2010; ZHOU et al., 2012). As sulfonamidas têm sido detectadas no solo em concentrações na ordem de ng g-1 (Tabela I.2).
A sorção do fármaco nos solos e sedimentos é um processo importante, pois ele determina o destino desses compostos no ambiente. O acúmulo e a persistência do antimicrobiano na matriz sólida depende dos parâmetros do solo, que incluem o pH, a quantidade de matéria orgânica, a capacidade de troca catiônica e a quantidade de argila; e das propriedades físico-químicas do fármaco, tais como estrutura, tamanho, forma, solubilidade em água, hidrofobicidade e especiação. Como a sorção é dependente da quantidade de carbono orgânico, utilizam-se os valores de Koc, coeficiente de sorção normalizado em relação ao teor de carbono
orgânico, para prever o comportamento do fármaco no solo. Esse valor pode ser derivado do coeficiente de partição octanol-água (Kow), que descreve as propriedades
lipofílicas e hidrofóbicas. Valores baixos desses parâmetros indicam que existe uma grande possibilidade dessas substâncias serem encontradas em águas subterrâneas, já os valores altos indicam uma grande sorção da substância na matéria orgânica no solo.
Uma vez no ambiente, além dos processos de sorção, a transformação (degradação) e o transporte (lixiviação e escoamento superficial) também são responsáveis pelo destino final do fármaco no ambiente. A degradação do fármaco no solo é governada pela atividade antimicrobiana, ou seja, os antimicrobianos são transformados por reações enzimáticas da microbiota do solo (KUMMERER, 2009).
Segundo relatos da literatura, os antimicrobianos podem ser absorvidos pelas plantas, interferindo no seu crescimento e desenvolvimento. Além disso, esses fármacos podem ser transferidos para os organismos que se alimentam delas. O efeito desses compostos sobre o desenvolvimento do vegetal depende de alguns fatores tais como, concentração envolvida, natureza do composto, cinética de sorção e mobilidade do produto (JJEMBA, 2002).
Tabela I.2: Ocorrência das sulfonamidas em solo. Sulfonamida Concentração
(ng g-1) Matriz Local Referência
Sulfadimetoxina 530 Solo - fertilizado com esterco Basileia, Suiça Stoob, K. et al.; 2006 0,18 Solo - Agrícola Catalunha, Espanha García-Galan, M. J. et al.; 2013
Sulfametoxazol
530 Solo - fertilizado com esterco Basileia, Suiça Stoob, K. et al.; 2006 12,3 Solo - fertilizado com esterco Tianjin e Liaoning, China Hou, J. et al.; 2015 1,01 Solo - Agrícola Catalunha, Espanha García-Galan, M. J. et al.; 2013
0,1 – 0,9 Solo Tianjin, China Hu, X. et al.; 2010
n.d. – 22,9 Solo - urbano Pequim e Xangai, China Gao, L. et al.; 2015 Sulfatiazol 530 Solo - fertilizado com esterco Basileia, Suiça Stoob, K. et al.; 2006 Sulfadiazina
530 Solo - fertilizado com esterco Basileia, Suiça Stoob, K. et al.; 2006 2,59 Solo - Agrícola Catalunha, Espanha García-Galan, M. J. et al.; 2013 n.d. – 7,12 Solo - urbano Pequim e Xangai, China Gao, L. et al.; 2015
Sulfametazina
530 Solo - fertilizado com esterco Basileia, Suiça Stoob, K. et al.; 2006 0,035 – 0,663 Solo - fertilizado com esterco EUA Shelver, W. L. et al.; 2010
8,53 Solo - Agrícola Catalunha, Espanha García-Galan, M. J. et al.; 2013 n.d. – 2,80 Solo - urbano Pequim e Xangai, China Gao, L. et al.; 2015 Sulfamonometoxina 0,5 – 18,3 Solo - Agrícola China Bian, K. et al.; 2015 n.d. – 0,21 Solo - urbano Pequim e Xangai, China Gao, L. et al.; 2015 Sulfacloropiridazina 1,3 – 2,5 Solo Tianjin, China Hu, X. et al.; 2010
20,9 Solo - fertilizado com esterco Tianjin e Liaoning, China Hou, J. et al.; 2015 Sulfaquinoxalina 20,3 – 33,1 Solo - Agrícola Nanjing, China Huang, Y. et al.; 2013
Sulfisoxazol 1,74 Solo - Agrícola Catalunha, Espanha García-Galan, M. J. et al.; 2013
Sulfadoxina 1,2 – 9,1 Solo Tianjin, China Hu, X. et al.; 2010
Considerando que o Brasil é um dos principais produtores de proteína animal do mundo e, ainda, que a produção vem crescendo (MAPA, 2015), a quantidade de fármacos veterinários (FV) lançada ao ambiente tem aumentado consideravelmente. O Brasil ainda não dispõe de diretrizes que obrigue as empresas farmacêuticas a realizar uma avaliação do impacto ambiental antes de comercializar um produto destinado ao uso veterinário. Porém, na Europa já existe uma diretriz que preconiza que a avaliação ambiental, baseada em cálculos e estudos realizados de acordo com o guia da Agência Europeia de Medicamentos (European Medicines Agency, EMA) (SLANA; DOLENC, 2013). Os cálculos e estudos são baseados em alguns parâmetros, tais como, as propriedades físico-químicas dos fármacos; as ocorrências e comportamento desses fármacos no meio que incluem estudos de sorção e dessorção no solo, degradação, metabolismo e excreção do fármaco e a toxicidade desses fármacos no solo e na água (EMA, 2008). No entanto, não existem legislações que estabeleçam limites específicos para a concentração de fármacos veterinários no solo. A EMA determina um limite genérico de 100 µg de fármaco por kg de solo.
I.4 Solo e suas características
O solo é um sistema composto de sólidos (matéria orgânica e minerais), líquido e gases que ocorre na superfície da Terra. As propriedades do solo tais como pH, sais solúveis, quantidade de matéria orgânica e razão carbono-nitrogênio, micro-organismos, fauna do solo, temperatura e umidade variam de acordo com as estações climáticas e ao longo dos anos. Além disso, o solo é afetado pela atividade antropogênica, ou seja, pelas atividades industriais, esgotos domésticos e atividades agrícolas, as quais podem resultar na degradação do solo e na perda e/ou redução das funções do solo (USDA, 2010).
O solo é composto basicamente por três componentes relevantes para a sua atividade físico-química, dentre elas estão: a matéria orgânica, que é todo material orgânico de origem vegetal ou animal decomposto, parcialmente decomposto e não decomposto; os aluminossilicatos, que são compostos formados por sílica na formação tetraédrica e alumina na forma octaédrica ligados; e os óxidos e hidróxidos de metais, principalmente ferro, alumínio e manganês.
As substâncias húmicas são constituídas de uma mistura de macromoléculas em que não é possível estabelecer um modelo estrutural. Elas são importantes elementos do solo, uma vez que regulam o processo de nutrição das plantas, controlam a mobilidade dos íons e a umidade do solo. As substâncias húmicas estão fortemente ligadas à porção mineral do solo e podem ser classificadas em três frações devido as propriedades de solubilidade (CHESWORTH, 2008):
Ácidos fúlvicos: possuem coloração amarelada e são solúveis tanto em meio ácido como básico.
Ácidos húmicos: substâncias que podem ser extraídas do solo em solução básica (pH ~ 8) e precipitam em meio ácido (pH entre 1 e 5).
Huminas: substâncias insolúveis tanto em soluções ácidas como básicas.
Devido ao intemperismo físico e químico das rochas e minerais existe uma ampla faixa de tamanho de partículas de pedras, cascalho, areia, silte e argila. Por isso, a fração mineral do solo pode ser classificada em:
Areia: fração entre 2,0 e 0,05 mm de diâmetro;
Silte: fração entre 0,05 e 0,001 mm de diâmetro;
Argila: fração menor que 0,002 mm de diâmetro.
O solo pode ser classificado de acordo com a fração de areia, silte e argila em diferentes classes texturais, como mostrado na Figura I.4.
Figura I.4: Triângulo textural do solo de acordo com as porcentagens de areia, silte e argila. Adaptado de (IBGE, 2007).
No estado de São Paulo predominam duas categorias de solo, os Latossolos e os Argilosolos (Figura I.5), sendo que os Argilossolos vermelhos-amarelos correspondem cerca de 41,2% da superfície do estado, os Latossolos vermelhos 30,2%, Latossolos vermelho-amarelo 9,4%.
O solo é uma matriz complexa composta por uma grande variedade de compostos orgânicos e inorgânicos que influenciam na retenção de fármacos veterinários. Conhecer as propriedades físico-químicas dos solos é fundamental para estabelecer o preparo de amostras visando a extração destes fármacos para posterior quantificação.
Figura I.5: Mapa pedológico do Estado de São Paulo elaborado por tratamento dos dados em programa ARC-GIS, com a colaboração do Dr. Adelsom Soares Filho, do Instituto de Geociências da Unicamp.
I.5 Determinação de fármacos veterinários em solo
A determinação de resíduos de fármacos veterinários em solos é um desafio, devido algumas características do analito e da matriz, tais como, a baixa concentração dos analitos no solo, a complexidade e a variabilidade da matriz e a forte interação de alguns fármacos nas partículas de solo.
A etapa de preparo de amostras é fundamental para a determinação dos fármacos em solo, uma vez que os fármacos podem apresentar uma forte interação com as partículas de solo, exigindo técnicas de extração que forneçam eficiência de extração adequada dos analitos. É no preparo de amostras que a matriz é submetida aos processos de extração, limpeza e concentração dos analitos, com o objetivo de eliminar os concomitantes e/ou interferentes (DMITRIENKO et al., 2014). Devido à complexidade do solo a técnica de preparo de amostras deve ser seletiva para proporcionar um extrato livre de interferentes que possam prejudicar a quantificação dos analitos.
A Tabela I.3 mostra os principais métodos de extração e pré-concentração/clean-up utilizados para a determinação das 7 sulfonamidas utilizadas nesse trabalho. Como pode ser visto na maioria dos trabalhos publicados a etapa de preparo de amostras é dividida em duas etapas: a extração do fármaco do solo e o clean-up do extrato com concentração dos analitos. A escolha das técnicas de extração e clean-up utilizadas dependem da natureza do fármaco, do pKa e da
polaridade da molécula. O desafio e as tendências da etapa de preparo de amostras na determinação de fármacos veterinários em solo incluem alguns fatores, tais como, o aumento na eficiência de extração dos analitos do solo; a redução do efeito matriz; o baixo consumo de reagentes; a repetitividade, a reprodutibilidade, a seletividade da técnica e a automação do sistema.
O uso de técnicas como a extração assistida por ultrassom (UAE – Ultrasonic-Assisted Extraction), a extração por líquido pressurizado (PLE- Pressurized Liquid Extraction) e a extração assistida por micro-ondas (MAE- Microwave-Assisted Extraction) têm sido utilizadas para extração de fármacos em matrizes complexas, como o solo (Tabela I.3). No entanto, muitos destes procedimentos levam a uma coextração de interferentes que inviabilizam a quantificação dos analitos, mesmo quando detectores seletivos como o espectrômetro de massas sequencial é empregado.
Tabela I.3: Técnicas de preparo de amostras utilizadas para a extração das sulfonamidas do solo. Sulfonamida Preparo de amostras Técnica analítica Modo de ionização Modo de quantificação LOQ (ng/g) Referência Extração Quantidade de amostra Técnica Solvente extrator Clean-up Técnica Sorvente Solvente eluição SDZ, SDM, SMZ, SMX e STZ 4 g - LC-MS/MS > 50 Stoob, K. et al.; 2006 PLE ESI +
ACN:H2O com 0.1 mol L-1 Tris, 85:15, v/v SRM
SDZ e SQX
2 g SPE LC-MS/MS
7,2 - 16,0 Chen, L. et al.; 2009
MAE Alumina ESI +
ACN H2O com 0,3% ácido acético MRM
SMX, STZ, SDZ, SMZ, SCP, SDM e SQX - SPE LC-MS/MS - Shelver, W. L. et al.; 2010 SAX-HLB ESI +
MeOH: acetato de etila (50:50, v/v) e MeOH:
H2O com 2,5% NH4OH (50:50, v/v) SRM SQX, SDZ, SDM, SMZ, SMX e STZ 5 g SPE LC-MS/MS 0,08 - 13,98 García-Galán, M. J. et al.; 2013 PLE HLB ESI +
MeOH:H2O, 90:10, v/v MeOH:Acetona com 50 mmol L-1 ácido fórmico SRM
SDZ, SDM, SMX e SQX
1 g SPE
HPLC-UV - Chen, L. et al.; 2010 MAE HLB ACN ACN SQX e SMX 5 g SPE LC-MS/MS 1 Bian, K. et al; 2015 UAE HLB ESI +
SDZ, SMX, SMZ, SQX e SDM 2 g SPE LC-MS/MS 0,49 - 2,58 Huang, Y. et al.; 2013 UAE HLB ESI +
EDTA-SPB com ACN:Mg(NO3)2NH3.H2O, 3:1,
v/v MeOH MRM SDZ, STZ, SMZ e SDM 1 g LC-MS/MS - Balakrishnan, V. K. et al; 2014 MAE - ESI + MeOH MRM STZ, SDZ e SMX 3 g SPE LC-MS/MS - Martinez-Carballo, E. et al.; 2006 UAE C18 ESI + MeOH:EDTA-Tampão McIlvaine, pH 6, 90:10,
v/v H2O e MeOH com 0,01 mol L-1 ácido oxálico MRM
SCP, SDM, SMX e STZ
2 g SPE LC-MS/MS
0,2 - 4,6 Hu, W. et al.; 2011
UAE SAX-HLB ESI +
ACN:EDTA-tampão McIlvaine, pH 3,2, 50:50, v/v MeOH MRM STZ, SDZ, SCP, SMX e SDM 1 g SPE LC-MS/MS - Bialk-Bielinska, A. et al.; 2009
UAE Strata-X ESI +
MeOH MeOH:ACN, 50:50, v/v MRM SMX e SCP 1 g SPE LC-MS/MS - Hu, X. et al.; 2010 UAE HLB ESI +
ACN:EDTA-Tampão McIlvaine, 1:1, v/v MeOH MRM
SDZ, SDM, SMX e STZ 1 g SPE LC-MS/MS - Gao, L. et al.; 2105 UAE HLB ESI +
ACN:EDTA-Tampão McIlvaine, pH 4, 2:1, v/v MeOH com 5% NH4OH MRM
PLE: extração por líquido pressurizado; MAE: extração assistida por micro-ondas; UAE: extração assistida por ultrassom; SPE: extração em fase sólida; ACN: acetonitrila, H2O: água, MeOH: metanol; EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético; HLB: cartuchos a base de polímero
lipofílico-hidrofílico; SAX: cartuchos de troca aniônica; ESI: ionização por electrospray; MRM: monitoramento de reações múltiplas; SRM: monitoramento de reação selecionada.
As técnicas MAE e PLE baseiam-se nos efeitos do aumento da temperatura e da pressão do sistema para melhorar a eficiência da extração, uma vez que, o aumento da temperatura diminui a viscosidade do solvente, aumentando os coeficientes de difusão; já o aumento da pressão favorece a penetração do solvente na matriz (PROSEN, 2014).
A MAE baseia-se no aquecimento da amostra em contato com o solvente extrator pela energia micro-onda em um sistema fechado sob condições controladas de pressão e temperatura. O aumento na temperatura e pressão do sistema faz com que a partição dos analitos da matriz sólida para o solvente seja facilitada, aumentando, assim, a eficiência de extração dos analitos. Os solventes extratores disponíveis para a MAE são aqueles que absorvem energia micro-ondas, ou seja, solventes com dipolo permanente. No entanto, misturas de solventes com e sem dipolo também podem ser utilizados nas extrações. Apesar das altas temperaturas empregadas na MAE auxiliarem na extração dos analitos, muitos interferentes e concomitantes do solo são extraídos juntamente com os analitos, aumentando o efeito matriz, o que prejudica a detectabilidade e/ou seletividade da determinação dos mesmos. Dessa forma, as condições de extração, bem como a escolha do solvente extrator, são fundamentais para o sucesso da análise (SANCHEZ-PRADO et al., 2015).
Na PLE, também chamada de extração acelerada por solvente (ASE – Accelerated Solvent Extraction), a dessorção, a difusão, a solvatação e outros mecanismos de transporte dos analitos para o solvente são controlados pela temperatura e pressão. Enquanto que a temperatura elevada aumenta a solubilidade dos analitos, quebrando as interações matriz-analito e aumentando a taxa de difusão, o aumento na pressão mantém o solvente abaixo do seu ponto de ebulição. Já a viscosidade e tensão superficial do solvente são reduzidas em temperatura e pressão elevada, então ele penetra de forma mais eficiente na amostra sólida, facilitando a extração dos analitos da matriz (VAZQUEZ-ROIG, PABLO; PICÓ, 2015).
Alguns parâmetros devem ser avaliados na otimização da extração por PLE, dentre eles estão: o solvente extrator, a temperatura, a pressão, o tempo da extração, o número de ciclos, a quantidade de amostras, o modo de extração (estático ou dinâmico), o volume do solvente e o tempo de purga. Além disso, a seleção dos
parâmetros adequados para a extração dos fármacos do solo por PLE deve levar em consideração a estabilidade dos compostos em temperaturas altas, a solubilidade dos analitos, a afinidade dos analitos pelo solo e o volume de extrato desejado. A escolha do solvente extrator é um dos principais fatores a ser avaliado, uma vez que esse influencia diretamente o processo de extração. A polaridade do solvente deve ser próxima a polaridade dos analitos e as extrações podem ser realizadas com vários solventes ou com uma mistura de solventes (NIETO et al., 2008). A extração das sulfonamidas do solo tem sido realizada utilizando uma mistura de água e um solvente orgânico (Tabela I.3). Para o processo de clean-up e concentração, o extrato obtido no PLE deve ser seco ou diluído em água para sua posterior extração em fase sólida (SPE) quando são empregados sorventes de fase reversa.
Uma tendência do uso da PLE para a determinação de fármacos veterinários em solo consiste da adição de um material sorvente na cela de extração, ou seja, objetivando a extração e o clean-up em uma única etapa. Tal procedimento tem como propósito minimizar a co-extração de componentes indesejados da matriz (VAZQUEZ-ROIG, P. et al., 2010). Alguns sorventes têm sido utilizados para a determinação desses fármacos, como o óxido de alumínio, sílica gel, Florisil® e areia
lavada com EDTA dissódico (RUNNQVIST et al., 2010). No entanto, apesar do clean-up na cela diminuir a eluição de interferentes a etapa de clean-clean-up por SPE ainda é necessária após a extração.
A extração sólido-líquido (SLE – Solid Liquid Extraction) baseia-se na transferência do analito da matriz para o solvente e é influenciada diretamente pela solubilidade do analito no solvente extrator, pela transferência de massa e pela matriz. A SLE pode ser realizada por: agitação, UAE ou Soxhlet, sendo que as mais importantes para a extração dos fármacos veterinários do solo são as extrações por agitação em vórtex e a UAE.
Na SLE por agitação, a amostra em contato com o solvente extrator apropriado é agitada (manualmente ou em vórtex) por um tempo determinado. Já na UAE a extração se dá pela aplicação da radiação ultrassom na amostra em contato com o solvente. O efeito do ultrassom induz uma maior penetração do solvente na amostra sólida, aumentando a transferência de massa e a eficiência da extração. Apesar da UAE ter um aumento na extração quando comparada as extrações por
agitação ela aumenta o número de interferentes e concomitantes que são extraídos da amostra, necessitando de etapas de clean-up após a extração (TADEO et al., 2012).
A dispersão da matriz em fase sólida (MSPD) tem se mostrado promissora para o preparo, extração e fracionamento de matrizes sólidas. A técnica consiste da dispersão homogênea da matriz em um suporte sólido como sílica, octadecil (C18), octil (C8), Florisil® ou alumina (BARKER, 2007). Os parâmetros como o tipo de
sorvente, o solvente de eluição devem ser avaliados, já que eles afetam diretamente a eficiência da extração (KRISTENSON; BRINKMAN; RAMOS, 2006). Não foram encontrados relatos na literatura utilizando a técnica de MSPD para a determinação de fármacos em solo, no entanto, estudos recentes no nosso grupo de pesquisa mostraram resultados promissores na extração de fármacos veterinários do solo utilizando a dispersão da matriz em fase sólida assistida por potencial elétrico (E-MSPD) (PERUCHI, 2015). A técnica alia os princípios cromatográficos da MSPD tradicional com os mecanismos eletroforéticos gerados pelo potencial elétrico na etapa de extração do analito do solo.
Devido à complexidade da matriz além da extração dos analitos do solo é necessário realizar uma etapa de clean-up que depende da técnica analítica empregada na etapa de quantificação. A extração em fase sólida (SPE) tem sido amplamente utilizada com essa finalidade. Nesta técnica, os analitos são particionados entre a fase sólida e a fase líquida. A escolha do sorvente depende principalmente dos analitos e das suas propriedades físico-químicas e é um parâmetro importante na SPE, uma vez que, ele pode controlar a seletividade, a afinidade e a capacidade da extração dos analitos da fase. Alguns sorventes têm sido utilizados na SPE, dentre eles estão as sílicas com grupos quimicamente ligados (C8 e C18), materiais com troca de íon e materiais poliméricos (PAVLOVIĆ et al., 2007). Os sorventes a base de sílica com grupos C18 quimicamente ligados e materiais poliméricos (HLB) foram amplamente utilizados para o clean-up de sulfonamidas em extratos de solo (CHEN et al., 2009; GARCIA-GALAN; DIAZ-CRUZ; BARCELO, 2013; MARTINEZ-CARBALLO et al., 2007).
A SPE pode ser realizada tanto na forma off-line como on-line a um sistema de detecção. Na SPE tradicional (off-line) a extração é realizada utilizando vácuo ou
pressão positiva em um manifold com cartuchos comerciais. Já as extrações on-line ocorrem em uma coluna de SPE ligada a um cromatógrafo a líquido (LC), ou seja, a extração e separação ocorrem no mesmo método cromatográfico. Com isso, as etapas como evaporação e reconstituição da amostra após o clean-up são eliminadas, diminuindo o tempo de análise, a manipulação da amostra e a incerteza do método. Além disso, a SPE on-line permite injeção de grandes volumes de amostra (em torno de mL), o que aumenta a detectabilidade dos analitos alvos (STOOB et al., 2005).
A extração em fase sólida assistida por potencial elétrico (E-SPE®) é uma
técnica de clean-up recente que tem como objetivo unir os mecanismos cromatográficos da SPE tradicional com os mecanismos eletroforéticos (eletromigração e fluxo eletroosmótico) gerados pela aplicação do potencial elétrico em uma mesma técnica para aumentar a seletividade da extração dos analitos de interesse em relação aos concomitantes da matriz (ORLANDO; RATH, 2009). A eficiência da E-SPE® foi demonstrada por meio da determinação de antimicrobianos
em leite (ORLANDO; ROHWEDDER; RATH, 2013) e resíduos de sulfonamidas e fluoroquinolonas em ovos (RIBEIRO, 2014).
Tendo em vista que os antimicrobianos veterinários se encontram no solo em concentrações na ordem de ng g-1 a pg g-1, que são compostos de caráter polar e
que a matriz é complexa, a técnica mais recomendada para a sua quantificação é a cromatografia líquida associada a espectrometria de massas sequencial.
A cromatografia líquida associada a espectrometria de massas sequencial tem sido amplamente utilizada para a determinação das sulfonamidas em amostras de solo (STOOB et al., 2006; SHELVER et al., 2010; BIAN et al., 2015). A interface entre o cromatógrafo a líquido e o espectrômetro de massas ocorre na fonte de ionização. Nesta etapa os analitos que foram separados na coluna cromatográfica são convertidos em íons na fase gasosa para serem analisados pelo espectrômetro. A ionização pode ocorrer tanto no modo positivo quanto negativo, dependendo das características do analito de interesse e, em geral, ocorre pela ejeção ou captura de elétrons, formando espécies conhecidas como íon molecular; ou pela protonação ou desprotonação, levando a formação de moléculas protonadas ou desprotonadas. A fonte de ionização mais utilizada para a análise de fármacos de uso veterinário é a
ionização por eletronebulização (ESI – Electrospray ionization) (LÓPES-SERNA et al., 2011; VAZQUEZ-ROIG et al., 2010).
Os tipos de analisadores de massas dependem dos objetivos a serem alcançados pela análise, bem como da detectabilidade e seletividade requerida. Os analisadores podem ser simples como um quadrupolo ou combinados. Para a análise de resíduos de fármacos de uso veterinário tem sido utilizado o espectrômetro de massas sequencial do tipo triplo quadrupolo (QqQ) (CHEN et al., 2009; BOURDAT-DESCHAMPS et al., 2014).
Embora o detector de massas seja seletivo, existe o desafio de minimizar o efeito matriz, que de modo geral pode suprimir o sinal e, consequente, prejudicar a detectabilidade.
O objetivo geral deste trabalho foi avaliar diferentes preparos de amostras visando à determinação de resíduos de sulfonamidas em diferentes tipos de solos característicos do Estado de São Paulo (textura arenosa e argilosa).
Os objetivos específicos compreenderam:
Avaliação de diferentes preparos de amostras como: dispersão da matriz em fase sólida assistida por potencial elétrico (E-MSPD) e extração por solvente seguida de extração em fase sólida.
Desenvolvimento de método para a determinação de resíduos de sulfonamidas por UHPLC-MS/MS, usando SPE off-line e on-line como estratégias no clean-up e concentração dos analitos.
Validação de um método para a determinação de sulfonamidas em solos característicos do estado de São Paulo.
III.1 Padrões analíticos, reagentes e solventes
Padrões analíticos das sulfonamidas: sulfadiazina (Sigma-Aldrich, 99%), sulfatiazol (Sigma-Aldrich, 99%), sulfametazina (Sigma-Aldrich, 99%), sulfametoxazol (Sigma-Aldrich, 99%), sulfadimetoxina sódica (Fluka, 99%), sulfaquinoxalina sódica (Sigma-Aldrich, 95%) e sulfacloropiridazina (Fluka, 99%).
Ácido cítrico (Merck, Brasil), fosfato de sódio bibásico (Baker, México), ácido fórmico (Synth, EUA) e acetato de amônio (Vetec, Brasil).
Solventes: metanol (Panreac, Espanha) e acetonitrila (Panreac, Espanha), todos em grau HPLC.
III.2 Materiais para cromatografia
Cartuchos de polipropileno com capacidade de 6 e 20 mL.
Discos de Teflon de 20 μm de poro para cartuchos de 6 e 20 mL.
Tela de aço inoxidável (abertura da malha de 0,13 mm).
Lã de vidro (Isofar, Brasil).
Sílica gel com tamanho de partícula médio de 100 µm (Merck, Alemanha)
Fase sólida polimérica C18 para SPE Bond Elut C18, 71 Å x 54 µm (Agilent, EUA).
Fase sólida de troca iônica SAX, 60 Å x 50 µm (Bonna-Agela Technologies, EUA).
Fase sólida a base de sílica quimicamente ligada com grupos Phenyl (Ph) para SPE Sepra Phenyl 65 Å x 50 µm (Phenomenex, EUA).
Fase sólida a base de sílica quimicamente ligada com grupos Phenyl (Ph) para SPE 60 Å x 40 µm (Applied Separations, EUA).
Fase sólida de sílica quimicamente ligada com grupos octadecil (C18) para SPE, Bond Elut 56 Å x 67 µm (Agilent, EUA).
Fase sólida de sílica quimicamente ligada com grupos octadecil (C18) para SPE Sepra C18-E, 65 Å X 50 m (Phenomenex, EUA).
Coluna cromatográfica XBridge™ RP-18 (4,6 x 150 mm, 3,5 µm) (Waters, Irlanda).
Coluna cromatográfica Acquity UPLC BEH C18 (2,1 x 50 mm, 1,7 µm) (Waters, Irlanda).
Coluna para SPE on-line XBridge C8 (2,1 x 30 mm, 10 µm) (Waters, Irlanda).
Coluna para SPE on-line Oasis HLB (2,1 x 30 mm, 20 µm) (Waters, Irlanda).
III.1 Equipamentos
Cromatógrafo a líquido de alta eficiência (Waters, Milford, EUA) composto de uma bomba binária (Waters, modelo 1525), um detetor por arranjo de fotodiodos (Waters, modelo 2996) um forno de coluna e um sistema de injeção automática (Waters, modelo 2707). A aquisição dos dados foi realizada pelo programa computacional Empower 3.0 (Waters, Milford, EUA).
Cromatógrafo a líquido de ultra-alta eficiência ACQUITY (Waters, EUA) com sistema de SPE on-line acoplado, que consiste de um injetor automático, um gerenciador de colunas, uma bomba quaternária para realizar o processo de extração, uma bomba binária para a separação cromatográfica e é acoplado a um espectrômetro de massas do tipo triplo quadrupolo Xevo TQD (Wates, EUA), com interface de ionização por eletronebulização (ESI). Os dados foram adquiridos pelo programa computacional MassLynx (Waters, EUA).
Bomba peristáltica modelo Miniplus Evolution (Gilson, França).
Fonte estabilizadora de alta tensão para eletroforese, modelo FISH-FB3000Q (Fisher-Scientific, Malásia).
Multímetro modelo 506 com saída RS-232 (Protek, Coréia do Sul).
Sistema tipo “manifold” de múltiplas extrações para aplicação de campos elétricos, BR Pat. 18110005366, 2011.
Agitador de soluções tipo vórtex, modelo AP56 (Phoenix Luferco, Brasil)
Centrífuga modelo Rotofix 32A (Hettich, Alemanha)
Balança analítica modelo XT220A (Precisa, Brasil).
Balança analítica modelo CPA 225D (Sartorius, Brasil).
Banho de ultrassom modelo 1450 (Unique, Brasil).
Purificador de água modelo Milli-Q Academic (Millipore, EUA).
pH-metro modelo DM-22 empregando eletrodo de vidro combinado (Digimed, Brasil).
III.4 Amostras de solo
Os estudos foram avaliados em 2 solos característicos do estado de São Paulo, que foram classificados baseados nas suas propriedades conforme o Sistema Brasileiro de Classificação de Solos – SIBCS:
RQo: Neossolo Quartzarênico Órtico, de textura arenosa (coletado no
município de Piracicaba, SP);
LVe: Latossolo Vermelho Eutrófico, de textura muito argilosa (coletado
no município de Campinas, SP, na Fazendo Santa Elisa do IAC).
As propriedades físico-químicas dos solos utilizados são mostradas na Tabela III.1.
Tabela III.1: Propriedades físico-químicas dos solos RQo e LVe.
Propriedades Solo
RQo LVe
pH (em 0.01 mol L-1 CaCl
2) 4,0 5,0 Profundidade do solo (cm) 0-20 0-20 Matéria Orgânica (% w/w) 13 51 Textura (%) Areia 93,2 27,4 Silte (0,053-0,002 mm) 1,7 12,4 Argila (<0,002 mm) 5,1 60,2 Capacidade de troca catiônica (meq kg-1) 24,2 66,4
III.3.2 Métodos
III.5.1 Preparo das soluções A. Soluções estoque
As soluções padrão estoque das sulfonamidas foram preparadas, separadamente, na concentração de 1000 μg mL-1. Os padrões foram pesados (±0,01
