Como já apresentado, a DII engloba enfermidades de difícil adequação aos fármacos existentes, o que leva à busca por novas opções terapêuticas. Nesse contexto, o uso de medicamentos complementares e alternativos, como os fitoterápicos e nutracêuticos (probióticos e ácidos graxos ômega 3), vem aumentando ao longo dos anos. Os probióticos são microrganismos vivos que administrados em concentrações adequadas, podem conferir inúmeros benefícios à saúde do hospedeiro (CELIBERTO et al., 2015). Nesse estudo, pôde ser observado que o pré- tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 foi capaz de prevenir os danos causados pela instilação do DNBS na mucosa colônica dos ratos.
Os Lactobacillus estão entre os microrganismos mais abundantes no TGI e vem sendo associados a uma boa saúde intestinal. Vários estudos realizados vêm demonstrando a capacidade deste gênero em amenizar os sintomas clínicos da DII (dor abdominal, inchaço e flatulência) (GANJI-ARJENAKI; RAFIEIAN-KOPAEI, 2017; ABRAHAM; QUIGLEY, 2017; HEENEY; GAREAU; MARCO, 2018), além de demostrar sua capacidade em modular negativamente a expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6 e IL-8 e regular positivamente as citocinas anti-inflamatórias como TGFβ1, IL-4 e IL-10 (DEVI; KURREY; HALAMI, 2018).
A adesão dos Lactobacilos à mucosa ou muco gastrointestinal é importante para a colonização intestinal no hospedeiro, promover a modulação do sistema imunológico do intestino e exercer efeitos inibitórios contra bactérias patogênicas (WATANABE et al., 2010). Sugere-se que uma adesina manose-específica esteja envolvida na capacidade de L. plantarum em colonizar o intestino (KINOSHITA et al., 2008). As pesquisas iniciais com L. mucosae revelaram sua capacidade de aderir ao muco. Em humanos, esta cepa representa uma das subpopulações fortemente associadas à mucosa da microbiota intestinal (VALERIANO et al., 2017). Moraes et al. (2016), identificaram que a cepa L. mucosae CNP007 deste presente estudo possui genes com propriedades de adesão intestinal (msa, map, mub eef-tu).
Com relação as duas espécies em estudo, Lactobacillus plantarum e Lactobacillus mucosae, pesquisas vêm revelando que muitas destas cepas foram
benéficas em melhorar a inflamação intestinal tanto em modelos in vitro e in vivo, seja atenuando os sinais clínicos inflamatórios, modulando a expressão de citocinas importantes da DII, seja reduzindo o estresse oxidativo (MORAES et al., 2016; YU et al., 2016; ŀTOFILOVÁ et al., 2017; LE; YANG, 2018; YOKOTA et al., 2018).
Estudos demonstram que dentro de uma mesma espécie existem cepas com características próprias e mecanismos de ação diferentes, dentre as quais algumas destacam-se mais em relação às suas propriedades anti-inflamatórias intestinais podendo ser usada como potencial candidato probiótico (CHO, et al., 2011, ŀTOFILOVÁ et al., 2017). No estudo realizado por Cho et al. (2011) foram testadas 8 cepas (das espécies: Lactobacillus plantarum, Weissella viridescens, Lactobacillus sakei e Lactobacillus salivarius) para testes in vitro, e, destas, as 5 cepas de LP tiveram os melhores resultados. Escolheu-se as melhores cepas de LP para testar a atividade anti-inflamatória in vivo em modelo de colite induzida por DSS, e, destas 4 cepas de LP, apenas uma (CAU1055) foi capaz de amenizar significativamente a perda de peso corpórea e a redução do comprimento colônico.
A ferramenta de pesquisa mais frequentemente usada para avaliar a gravidade da DII é o Índice de Atividade da Doença (DAI), que consiste em um parâmetro cumulativo utilizado para quantificar a perda de peso corporal, sangramento retal e consistência das fezes (RANDHAWA et al., 2014). No presente estudo, foi possível observar que os sinais clínicos apresentados pela indução da inflamação intestinal pelo DNBS levaram a uma intensa perda de peso, presença de diarreia e sangue fecal. Isso explica o aumento do escore aplicado para esses parâmetros observados no grupo controle DNBS nos dias que seguiram após a indução da inflamação. Em contrapartida, o pré-tratamento com os probióticos e SSZ reduziram o DAI em comparação aos animais não-tratados no primeiro e segundo dias após a indução da inflamação.
Em um estudo semelhante utilizando DSS como indutor da colite em ratos, foi observado um aumento significativo no DAI após a administração do ácido, e, a suplementação com L. plantarum LS/07 por 14 dias aliviou os sinais clínicos como perda de peso, presença de sangue anal e diarreia (ŀTOFILOVÁ et al., 2017). Somado a isto, foi constatado no presente estudo que os pré-tratamentos com os probióticos e com o fármaco padrão SSZ, aumentaram o consumo da ração pelos animais os quais a colite foi induzida, o que pode demonstrar uma melhora no quadro clínico, corroborando com os dados do DAI.
A inflamação intestinal induzida pelo DNBS caracterizou-se macroscopicamente pela formação de uma área extensa de inflamação apresentando necrose, hiperemia e ulceração, representado por um IDM elevado. No entanto, é possível observar que os probióticos e a SZZ se mostraram eficazes em diminuir o IDM, observado pela diminuição do tamanho da lesão intestinal, além da atenuação dos sinais inflamatórios. Além disso, o colón inflamado pela indução com o DNBS, causou espessamento da parede intestinal devido ao edema causado pelo processo inflamatório. Com isso, houve um encurtamento desse cólon e a relação peso/comprimento foi aumentada no controle DNBS. Porém, foi constatado que os probióticos e a SSZ foram capazes de minimizar a inflamação intestinal, por meio da diminuição da relação peso/comprimento do cólon.
Tais relatos também foram observados em alguns estudos recentes. Ŀtofilová et al. (2017), demonstraram que os animais que receberam DSS tiveram uma relação peso/comprimento do cólon e IDM significativamente elevado, onde a mucosa do cólon era edemática e eritematosa, com áreas ocasionais de erosão. A suplementação com L. plantarum LS/07 por 14 dias foi capaz de suprimir o efeito do ácido no aumento do peso/comprimento do cólon. Yokota et al. (2018), observaram que L. plantarum AN1 melhoraram a atrofia do comprimento do cólon e danos nos tecidos da mucosa. Choi et al. (2019) verificaram que a administração oral de 3 cepas de LP (CAU1054, CAU1055, CAU1064) inibiu a perda de peso corporal induzida por DSS, encurtamento do cólon e danos ao cólon em camundongos. Kumar et al. (2015) averiguaram que o LP 21 atenuou o dano colônico macroscópico em ratos induzidos por 2,4,6- trinitrobenzeno (TNBS).
O DNBS é um hapteno, que diluído em etanol é um modelo químico de indução da inflamação intestinal e um dos métodos mais utilizados e convenientes para se estudar a DII por seu baixo custo e rápido desenvolvimento da colite. A administração de etanol é um pré-requisito para quebrar a barreira da mucosa colônica, gerando danos nas células epiteliais intestinais e levando ao aumento da permeabilidade epitelial, para permitir a penetração microbiana na mucosa e a penetração de DNBS na lâmina própria, onde irá então haptenizar o cólon localizado e as proteínas microbianas do intestino os quais se tornam imunogênicos, desencadeando assim respostas imunes inatas (infiltração de neutrófilos, macrófagos) e adaptativas (infiltração de Linfócitos Th1) na mucosa danificada do hospedeiro. No geral, este modelo é associado a diarreia severa e às vezes sangrenta, perda de peso e
espessamento da parede intestinal. O dano causado pelo DNBS se assemelha mais a DC em humanos por gerar uma lesão transmural e uma resposta Th1 (MORAMPUD et al., 2014, JAMWAL; KUMAR, 2017).
Com relação aos mecanismos de ação do L. plantarum, existem poucos estudos a respeito, e ainda não se encontram bem conhecidos. Porém, acredita-se que esteja relacionado a uma modulação da microbiota intestinal e supressão de patógenos. Esses mecanismos foram descritos em alguns estudos in vitro (KIM et al., 2011; SCALDAFERRI et al., 2013). O segundo mecanismo é a imunomodulação da resposta imune das células linfóides e epiteliais associadas ao intestino. A introdução de L. plantarum pode produzir um efeito protetor por intermédio da mediação de células T que incluem Th1 e Th2, estimulando a produção de diferentes citocinas, como TNF-α, interleucina IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12 e interferon-gama (IFN-γ), além do bloqueio da COX-2 como mecanismo de inibição apoptótica (LE; YANG, 2018).
No presente estudo, o DNBS foi eficaz em desencadear respostas imunes inatas e adaptativas do tipo Th1, confirmado pelos altos níveis de TNF-α e IL-1β, citocina pró-inflamatória presente na DII e reduzidos níveis de IL-10, citocina anti- inflamatória, no grupo controle DNBS. O pré-tratamento com os probióticos LM CNPC007 e LP CNPC003 modularam estas citocinas por meio da diminuição dos níveis de TNF-α e IL-1β e aumento da IL-10.
No estudo de Ŀtofilová et al. (2017), o pré-tratamento com o probiótico LP LS/07 não promoveu redução na concentração de citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α e do fator de transcrição NF-κB, quando comparado ao grupo controle DSS. Por outro lado, a concentração de IL-10, foi aumentada. No presente estudo, observamos uma redução das citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1β bem como aumento da expressão da IL-10, o que corrobora com a maioria dos estudos com esta espécie (KUMAR et al., 2015, LE; YANG, 2018, YIN et al., 2018, CHOI et al., 2019), o que indica que a cepa LP CNPC003 possui características fenotípicas mais favoráveis do que a LP LS/07 As condições de cultivo e metodologia do nosso estudo e do estudo de ŀTOFILOVÁ et al foram bastante semelhantes, não sendo plausível considerá-las como motivo das divergências entre os estudos.
Um estudo com macrófagos humanos incubados com E. faecalis e tratados com a cepa Lactobacillus mucosae D detectou uma estimulação da resposta imune inata por meio do aumento da produção de IL-1β. Esta pesquisa difere do presente estudo, o qual demonstra uma diminuição desta citocina pró-inflamatória após
tratamento com o LM. O aumento da produção de IL-1β é importante para a atividade fagocítica da bactéria e na proteção contra patógenos, refletindo a estimulação da imunidade inespecífica (BILKOVÁ; DUBNIčKOVÁ; SEPOVÁ, 2013).
Corroborando com os resultados clínicos e macroscópicos, foi encontrado que o DNBS foi eficaz em gerar uma lesão nas células epiteliais, desencadeando uma infiltração de neutrófilos na lâmina própria, o que pode ser verificado pelos altos níveis de MPO, enzima presente nos grânulos dos neutrófilos, no grupo controle DNBS. O pré-tratamento com os probióticos LP CNPC003 e LM CNPC007 foi eficaz em diminuir a atividade da enzima MPO e reduziu a infiltração de neutrófilos no local da lesão, o que sugere uma diminuição do processo inflamatório intestinal. Em estudo semelhante, o pré-tratamento com Lactobacillus plantarum K68 gerou diminuição nos níveis de MPO e consequente redução da infiltração de neutrófilos em modelo de colite induzida por DSS (LIU et al., 2011).
Os neutrófilos ativados liberam vários mediadores inflamatórios, como ERO, promovendo o estresse oxidativo. O estresse oxidativo foi proposto como um dos principais mecanismos envolvidos na fisiopatologia da DII. Corresponde à superprodução de ERO e espécies reativas de nitrogênio por neutrófilos e macrófagos ativados, gerando um desequilíbrio entre a produção de ERO e atividade antioxidante, resultando uma atividade antioxidante reduzida (BALMUS et al., 2016). Geradas em níveis anormalmente altos, as ERO têm efeitos destrutivos que podem afetar lipídios, proteínas e ácidos nucléicos, gerando morte celular e produtos de fragmentação que podem levar à formação de peróxidos lipídicos e disfunção enzimática. Um dos produtos da peroxidação lipídica é o MDA (PIECHOTA-POLANCZYK; FICHNA, 2014; TIAN; WANG; ZHANG, 2017).
Observou-se que o DNBS gerou um aumento na produção de MDA, o que aponta para um aumento no estresse oxidativo por meio da elevação da produção de radicais livres, os quais causam lesões celulares pela peroxidação lipídica. Os probióticos foram eficazes em reduzir os níveis de MDA no tecido inflamado, demonstrando uma diminuição da peroxidação lipídica e do estresse oxidativo. Em um estudo de metodologia semelhante, porém utilizando outra cepa probiótica, o L. rhamnosus EM1107, mostrou diminuição nos níveis de MDA após o tratamento com a cepa (RODRIGUES et al., 2018).
Yu et al. (2016) selecionou três cepas (Lactobacillus mucosae LMU1001 e Lactobacillus plantarum LPL0902 e LPL0302) para testar seus efeitos antioxidantes
em um modelo de camundongos envelhecidos. Com os resultados, evidencia-se que L. mucosae LMU1001 foi a melhor cepa, apresentando atividade antioxidante observada pela diminuição no nível de MDA no soro. Tais resultados diferiram dos encontrados no presente estudo os quais revelaram que não houve diferença entre as cepas LM e LP ao reduzir os níveis de MDA. Tais divergências podem ter ocorrido devido às diferenças entre as cepas em estudo ou na metodologia utilizada, onde utilizamos dosagem direta no tecido colônico e Yu et al. (2016) utilizaram modelo de camundongo envelhecido, usando soro de camundongo para a dosagem de MDA.
Além do estresse oxidativo e inflamação intestinal, outro fator que pode contribuir para o dano ao tecido colônico é o aumento da permeabilidade intestinal. A barreira epitelial intestinal é formada por componentes que auxiliam nos mecanismos de proteção do TGI, como as mucinas as quais produzem muco protetor e proteínas que fazem parte das junções intercomunicantes entre as células, responsáveis pela adesão celular (TIAN; WANG; ZHANG, 2017).
A camada de muco que reveste o trato gastrointestinal é a linha de frente da defesa inata do hospedeiro. Células caliciformes intestinais sintetizam glicoproteínas de mucina secretora (MUC-2) e mucinas ligadas à membrana epitelial (MUC-1, MUC- 3, MUC-17). Camadas de muco defeituosas por falta de mucina resultam em aumento da adesão bacteriana ao epitélio superficial, aumento da permeabilidade intestinal, e maior suscetibilidade à colite (KIM; HO, 2010, ERMOLENKO et al., 2018).
ZO-1, occludina e claudinas fazem parte de uma família de junções intercomunicantes entre as células, responsáveis pela adesão entre as células epiteliais intestinais (IEC). A ZO-1 liga as proteínas transmembranares OCL e claudina à actina citoesquelética. A expressão destas proteínas demonstrou diminuir a inflamação intestinal da DII. Dessa forma, a permeabilidade intestinal aumentada se correlaciona com a atividade da doença e tem sido demonstrada como um preditor de recaída. Essas proteínas são a chave para manter íntegra a barreira intestinal (PORITZ et al., 2007, LANDY et al., 2016).
O DNBS solubilizado em etanol levou ao rompimento da barreira epitelial intestinal, o que pôde ser observado por meio da infra regulação dos marcadores de integridade de barreira MUC-2 e OCL. O pré-tratamento com a SSZ e os probióticos LP CNPC003 e LM CNPC007 aumentaram a expressão de OCL, indicando sua capacidade em proporcionar uma regeneração da barreira epitelial intestinal, e melhora do quadro inflamatório intestinal, corroborando com os demais resultados até
então apresentados. Porém, apenas a SSZ e o LM CNPC007 foram capazes de aumentar a expressão do MUC-2, podendo-se supor que a cepa LP CNPC003 não esteja envolvida com o aumento da espessura da camada de muco epitelial, apenas com o aumento da adesão à mucosa intestinal.
Estudos imunohistoquímicos mostraram uma redução da imunomarcação acastanhada característica da presença de ZO-1 no grupo controle DNBS. Por outro lado, o pré-tratamento com a SSZ e com os probióticos LP CNPC003 e LM CNPC007 possibilitou um aumento desta marcação indicando uma supra expressão de ZO-1 no tecido colônico, corroborando com o resultado expresso da OCL, o que aponta para uma regeneração do epitélio intestinal danificado pelo DNBS.
Em um modelo de colite induzida por DSS, pôde-se observar que o tratamento com a proteína microtransmembrana integral, uma proteína de membrana do LP, modulou positivamente a OCL e a ZO-1 (YIN et al., 2018). Um estudo realizado em humanos, demonstrou que, no intestino delgado de indivíduos saudáveis, a administração de Lactobacillus plantarum WCFS1 induziu alterações nas junções epiteliais estreitas, resultando em aumento da coloração da proteína ZO-1 e a proteína transmembranar OCL (KARCZEWSKI et al., 2010).
A via de sinalização NF-κB tem grande importância na DII, sendo ativada quando macrófagos intestinais e CD detectam PAMP de microrganismos. Tal ativação resulta na produção de citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas e peptídeos antimicrobianos. A ativação de macrófagos por essas citocinas e quimiocinas desempenha um papel na eliminação direta de patógenos por meio de radicais livres e proteases e também resulta na apresentação de antígenos ao sistema imunológico adaptativo (KIM; CHEON, 2017).
Nossos resultados mostram que o DNBS aumentou a marcação imunohistoquímica do NF-κB, indicando um aumento da atividade desta via de sinalização pró-inflamatória. Em contrapartida, observou-se que a administração da SSZ e dos probióticos LM e LP reduziram a marcação imunohistoquímica no tecido colônico, demonstrando com isso, que os pré-tratamentos foram capazes de minimizar o processo inflamatório intestinal por meio da redução da cascata de sinalização pró-inflamatória da qual o NF-κB participa.
Destaca-se que a ativação da via NF-κB também está relacionada a transcrição de alguns genes essenciais na patogênese da DII: citocinas pró-inflamatórias,
metaloproteínases e enzimas que interferem na estabilidade da barreira via metabolismo de ERO, como a iNOS (TIAN; WANG; ZHANG, 2017).
Dentro da cascata de sinalização da via NF-κB, temos a produção da IL-17, uma citocina pró-inflamatória que ativa o STAT3, e por sua vez estimula uma forte resposta inflamatória imune crônica. Assim, a IL-17 é crítica na patogênese da DII. De fato, os níveis de mRNA da IL-17 foram aumentados na mucosa inflamada de pacientes com DII, tanto na UC quanto na DC. Foi relatado que a IL-17 pode aumentar o recrutamento de células T para a lâmina própria durante a resposta inflamatória (LEE; KWON; CHO, 2018).
As MMP provém de uma grande família de enzimas com especificidade para as várias proteínas do matriz extracelular e estão implicados em processos de remodelação tecidual e condições inflamatórias crônicas. Recentemente, muitos estudos visaram compreender o envolvimento das MMP na homeostase intestinal e suas funções na DII. MMP (MMP-1, -2, -3, -8, -9, -12) foi relatado estarem envolvidas na patogênese da colite induzida em uma variedade de modelos animais. Estudos mostraram que o aumento de MMP correlaciona-se diretamente à atividade do doença (SILOSI et al., 2014).
Corroborando com o resultado encontrado para a via de sinalização NF-κB, a qual eleva a transcrição de citocinas pró-inflamatórias e metaloproteínases, foi detectado um aumento da expressão da citocina IL-17 e da MMP-9 no grupo controle DNBS. Por outro lado, a administração da SSZ e dos probióticos LM CNPC007 e LP CNPC003 gerou uma diminuição da expressão de tais marcadores, indicando redução do processo inflamatório intestinal.
Dando continuidade à cascata de sinalização, tem-se a produção da enzima iNOS, também ativada pela via NF-κB. Tal enzima atua na catalização da reação de formação do NO, um radical livre que interfere na estabilidade da barreira epitelial intestinal (danificando proteínas do citoesqueleto e atingindo as junções comunicantes das IEC) (STROBER; FUSS, 2011, RIBEIRO et al., 2016, TIAN; WANG; ZHANG, 2017).
Os probióticos LP CNPC003 e LM CNPC007 e a SSZ foram capazes de diminuir a expressão de iNOS, e, como consequência, a produção em excesso de NO, gerando uma redução do estresse oxidativo e do processo inflamatório intestinal, corroborando com o resultado do MDA, importante marcador de estresse oxidativo.
A inflamação intestinal causada pelo DNBS gera grande infiltração de leucócitos, predominantemente neutrófilos, perda de cito arquitetura tecidual com destruição do epitélio, redução nas células caliciformes e presença de hemorragias. A SSZ, LM CNPC007 e LP CNPC003 promoveram uma redução da inflamação do cólon, por meio da diminuição da infiltração de neutrófilos, o que corrobora com os resultados que mostraram diminuição dos níveis de MPO no tecido inflamado; maior preservação das células caliciformes, o que vem de acordo com os resultados que demonstraram níveis aumentados de MUC-2; maior preservação da histologia da mucosa, corroborando com os resultados aumentados da OCL e ZO-1, que atua mantendo as células epiteliais intestinais unidas; e, diminuição da quantidade de hemorragias.
Com base nos resultados apontados, pode-se supor um provável mecanismo de ação dos probióticos LP CNPC003 e LM CNPC007 na inflamação intestinal induzida por DNBS em ratos. Os dados apresentados mostram que os probióticos atuaram inicialmente recuperando a barreira epitelial intestinal, protegendo-a dos danos induzidos pelo DNBS como pôde ser observado pelo aumento nos níveis de importantes marcadores de barreira, MUC-2, ZO-1 e OCL.
Dessa forma, a regeneração das células epiteliais intestinais pôde diminuir o influxo de patógenos para o lúmen intestinal, reduzindo a ativação da via NF-κB, e, consequentemente, regulando positivamente citocinas anti-inflamatórias como a IL- 10, e regulando negativamente citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-α, IL-β e IL- 17. A infra regulação da via NF-κB gerou redução da expressão de MMP-9 e iNOS. A diminuição da produção de citocinas pró-inflamatórias puderam atuar na redução da infiltração de neutrófilos e, por conseguinte, os níveis de MPO no tecido inflamado. A diminuição da atividade da MPO, por sua vez, somado com diminuição da expressão