Para a otimização dos parâmetros do SPE-UHPLC-MS/MS foram utilizados extratos de solo obtidos pela extração SLE conforme descrito em III.5.5, que foram fortificados com as 6 sulfonamidas na concentração de 12 ng mL-1. A
sulfacloropiridazina (10 ng mL-1) foi utilizada para avaliar se seria um composto
adequado para ser empregado como padrão interno. Essa sulfonamida não é usada como fármaco veterinário. No entanto, tem se como objetivo a análise de amostras de solo em campo empregar um surrogate (padrão deuterado da sulfonamidas).
Dois tipos de sorventes da coluna de SPE foram avaliados: sílica com grupos C8 quimicamente ligados (XBridge C8) e a fase polimérica com balanço entre sítios lipofílicos e hidrofílicos (Oasis HLB). O extrato de solo branco fortificado com as sulfonamidas (200 µL) foi injetado na coluna de SPE com água como solvente de carregamento e a eluição foi realizada utilizando o modo isocrático de eluição com solvente na proporção 40:60 (H2O:MeOH ambos com 0,1% de ácido fórmico, v/v). A
Figura IV.12 mostra a comparação entre as áreas dos picos cromatográficos das sulfonamidas obtidas com SPE-UHPLC-MS/MS usando os dois tipos de sorventes. Todas as análises foram realizadas em triplicata e os desvios estão apresentados no gráfico pelas barras de erro.
Figura IV.12: Área dos picos cromatográficos das sulfonamidas obtidas com SPE-UHPLC- MS/MS usando dois tipos de sorventes: XBridge C8 e Oasis HLB. Condições do SPE: água como solvente de carregamento, injeção de 200 µL do extrato de solo fortificado com cada sulfonamida na concentração 12 ng mL-1 e sulfacloropiridazina 10 mg mL-1. A eluição com
água:metanol ambos com 0,1% ácido fórmico (40:60, v/v). Coluna analíticaACQUITY UPLC BEH C18.
A Figura IV.12 mostra um aumento na recuperação das sulfonamidas no sorvente HLB em relação ao C8, principalmente para as sulfonamidas mais polares SDZ, STZ e SMZ. Utilizando o sorvente HLB a recuperação dessas sulfonamidas aumentou cerca de 80% para a SDZ, 70% para a STZ e 30% para a SMZ, quando comparada com o sorvente C8. Tal fato pode ser explicado por uma maior interação dos analitos polares com o sorvente polimérico HLB. Esse comportamento observado foi mantido para outras concentrações empregadas, mostrando um perfil linear da área em função da concentração (Figura IV.13) para a SDZ e STZ. Dessa forma, o sorvente HLB foi escolhido para os estudos posteriores.
0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 SDZ STZ SMZ SMX SDM SQX SCP Áre a XBridge C8 Oasis HLB
SDZ STZ
Figura IV.13: Curva analítica no extrato branco de solo fortificado com as sulfonamidas sulfadiazina (SDZ) e sulfatiazol (STZ) obtidas com SPE-UHPLC-MS/MS, usando dois tipos de sorventes: XBridge C8 e Oasis HLB. Condições do SPE: água como solvente de carregamento, injeção de 200 µL do extrato de solo fortificado com cada sulfonamida na concentração 12 ng mL-1 e sulfacloropiridazina 10 mg mL-1. A eluição foi feita com
água:metanol ambos com 0,1% ácido fórmico (40:60, v/v).
O próximo parâmetro avaliado foi o tempo de lavagem do sorvente após injeção da amostra. Com os parâmetros experimentais selecionados, a amostra leva 0,3 minutos do injetor até a coluna de SPE. A etapa de limpeza antes da separação cromatográfica na coluna analítica é importante, uma vez que ela permite a eliminação dos interferentes da amostra que podem causar a supressão do sinal analítico. No entanto, se um volume elevado de solvente for empregado pode ocorrer a perda dos analitos durante essa etapa de lavagem.
Foram avaliados três volumes de lavagem da fase: 0,19 mL (0,2 min com vazão de 0,95 mL min-1), 0,43 mL (0,45 min com vazão de 0,95 mL min-1) e 0,66 mL
(0,7 min com vazão de 0,95 mL min-1). O solvente de carregamento de lavagem foi a
água, que é o solvente mais fraco para esse tipo de sorvente. Os resultados são apresentados na Figura IV.14. Como pode ser visto o aumento no volume de lavagem
0 50000 100000 150000 200000 250000 0 10 20 Áre a Concetração (ng g-1) C8 Oasis 0 50000 100000 150000 200000 250000 0 10 20 Áre a Concentração (ng g-1) C8 Oasis 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 0 10 20 An alit o /PI Concentração (ng g-1) C8 Oasis 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 0 10 20 An alito Concentração (ng g-1) C8 Oasis
da coluna de SPE de 0,19 mL para 0,66 mL levou a uma redução na área das sulfonamidas, indicando a perda dos analitos nessas condições. Portanto, o volume de lavagem selecionado foi o de 0,19 mL por apresentar a maior recuperação dos analitos em questão.
Figura IV.14: Área dos picos cromatográficos das sulfonamidas obtidas com SPE-UHPLC- MS/MS usando diferentes volumes de lavagem do sorvente: 0,19; 0,43 e 0,66 mL. Condições do SPE: coluna de SPE Oasis HLB, água como solvente de carregamento, injeção de 200 µL do extrato de solo fortificado com cada sulfonamida na concentração 12 ng mL-1 e
sulfacloropiridazina 10 mg mL-1. A eluição foi feita com água:metanol ambos com 0,1% ácido
fórmico (40:60, v/v).Análises realizadas em triplicata.
Um outro parâmetro importante para ser avaliado é a composição do solvente de carregamento e lavagem, já que ele pode aumentar ou diminuir a interação dos analitos com a fase sólida do SPE e é importante na remoção de concomitantes da matriz que podem diminuir o sinal analítico por efeito matriz. Inicialmente, foi avaliada a água como solvente, por ser de força cromatográfica mais fraca neste tipo de fase, no entanto, removeria apenas compostos muitos polares. No intuito de poder eliminar compostos menos polares, no entanto, sem perder as sulfonamidas que deveriam ficar retidas no sorvente da coluna de SPE, adição de pequenas quantidades de metanol à água foi realizada. Neste sentido, foram avaliadas diferentes proporções de água:metanol: 80:20, 90:10, 95:5, 99:1 e 100:0 (v/v). A Figura IV.15 mostra que não houve diferença significativa quando metanol até uma proporção de 20% foi adicionado a água. Além disso, não ocorreu mudança significativa no formato dos picos cromatográficos e no efeito matriz. Cromatogramas
0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 SDZ STZ SMZ SMX SDM SQX SCP Áre a 0,19 mL 0,43 mL 0,66 mL
característicos para a SQX, para fins de ilustração, estão apresentados na Figura IV.16. Dessa forma, 100% de água foi escolhida como solvente de carregamento por ser o solvente mais fraco e não influenciar na interação dos analitos polares com a fase sólida, minimizando a perda desses analitos.
Figura IV.15: Área dos picos cromatográficos das sulfonamidas obtidas com SPE-UHPLC- MS/MS usando diferentes proporções do solvente de carregamento (água:metanol, v/v): 100:0; 99:1; 95:5; 90:10 e 80:20. Condições do SPE: coluna de SPE Oasis HLB, injeção de 200 µL do extrato de solo fortificado com cada sulfonamida na concentração 12 ng mL-1 e
sulfacloropiridazina 10 mg mL-1. A eluição foi feita com água:metanol ambos com 0,1% ácido
fórmico (40:60, v/v). Análises realizadas em triplicata.
0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000 SDZ STZ SMZ SMX SDM SQX SCP Áre a 100:0 99:1 95:5 90:10 80:20 H2O:MeOH
Figura IV.16:Cromatogramas SRM da sulfaquinoxalina (SQX) com diferentes proporções do solvente de carregamento (água:metanol, v/v): (a) 100:0, (b) 99:1 e (c) 95:5 (d) 90:10 e (e) 80:20.
O sistema de SPE on-line da forma como está configurado fisicamente permite um volume de injeção máximo de 1 mL da amostra em 4 ciclos de 250 µL. Sendo assim, diferentes volumes de injeção foram avaliados: 100 µL, 150 µL, 200 µL, 300 µL (injeções múltiplas: 2 x 150 µL) e 400 µL (injeções múltiplas: 2 x 200 µL). A Figura IV.17 mostra que aumentando o volume de injeção ocorre um aumento da área dos picos cromatográficos das sulfonamidas, o que se justifica pelo aumento da quantidade de analitos injetados no sistema. Apesar das injeções múltiplas levarem a uma resposta maior dos analitos, a injeção única de 200 µL de amostra foi selecionada neste momento pelo menor tempo de análise e por permitir um sinal analítico adequado para chegar a limites de quantificação na ordem de 1 ng g-1 (valor
almejado neste trabalho). Vale ressaltar que, se fosse necessário atingir limites de quantificação ainda mais baixos, os volumes de injeção mais altos poderiam ser utilizados sem ocorrer a distorção dos picos cromatográficos.
(a)
(b)
(d) (c)
Figura IV.17: Área dos picos cromatográficos das sulfonamidas obtidas com SPE-UHPLC- MS/MS usando diferentes volumes de injeção: 100 µL, 150 µL, 200 µL, 2 x 150 µL e 2 x 200 µL. Condições do SPE: coluna de SPE Oasis HLB, água como solvente de carregamento, injeção de 200 µL do extrato de solo fortificado com cada sulfonamida na concentração 12 ng mL-1 e sulfacloropiridazina 10 mg mL-1. A eluição foi feita com água:metanol ambos com 0,1%
ácido fórmico (40:60, v/v). Análises realizadas em triplicata.
Devido ao efeito de carry over observado para a SQX na injeção de metanol puro depois da injeção da amostra (Figura IV.18), foi necessário avaliar a lavagem do sorvente contido na coluna SPE entre análises. O efeito de carry over, neste caso é decorrente de resquícios do analito da amostra anteriormente injetada que não foi completamente removida na etapa de eluição do sistema de SPE.
A eluição dos interferentes e os analitos retidos na fase sólida da coluna SPE devem ser eliminados com um solvente forte. Neste estudo, foi utilizado metanol para esse fim. Depois da etapa de lavagem, a coluna de SPE foi condicionada e equilibrada com a fase de carregamento para prepara-la para a próxima extração. O gradiente de limpeza foi feito como descrito na Tabela III.2.
0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 SDZ STZ SMZ SMX SDM SQX SCP Áre a 100 uL 150 uL 200 uL 2 x 150 uL 2 x 200 uL
Figura IV.18: Cromatogramas SRM das sulfonamidas (SDZ, STZ, SMZ, SMX, SDM e SQX) da injeção de metanol após a injeção da amostra obtidos com SPE-UHPLC-MS/MS. Condições do SPE: coluna de SPE Oasis HLB, água como solvente de carregamento, injeção de 200 µL do extrato de solo fortificado com cada sulfonamida na concentração 12 ng mL-1 e
sulfacloropiridazina 10 mg mL-1. A eluição foi feita com água:metanol ambos com 0,1% ácido
fórmico (40:60, v/v).
A eluição das sulfonamidas da coluna de SPE foi feita utilizando água com 0,1% de ácido fórmico e metanol com 0,1% de ácido fórmico no modo isocrático de eluição. Essa mistura de solventes corresponde a fase móvel utilizada para a separação cromatográfica.
Três diferentes proporções de água:metanol ambas com 0,1% de ácido fórmico foram avaliadas como fase móvel para eluição: 60:40, 50:50 e 40:60 (v/v). O cromatograma SRM da SQX é mostrado na Figura IV.19. O aumento na proporção de solvente orgânico na fase móvel diminui a cauda do pico cromatográfico, a retenção do analito e aumenta a recuperação de todas as sulfonamidas e diminui a retenção do analito. Essa evidência foi maior para as sulfonamidas mais apolares. Portanto, a fase móvel composta por água:metanol com 0,1% de ácido fórmico na proporção 40:60, v/v foi escolhida como condição ótima.
a) SDZ d) SMX e) SDM f) SQX c) SMZ b) STZ
Figura IV.19: Cromatogramas SRM da sulfaquinoxalina (SQX) com diferentes proporções da fase móvel (água com 0,1% de ácido fórmico: metanol com 0,1 % de ácido fórmico, v/v) para a dessorção da SQX (12 ng g-1) para a coluna analítica: (a) 60:40, (b) 50:50 e (c) 40:60.
Os estudos realizados permitiram estabelecer como parâmetros ótimos do método SPE-UHPLC-MS/MS para a determinação de sulfonamidas em solos, após extração das mesmas por SLE: sorvente Oasis HLB, água como solvente de carregamento (volume de 0,19 mL), injeção de 200 µL da amostra e eluição com água:metanol ambos com 0,1% de ácido fórmico 40:60 (v/v). Os cromatogramas empregando essas condições experimentais são mostrados na Figura IV.20.
(a)
(c) (b)
Figura IV.20: Cromatogramas SRM para sulfadiazina (SDZ), sulfatiazol (STZ), sulfametazina (SMZ), sulfametoxazol (SMX), sulfadimetoxina (SDM) e sulfaquinoxalina (SQX) extraídas do solo LVe por SLE e determinação por SPE-UHPLC-MS/MS. Condições do SPE: coluna de SPE Oasis HLB, água como solvente de carregamento, injeção de 200 µL do extrato de solo fortificado com cada sulfonamida na concentração 12 ng mL-1 e sulfacloropiridazina 10 mg
mL-1. A eluição foi feita com água:metanol ambos com 0,1% ácido fórmico (40:60, v/v).
O método SPE-UHPLC-MS/MS mostrou ser simples e preciso para a determinação dos resíduos de sulfonamidas em solo no nível de concentração de ng g-1, com a vantagem de uma menor manipulação da amostra, facilidade de injetar a
amostra diretamente no sistema e redução do tempo de análise em relação ao clean- up por SPE off-line. Além disso, a coluna de SPE permite a análise de um grande número de amostras (cerca de 2000 injeções, segundo observações obtidas no laboratório) sem perda de eficiência. Portanto, o método (SLE seguido de SPE on- line acoplado ao UHPLC-MS/MS) foi validado para a determinação de resíduos de sulfonamidas em dois solos com diferentes proporções de matéria orgânica (LVe - argiloso e RQo - arenoso).