IV.2 Desenvolvimento do método analítico para a determinação de sulfonamidas
IV.3.2 Otimização das condições de extração das sulfonamidas por E-MSPD
Com a instalação do cromatógrafo a líquido de ultra-alta eficiência acoplado a um espectrômetro de massas sequencial (UPLC-MS/MS) do tipo triplo quadrupolar foi possível desenvolver um método para monitorar os íons precursores e íons produtos de cada sulfonamida. É bem conhecido nesta técnica o problema do efeito matriz que pode suprimir ou aumentar o sinal analítico dependendo da composição da matriz amostral. De modo geral, ocorre a supressão do sinal e é importante tentar eliminar o máximo o efeito matriz para não se ter prejuízo na detectabilidade do método como um todo. Os testes iniciais apontaram um efeito matriz considerável para o solo. Vale ressaltar que os métodos para a determinação de antimicrobianos em solo necessita ter a capacidade de quantificar os analitos em concentrações menores do que 100 ng g-1.
O método desenvolvido foi dividido em 3 etapas: a extração, o clean- up/pré-concentração e a quantificação por UHPLC-MS/MS. Alguns parâmetros foram avaliados durante o desenvolvimento do método, um esquema com estes parâmetros é mostrado na Figura IV.4.
Figura IV.4: Etapas do método a ser desenvolvido e técnicas empregadas para a determinação das sulfonamidas em solo.
O clean-up é uma etapa fundamental para a análise dos extratos de solo, uma vez que é nessa etapa em que os interferentes co-extraídos da matriz devem ser removidos. O procedimento de SPE convencional baseia-se na cromatografia em coluna tradicional, ou seja, a migração dos analitos depende da sua interação com o solvente de eluição e o sorvente. Já a E-SPE adiciona componentes eletroforéticos aos cromatográficos, com isso a força do potencial elétrico pode favorecer a eluição dos compostos carregados da solução (analitos ou interferentes) e pode atribuir diversas vantagens em relação ao procedimento padrão (SPE).
A avaliação dos dois procedimentos foi realizada pela comparação da recuperação dos analitos da matriz. Lembrando que, nos dois casos, as sulfonamidas foram extraídas do solo fortificado utilizando a técnica de E-MSPD, diferenciando apenas na etapa de clean-up, ou seja, um grupo de amostras foi submetido a E-SPE com sorvente Sepra Phenyl, que se mostrou eficiente para a retenção das sulfonamidas (RIBEIRO, 2014) e o outro a SPE com cartuchos comerciais com fase sólida C18. A eficiência de cada técnica de clean-up foi calculada utilizando a equação da reta das curvas analíticas obtidas com o extrato de solo branco fortificado após as etapas de extração por E-MSPD e de clean-up SPE ou E-SPE. Os resultados são apresentados na Figura IV.5.
Figura IV.5: Valores de eficiência de extração da SDZ, STZ, SMZ, SMX, SDM e SQX; obtidos pela extração dos analitos do solo LVe por E-MSPD seguida de dois tipos diferentes de clean-
up: E-SPE e SPE. Fortificação do solo: 500 ng g-1. Condições cromatográficas utilizando
UHPLC-MS/MS: coluna ACQUITY UPLC BEH C18 (50 x 3,0 mm,1,7 μm), fase móvel: FA- água com 0,1% ácido fórmico, FO- metanol com 0,1% de ácido fórmico, eluição por gradiente – FA:FO (v/v) 90:10 - 62:38 → 0,0 -1,52 min; 62:38 → 1,62 - 2,43 min; 62:38 - 90:10 → 2,43 - 3,24; 90:10 → 3,24 – 4,0 min. Vazão 0,43 mL min-1. Volume de injeção: 2 μL. Temperatura
da coluna: 40 oC. 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 SDZ STZ SMZ SMX SDM SQX Efi ci ê n ci a d e e xtr aç ão ( % ) SPE E-SPE
Como pode ser visto na Figura IV.5 a porcentagem de recuperação do procedimento de SPE é maior em relação ao E-SPE nas condições experimentais empregadas para as três sulfonamidas mais apolares (SMX, SDM e SQX). No caso da E-SPE verifica-se que a eficiência de extração diminui com a diminuição da polaridade das sulfonamidas, sendo que as mais apolares não foram detectadas nos extratos das amostras.
Uma hipótese para a não recuperação dos três analitos apolares por E- SPE é que a a força cromatográfica da solução de eluição (tampão acetato de amônio 50 mmol L-1 com 15% de THF) não foi capaz de superar as interações de van der
Waals e por elétrons dos anéis aromáticos desses analitos com o sorvente. Cabe destacar que nessa técnica de clean-up o uso de um tampão é indispensável para que as moléculas dos analitos estejam carregadas durante a eluição e possam sofrer o efeito do potencial elétrico aplicado. Já na SPE a eluição foi feita com MeOH, que levou também a eluição das três sulfonamidas mais apolares.
O procedimento de E-SPE se mostrou pouco eficiente no clean-up dos extratos de solo com as sulfonamidas do solo nas condições experimentais utilizadas. Esse procedimento, ainda, é demorado porque os cartuchos com os eletrodos são montados manualmente. Sendo assim, uma vez que o procedimento SPE forneceu resultados satisfatórios para pelo menos três das seis sulfonamidas ele foi adotado para o clean-up e concentração dos analitos nos extratos de solo.
IV.3.2.2 Solução de eluição da extração
Para melhorar a extração dos analitos no E-MSPD, foi avaliada a proporção de solvente orgânico utilizado no processo. Foram testados duas soluções de eluição, a primeira com proporção 1:1 v/v ACF:ACN e a segunda com proporção 1:2 v/v ACF:ACN. Os resultados obtidos são apresentados na Figura IV.6. O clean-up foi realizado por SPE em cartuchos de C18, uma vez que em testes preliminares esta fase sólida apresentou uma melhor recuperação das sulfonamidas e por serem cartuchos comerciais, ou seja, os cartuchos não precisam ser montados manualmente, conforme descrito em III.5.3.
A Figura IV.6 mostra que aumentando a proporção de solvente orgânico (ACN) ocorre uma melhora da extração (recuperação) das sulfonamidas, com exceção da SQX. Tal fato pode ser explicado pelo aumento da força cromatográfica da solução de eluição do E-MSPD, com isso, a interação entre o analito e a sílica, na qual ele está disperso, diminui e uma maior quantidade de analito é eluída do cartucho. Dessa forma, os estudos posteriores foram realizados com a solução de eluição ACF:ACN 1:2 v/v.
Figura IV.6: Valores de recuperação da SDZ, STZ, SMZ, SMX, SDM e SQX obtidos pela extração dos analitos em concentração de 500 ng g-1 do solo LVe por E-MSPD seguida pelo
clean-up por SPE, utilizando como solução de extração da E-MSPD: ACF:ACN na proporção
1:1, v/v ou ACF:ACN na proporção 1:2, v/v. Condições cromatográficas no UHPLC-MS/MS: coluna ACQUITY UPLC BEH C18 (50 x 3,0 mm,1,7 μm); fase móvel: FA- água com 0,1% ácido fórmico, FO- metanol com 0,1% de ácido fórmico; eluição por gradiente – FA:FO (v/v) 90:10 - 62:38 → 0,0 -1,52 min; 62:38 → 1,62 - 2,43 min; 62:38 - 90:10 → 2,43 - 3,24; 90:10 → 3,24 – 4,0 min; vazão 0,43 mL min-1; volume de injeção: 2 μL; temperatura da coluna: 40 oC. ACF– tampão ácido cítrico/ fosfato bibasico de sódio.
Como pode ser visto pelos resultados da Figura IV.6 a E-MSPD mostrou- se promissora para a determinação das sulfonamidas presentes no solo. No entanto, mias estudos seriam necessários para otimização dos parâmetros envolvidos, de modo a permitir que a extração e o clean-up fossem realizados em uma única etapa como proposto pela técnica. A E-MSPD é uma técnica laboriosa, visto que os cartuchos são montados manualmente e o processo é dividido em várias etapas. Portanto, um novo procedimento foi avaliado para extração das sulfonamidas e será mostrado a seguir. 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 SDZ STZ SMZ SMX SDM SQX Efi ci ê n ci a d e e xtr aç ão ( % ) ACF:ACN (1:1, v/v) ACF:ACN (1:2, v/v)