III.4 Amostras de solo
III.5.6 Validação do método
Após a otimização da extração sólido-líquido e do método de SPE-UHPLC- MS/MS, o método desenvolvido para a determinação de resíduos de sulfonamidas foi validado para dois solos (LVe e RQo). Os parâmetros avaliados foram: linearidade, faixa linear, limite de quantificação, efeito matriz, precisão intra-dia (repetitividade), precisão inter-dia (precisão intermediária) e exatidão.
III.5.6.1 Estabilidade do analito na matriz
Para os estudos de estabilidade dos analitos na matriz solo, 2 g de solo foram fortificados com 0,5 mL da solução 30 ng mL-1 das sulfonamidas (7,5 ng g-1) e
conforme descrito em III.5.4 após 12, 36 e 60 horas da realização da fortificação. O extrato obtido foi seco em fluxo de N2 a 60 ºC, e o resíduo ressuspendido em 1 mL da
fase móvel e analisado no sistema SPE-UHPLC-MS/MS.
A estabilidade foi avaliada mediante comparação das concentrações corrigidas pelo padrão interno (valor medido) dos solos fortificados nos tempos de 12, 36 e 60 horas com o valor médio entre as três medidas.
III.5.6.2 Faixa linear, linearidade e limite de quantificação
A faixa linear e a linearidade foram avaliadas por meio de curvas analíticas utilizando amostras branco de solo fortificadas com os analitos de interesse em sete níveis de concentração (0,5; 1,0; 2,5; 5; 7,5; 10,0; 12,5 ng g-1) em triplicata. O solo foi
fortificado e deixado em temperatura ambiente por uma noite (aproximadamente 12 horas). A SCP foi usada como padrão interno em uma concentração de 10 ng g-1.
A extração foi realizada adicionando 10 mL da solução extratora (água:acetonitrila, 1:1, v/v) a 2 g de solo. A solução de solo foi agitada em vórtex por 2 min e centrifugada a 1046 g por 5 min. O sobrenadante foi transferido e seco sob fluxo de nitrogênio a 60 oC. O resíduo foi ressuspendido em 1 mL da fase móvel
(água:metanol ambos com 0,1% de ácido fórmico, 80:20, v/v) e filtrado com filtros de 0,22 µm antes da análise por SPE-UHPLC-MS/MS. A coluna SPE continha uma fase Oasis HLB. O solvente de carregamento da amostra foi água, o volume de injeção foi de 200 µL e a eluição foi realizada com água:metanol, ambos com 0,1% de ácido fórmico na proporção 40:60, v/v. As sulfonamidas foram quantificadas no espectrômetro de massas nas condições descritas em III.5.2.2.
As curvas analíticas de cada analito foram obtidas plotando as respectivas razões de áreas dos picos dos analitos e padrão interno nos cromatogramas em função da concentração dos analitos no solo (ng g-1). A equação da reta foi obtida
pelo método dos mínimos quadrados ordinários (MMQO), após comprovação da homocedasticidade pelo teste de Levene e exclusão de pontos extremos (outliers) pelo teste de resíduos padronizados Jacknife, respeitando a exclusão máxima de 22,2% do número de pontos.
O limite de quantificação foi considerado como sendo a menor concentração detectada pela razão sinal-ruído maior que 10 e foi utilizado como primeiro ponto da curva analítica na matriz.
III.5.6.3 Efeito Matriz
O efeito matriz foi avaliado pela comparação das inclinações das curvas analíticas no solvente e no extrato fortificado do solo para cada analito nas concentrações de 1,0; 2,5; 5,0; 7,5; 10,0 e 12,5 ng mL-1. A análise foi realizada no
sistema SPE-UHPLC-MS/MS. As curvas no solvente foram preparadas em água:metanol ambas com 0,1% de ácido fórmico, 80:20, v/v.
O efeito matriz foi calculado pela Equação 1, na qual os valores expressam a magnitude do efeito matriz e o sinal expressa o tipo de efeito matriz, isto é, valores positivos de efeito matriz resultam do incremento do sinal analítico e os negativos de uma supressão do sinal.
𝐸𝑀 (%) = [(𝑎𝑀
𝑎𝑆) − 1] × 100 Equação 1
Onde,
EM é o efeito matriz;
aM é o coeficiente angular obtido pela regressão linear da curva analítica do extrato fortificado;
aS é o coeficiente angular obtido pela regressão linear da curva analítica no solvente.
III.5.6.4 Precisão
A precisão do método desenvolvido foi avaliada por meio da precisão intra- dia (repetitividade) e precisão inter-dia (precisão intermediária).
A precisão foi avaliada pela análise de amostras branco de solo fortificadas em dois níveis de concentração (2,5 e 7,5 ng g-1) para cada sulfonamida. As análises
foram realizadas em sextuplicata no mesmo dia, pelo mesmo analista e usando o mesmo método e equipamento. Já a precisão inter-dia foi avaliada em três dias diferentes, sextuplicata no primeiro dia e triplicata nos outros dois dias. As precisões intra- e inter-dia são expressas em termos das estimativas dos desvios padrão relativos (RSD).
III.5.6.5 Exatidão
A exatidão foi realizada mediante teste de recuperação, na qual amostras brancas de solo foram fortificadas com todas as sulfonamidas em dois níveis de concentração 2,5 e 7,5 ng g-1 e analisadas usando a SLE para a extração das
sulfonamidas do solo e SPE-UHPLC-MS/MS para a sua quantificação. As analises foram realizadas em sextuplicata em um mesmo dia. A SCP na concentração de 5,0 ng g-1 foi usada como padrão interno.
O preparo de amostras ainda é uma etapa crítica na determinação de resíduos de fármacos veterinários em amostras ambientais, em particular solo, devido à complexidade da matriz e às baixas concentrações dos resíduos nestes (na ordem de pg g-1 a ng g-1), mesmo empregando métodos de elevada seletividade e
detectabilidade como a UHPLC-MS/MS. De maneira geral, no preparo de amostras dois desafios principais necessitam ser resolvidos: a extração dos analitos com mínima co-extração de concomitantes e/ou interferentes e a concentração dos analitos anterior a quantificação. Nestes dois pontos principais de preparo de amostras foi centrado essa dissertação.
O trabalho experimental foi dividido em duas etapas: na primeira o método analítico para a determinação das sulfonamidas foi desenvolvido utilizando as técnicas de HLPC-DAD e UHPLC-MS/MS e na segunda, duas técnicas de preparo de amostras (E-MSPD seguida de clean-up por SPE off-line e a SLE seguida por clean- up por SPE off-line ou on-line ao UHPLC-MS/MS) foram avaliadas. Os resultados obtidos estão apresentados e discutidos a seguir.
IV.1 Otimização do método analítico para a determinação de