BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
MARÍLIA VIRGO SILVA ALMEIDA
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL PROBIÓTICO DO
LACTOBACILLUS PLANTARUM CNPC003 E
LACTOBACILLUS MUCOSAE CNPC007 EM MODELO
ANIMAL DE INFLAMAÇÃO INTESTINAL
NATAL-RN
2020
MARÍLIA VIRGO SILVA ALMEIDA
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL PROBIÓTICO DO
LACTOBACILLUS PLANTARUM CNPC003 E
LACTOBACILLUS MUCOSAE CNPC007 EM MODELO
ANIMAL DE INFLAMAÇÃO INTESTINAL
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.
Orientadora: Prof. Dra. Gerlane Coelho Bernardo Guerra
Co-orientadora: Prof. Dra. Daline Fernandes de Souza Araújo
NATAL-RN
2020
3
Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB
Almeida, Marília Virgo Silva.
Avaliação do potencial Probiótico do lactobacillus plantarum CNPC003 e lactobacillus mucosae CNPC007 em modelo de inflamação Intestinal em animais / Marília Virgo Silva Almeida. - Natal, 2020.
87 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em
Ciências Biológicas.
Orientadora: Profa. Dra. Gerlane Coelho Bernardo Guerra. Coorientadora: Profa. Dra. Daline Fernandes de Souza Araújo.
1. Inflamação intestinal - Dissertação. 2. Cepas probióticas - Dissertação. 3. Bactérias de ácido lático - Dissertação. 4.
Sulfassalazina - Dissertação. 5. Marcadores inflamatórios - Dissertação. 6. Estresse oxidativo - Dissertação. I. Guerra, Gerlane Coelho Bernardo. II. Araújo, Daline Fernandes de Souza. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título. RN/UF/BSCB CDU 616.34-002
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais Cecília e Dilson, ao meu namorado Rafael, às tias Zezé, Fafa, Dudu e Aninha e à minha prima, Albertânia, que sempre me apoiam e estão sempre ao meu lado torcendo por mim.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à Deus, pela proteção e por guiar meus passos, me mantendo forte nos momentos mais difíceis. À minha família e namorado, por confiarem em mim quando achava que não era capaz, sendo meu porto seguro e de paz.
À minha orientadora Gerlane, que foi como uma mãe me tranquilizando e oferecendo conforto, com sua sabedoria e otimismo, principalmente nos momentos em que acreditava que nada ia dar certo nos experimentos, estava sempre presente e disponível para me auxiliar.
À minha co-orientadora Daline, com sua simpatia e leveza, que desde o início me recebeu de braços abertos, e esteve sempre disponível a me ajudar em tudo o que eu precisei e a tirar todas as minhas dúvidas.
Em vista que o presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de financiamento 001, deixo aqui meus agradecimentos à esta fundação pelo suporte financeiro essencial para a realização deste trabalho.
À todos os meus colegas de laboratório: Nadja, Edilane, Anderson, Manu e aos IC Júlia, Milza e Bruno, que deixavam tudo mais divertido, e, especialmente, à Valéria, que foi meu braço direito nos meus experimentos, sempre disponível desde o início.
Agradeço também ao professor Francisco do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), que nos ajudou em uma fase primordial dos nossos experimentos com os probióticos. Agradeço juntamente à Rômulo, Shirley e Thaís do Departamento de Morfologia da UFRN, indispensáveis para a realização deste trabalho.
À Karina, da Embrapa, que esteve disponível a nos auxiliar com os experimentos envolvendo os probióticos, compartilhando de sua experiência e nos oferecendo todo o apoio possível.
Não poderia deixar de agradecer à toda a equipe do Departamento de Biofísica da UFRN, à Dona Neida, sempre presente e disponível, aos técnicos Flávio e César, por sua prontidão em ajudar e ensinar tudo o que sabiam, ao bioterista Ramon e à técnica Suzanne, ao professor Edilson, coordenador do biotério, e, também, à Seu Raimundo, imprescindíveis para que tudo acontecesse.
Aos meus amigos e companheiros de mestrado: Anne, já minha amiga desde a graduação e à Mara e John, amigos que conquistei por meio do mestrado, por estarem acompanhando de perto a minha evolução e me tranquilizando nos momentos que pareciam impossíveis de atravessar. Não poderia esquecer da Maisie, pessoa maravilhosa que tive o prazer de conhecer, que me acompanhou e me ajudou muito durante a realização da experimentação com os probióticos.
Agradeço também às minhas amigas: Jéssica, Joyce, Viviane, Alessandra, Raissa, Andréia e Karen, que apesar de não estarem presentes no meu dia a dia de experimentos, estavam sempre mandando energias positivas para que tudo desse certo. Sem eles, nada disso teria acontecido. À todos, o meu muito obrigada!
RESUMO
A Doença Inflamatória Intestinal (DII), caracterizada por apresentar uma inflamação crônica não controlada na mucosa intestinal, engloba, principalmente, duas patologias: a Colite Ulcerativa (UC) e a Doença de Crohn (DC). Nestas, o sistema imunológico local permanece cronicamente ativado e o intestino cronicamente inflamado, devido a uma incapacidade de diminuição das respostas inflamatórias. A produção e liberação de espécies reativas de oxigênio (ERO) e citocinas pró-inflamatórias pelos fagócitos desempenham um papel importante na fisiopatologia da DII. Falhas terapêuticas e efeitos adversos do arsenal medicamentoso de escolha, têm incentivado os pesquisadores a estudar alternativas no controle do processo inflamatório intestinal, dentre as quais se incluem as bactérias probióticas. Assim, esta pesquisa teve como objetivo avaliar a atividade anti-inflamatória intestinal do pré-tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 (LP) e Lactobacillus mucosae CNPC007 (LM) em modelo de colite experimental aguda induzida por ácido dinitrobenzenosulfônico (DNBS) em ratos. Desta forma, foram utilizados ratos Wistar fêmeas divididos em 5 grupos experimentais (n=7): Grupo saudável: Saudável (S) que recebeu solução salina; Grupos colíticos: Controle DNBS (DNBS) que recebeu solução salina; e os colíticos tratados com os probióticos: LP, LM e fármaco padrão sulfassalazina (SSZ) na dose 250 mg/kg. Os respectivos pré-tratamentos de cada grupo foram administrados por gavagem durante 17 dias antes da indução da inflamação intestinal. Após os tratamentos, no 17º dia, a colite foi induzida pela administração intracolônica de 30 mg de DNBS (etanol a 50%, v/v) e, então, as administrações foram continuadas até o 19º dia. No 20º dia, setenta e duas horas após a indução, todos os animais foram eutanasiados. Foram avaliados parâmetros macroscópicos, microscópicos, marcadores inflamatórios como mieloperoxidase (MPO), sintase do óxido nítrico induzida (iNOS), metaloproteínase-9 (MMP-9), a via de sinalização fator nuclear kappa B (NF-κB) e as citocinas fator de necrose tumoral-α (TNF-tumoral-α), interleucina-10 (IL-10), interleucina-β (IL-1β), interleucina-17 (IL-17), do estresse oxidativo (malondialdeido) e da integridade de barreira intestinal mucina-2 (MUC-2), zona de oclusão-1 (ZO-1) e ocludina (OCL). O pré-tratamento com probióticos foi capaz de atenuar a severidade do dano colônico provocado pelo DNBS, observado na redução do escore do dano macroscópico (p<0,05 vs. DNBS). Esse efeito foi associado a uma redução na atividade de MPO, MMP-9 e iNOS (p<0,05 vs. DNBS) e nos níveis de citocinas pró-inflamatórias TNF-α, IL-1β e IL-17 (p<0,05 vs. DNBS). Por outro lado, os probióticos aumentaram os níveis colônicos da IL-10, bem conhecida como uma citocina anti-inflamatória. O efeito benéfico dos probióticos na inflamação intestinal induzida pelo DNBS também foi demonstrado pela capacidade de reduzir o estresse oxidativo colônico, observado pela redução de malondialdeido (MDA) (p<0,05 vs. DNBS). Adicionalmente, LP aumentou a expressão de marcadores envolvidos na integridade epitelial como OCL e ZO-1, enquanto LM aumentou a expressão de OCL, MUC-2 e ZO-1 (p<0,05 vs. DNBS). Desta forma, os probióticos LM e LP destacam-se por apresentar um potencial anti-inflamatório intestinal que poderá ser uma alternativa na prevenção da DII.
Palavras-chave: inflamação intestinal; cepas probióticas; bactérias de ácido lático;
ABSTRACT
Inflammatory Bowel Disease (IBD), characterized by presenting an uncontrolled chronic infection in the intestinal mucosa, England, mainly, two pathologies: Ulcerative Colitis (UC) and Crohn's Disease (CD). In these, the local immune system remains actively activated and the chronic intestine is inflamed due to an inability to decrease inflammatory responses. The production and release of reactive oxygen species (ROS) and pro-inflammatory cytokines by phagocytes play an important role in the pathophysiology of IBD. Therapeutic failures and adverse effects on the drug arsenal of choice, encouraged by researchers to study alternative methods of controlling the intestinal inflammatory process, among which they can be used as probiotics. Thus, this research aimed to evaluate the intestinal anti-inflammatory activity of the pretreatment with probiotics Lactobacillus plantarum CNPC003 (LP) and Lactobacillus mucosae CNPC007 (LM) in the experimental colitis model induced by dinitrobenzenesulfonic acid (DNBS) in rats. Thus, Wistar rats were divided into 5 groups of experiments (n = 7): Healthy group: Healthy (S) that received saline solution; Collitic groups: DNBS control (DNBS) that received saline solution; and clinical examinations with probiotics: LP, LM and standard drug sulfasalazine (SSZ) at a dose of 250 mg / kg. The pre-defined tests for each group were administered by gavage for 17 days before induction of intestinal inflammation. After the procedures, on the 17th day, a colitis was induced by intracolonic administration of 30 mg of DNBS (50% ethanol, v / v) and then as continued administrations until the 19th day. On the 20th day, seventy-two hours after induction, all animals were euthanized. Macroscopic, microscopic, inflammatory markers were regulated such as myeloperoxidase (MPO), induced nitric oxide synthase (iNOS), metalloproteinase-9 (MMP-9), a nuclear B signaling pathway (NF-κB) and as a cytokine factor of necrosis-α tumor (TNF-α), interleukin-10 (IL-10), interleukin-β (IL-1β), interleukin-17 (IL-17), oxidative stress (malondialdehyde) and with mucin intestinal barrier integrity -2 (MUC-2), occlusion zone-1 (ZO-1) and ocludine (OCL). Pre-treatment with probiotics was able to attenuate the severity of the colonic damage caused by DNBS, observed in the reduction of the macroscopic damage score (p <0.05 vs. DNBS). This effect was associated with a reduction activity of MPO, MMP-9 and iNOS (p <0.05 vs. DNBS) and in the levels of pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and IL-17 (p <0 , 05 vs. DNBS). On the other hand, probiotics increased electronic levels of IL-10, well known as an anti-inflammatory cytokine. The beneficial effect of the probabilities of DNBS-induced intestinal infection was also demonstrated by the ability to reduce colonic oxidative stress, observed by the reduction in mood disorders (MDA) (p <0.05 vs. DNBS). Additionally, LP increased the expression of markers involved in epithelial integrity such as OCL and ZO-1, while LM increased the expression of OCL, MUC-2 and ZO-1 (p <0.05 vs. DNBS). Thus, the probiotics LM and LP stand out for presenting an intestinal anti-inflammatory potential that can be an alternative in the prevention of IBD.
Key-words: intestinal inflammation; probiotic strains; lactic acid bacteria;
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fatores envolvidos na patogênese da DII ... 19 Figura 2 – Diferenciação das células T-helper (Th) naives em células Th1, Th2 e Th17 ... 23 Figura 3 – Resposta imune na mucosa intestinal inflamada ... 28 Figura 4 - Mecanismo de ação de probióticos na DII ... 38 Figura 5 - Esquema do preparo dos probióticos para administração em modelo experimental com ratos ... 43 Figura 6 - Desenho experimental: colite induzida por Ácido dinitrobenzenosulfônico ... 44 Figura 7 - Efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 no Índice de Atividade da Doença e no consumo de ração ... 55 Figura 8 - Efeito do pré-tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 no Índice de Dano Macroscópico Intestinal e na relação peso/comprimento intestinal ... 56 Figura 9 - Efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 na atividade da Mieloperoxidase e nos níveis de Malondialdeido ... 57 Figura 10 - Efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 nos níveis das citocinas TNF-α, IL-β e IL-10 .... 59 Figura 11 - Efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 nos níveis dos marcadores de integridade barreira MUC-2 e OCL ... 60 Figura 12 - Efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 nos achados histológicos e no dano microscópico colônico em ratos com colite induzida por DNBS ... 61 Figura 13 - Efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 na análise Imunohistoquímica colônica para os marcadores ZO-1 e iNOS ... 63
Figura 14 - Efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 na análise Imunohistoquímica colônica para os marcadores IL-17 e NF-κB ... 64 Figura 15 - Efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 na análise Imunohistoquímica colônica para o marcador MMP-9 ... 65
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Critérios utilizados para definição dos escores de índice de atividade da doença ... 46 Quadro 2 - Critérios utilizados para definição dos escores de severidade do dano macroscópico intestinal ... 47 Quadro 3 - Sequência dos primers dos genes que expressam os marcadores pró-inflamatórios MUC-2, OCL e IL-β ... 50 Quadro 4 - Critérios para classificação dos escores de dano microscópico intestinal e infiltração leucocitária ... 51 Quadro 5 - Critérios para avaliação dos marcadores por imunocoloração ... 53
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
APC Células apresentadoras de antígeno AZA Azatioprina
DAI Índice de atividade da doença DII Doença Inflamatória Intestinal
DC Doença de Crohn
DNBS Ácido dinitrobenzenosulfônico DSS Sulfato de dextrano e sódio DNA Ácido desoxirribonucleico ERO Espécies reativas de oxigênio
GWAS Estudos de associação em todo o genoma IDM Índice de Dano Macroscópico
IL Interleucina
iNOS Sintase do óxido nítrico induzida IFN Interferon
IEC Células epiteliais intestinais LP Lactobacillus plantarum LM Lactobacillus mucosae MPO Mieloperoxidase
MDA Malondialdeído
MMP Metaloproteinase da matriz
mRNA RNA mensageiro
MTX Metotrexato
MUC Mucina
NO Óxido nítrico
NF-κB Fator nuclear kappa B
NOD Receptores gene do domínio de oligomerização de nucleotídeos
OCL Ocludina
P/E Relação peso e comprimento PBS Tampão Fosfato-salino
PCR Reação de Cadeia Polimerase RNA Ácido Ribonucleico
SSZ Sulfassalazina
S Saudável
TLR Receptores do tipo toll-like TNBS 2,4,6- trinitrobenzeno TNF Fator de Necrose Tumoral TGI Trato gastrointestinal Treg Células T reguladoras UC Colite Ulcerativa
UFC Unidades formadoras de colônia
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte ZO-1 Zona de oclusão-1
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 16
2 REVISÃO DA LITERATURA ... 17
2.1 Doença Inflamatória Intestinal – DII ... 17
2.2 Etiopatogênese da DII ... 18
2.2.1 Fatores ambientais e microbioma ... 19
2.2.2 Fatores imunológicos e de barreira ... 21
2.2.2.1 Resposta imune normal ... 22
2.2.2.2 Resposta imune alterada ... 24
2.2.2.2.1 Imunidade inata ... 24 2.2.2.2.2 Imunidade adquirida ... 25 2.2.3 Fatores genéticos ... 29 2.3 Tratamento ... 30 2.3.2 Aminossalicilatos ... 30 2.3.3 Corticosteroides ... 31 2.3.4 Imunomoduladores ... 32 2.3.5 Terapia biológica ... 32
2.3.6 Tratamento complementar: Probióticos ... 33
2.3.6.1 Mecanismos de ação dos probióticos ... 35
2.3.6.2 Lactobacillus mucosae ... 38 2.3.6.3 Lactobacillus plantarum ... 39 3 OBJETIVOS ... 41 3.1 Objetivo geral ... 41 3.2 Objetivos específicos ... 41 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 42
4.1 Obtenção dos probióticos ... 42
4.3 Delineamento Experimental ... 43
4.3.2 Animais ... 43
4.3.3 Desenho Experimental e Indução da inflamação intestinal aguda . 44 4.4 Avaliação do Processo Inflamatório Intestinal ... 45
4.4.2 Avaliação de sinais clínicos: índice de atividade da doença... 45
4.4.3 Avaliação macroscópica ... 46
4.5.1 Determinação do conteúdo de malondialdeído ... 47
4.6 Avaliação de marcadores da inflamação intestinal... 48
4.6.1 Mensuração da atividade de mieloperoxidase ... 48
4.6.2 Dosagem de citocinas: TNF-α e IL-10 ... 48
4.6.3 Análise da expressão do gene de marcadores de integridade de barreira (MUC-2 e OCL) e o marcador inflamatório IL-β, por PCR em tempo real 49 4.7 Avaliação histopatológica ... 51
4.8 Imunohistoquímica: MMP-9, NF-κB; IL-17, ZO-1 e iNOS ... 51
4.9 Análise Estatística... 53
5 RESULTADOS ... 54
6 DISCUSSÃO ... 66
7 CONCLUSÃO ... 75
REFERÊNCIAS ... 76
ANEXO A – Cadastrado das espécies Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 no Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SisGen) ... 86
ANEXO B - Protocolo aprovado pelo Comitê de Ética no uso de animais (CEUA)/UFRN ... 87
1 INTRODUÇÃO
As doenças inflamatórias intestinais (DII) compreendem a doença de Crohn (DC) e a colite ulcerativa (UC), as quais são doenças crônicas que afetam centenas de milhares de pessoas em todo o mundo. São de etiologia desconhecida e caracterizadas por períodos de remissão e de exacerbação. Ambas causam um impacto severo na qualidade de vida dos indivíduos acometidos, afetando sua vida social e profissional, já que a doença se manifesta no período mais produtivo da vida, entre a segunda e quarta década de vida. Sua prevalência vem aumentando significativamente ao longo dos anos, o que tem elevado o interesse da comunidade cientifica pelo tema, e, por conseguinte, o número de estudos publicados sobre a DII, a fim de melhor caracterizá-la e entendê-la, para assim, obter-se tratamentos mais efetivos e viáveis (SAIRENJI; COLLINS; EVANS, 2017).
Por serem doenças crônicas de etiologia desconhecida e sem cura, seu tratamento visa na redução dos sintomas e melhoria da qualidade de vida dos indivíduos acometidos. Porém, os fármacos de escolha utilizados no tratamento dessa enfermidade, como corticoides, anti-inflamatórios e imunossupressores, são sujeitos à falhas e contam com uma gama de efeitos adversos graves (KOZUCH; HANAUER, 2008, CELIBERTO et al., 2015). Desse modo, o estudo de alternativas terapêuticas efetivas na redução dos sintomas inflamatórios se faz interessante, dentre as quais incluem a ingestão de bactérias probióticas, as quais irão funcionar como uma terapia complementar ao tratamento convencional (ABRAHAM; QUIGLEY, 2017).
Dentre os probióticos mais comumente utilizados estão as bactérias do ácido lático (BAL), conhecidas por suas propriedades de adesão ao muco e células epiteliais intestinais, tolerância às condições do TGI, produção de compostos antimicrobianos e estimulação do sistema imune (DICKS; BOTES, 2010). LAB são úteis para seres humanos e animais em muitos aspectos, incluindo prevenção da diarreia, efeitos na intolerância à lactose, atividade antifúngica, papel na prevenção de doenças infecciosas, prevenção de úlceras de estômago, produção de produtos lácteos e preservação de alimentos (MASOOD; QADIR; SHIRAZI; KHAN, 2010).
Dessa forma, o uso de probióticos na DII se sustenta principalmente pela capacidade de modular os componentes da microbiota intestinal, importante fator etiológico da DII, reduzindo o número de bactérias patogênicas e aumentando a
quantidade de bactérias benéficas (SÁNCHEZ et al., 2016). Neste sentido, os probióticos estudados poderão se tornar uma alternativa complementar ao tratamento convencional da DII, promovendo melhoria na qualidade de vida do indivíduo. Em vista disso, essa pesquisa se torna relevante e justificável, pois busca alternativas que visam complementar o tratamento já existente para se obter uma melhora no quadro inflamatório da DII, o qual, como já exposto, é de difícil adequação aos fármacos já existentes.
Dessa forma, este estudo tem como objetivo avaliar o potencial anti-inflamatório intestinal dos probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007, visando ser utilizado como uma alternativa na prevenção de doenças inflamatórias intestinais.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Doença Inflamatória Intestinal – DII
As DII são contemporâneas condições das sociedades industrializadas, onde influências de um estilo de vida ocidental, urbanização e industrialização, como mudanças nos hábitos alimentares e exposição à poluentes estão relacionadas à um aumento na incidência da DII. Embora seja mais prevalente em países desenvolvidos como os da Europa e América do Norte, a prevalência continua a aumentar constantemente nos países ocidentais (KAPLAN; NG, 2017, ABEGUNDE et al., 2016). Desde 1990, a incidência vem aumentando na África, Ásia e América do Sul, incluindo, por exemplo, o Brasil (11% para DC e 15% para UC) (KAMM, 2017). A disseminação global parece estar associada à ocidentalização de dietas e ambientes, que afeta o microbioma intestinal e aumenta o risco de DII em indivíduos geneticamente suscetíveis, com pico de incidência entre a segunda e a quarta década de vida, sem diferença entre homens e mulheres (SAIRENJI; COLLINS; EVANS, 2017). Os dados em torno das raças e etnias são escassos, mostrando a maior incidência para a DC em brancos e judeus, tendo um aumento mais recente nas populações asiáticas e hispânicas (GAJENDRAN et al., 2018).
O diagnóstico é bastante complexo devido à semelhança sintomática com outras patologias, devendo ser realizado por uma combinação de achados, a fim de
se descartar outras doenças e melhor caracterizar a DII, que incluem: histórico do paciente, a sintomatologia da doença, exame físico (apalpação abdominal e exame retal), exames laboratoriais (a calprotectina fecal elevada é sensível de 89% a 98% e específica de 81% a 91% para a DII), exames de imagem (endoscópicos, colonoscópicos, radiográficos) e biópsia, os quais irão demonstrar as características da doença (GAJENDRAN et al., 2018; SAIRENJI, COLLINS, EVANS, 2017).
A DC se caracteriza por uma inflamação transmural, o que significa que pode afetar toda a espessura da parede intestinal, e multifocal, podendo se manifestar em qualquer parte do trato gastrointestinal (TGI), desde a boca até a região perianal. A diarreia (com ou sem sangue) é o sintoma mais comum da DC ativa devido à menor absorção de água e maior secreção de eletrólitos. A febre baixa pode ser uma manifestação do processo inflamatório na DC, enquanto a febre alta geralmente sugere abscesso intra-abdominal ou processo infeccioso (WALLER, 2017). Cerca de 10 a 20% de perda de peso é comum em pacientes diagnosticados com DC devido à diminuição da ingestão oral e má absorção de alimentos (GAJENDRAN et al., 2018).
Diferentemente da DC, a UC gera lesões intestinais contínuas e focalizadas principalmente na região final do cólon e início do reto, acometendo apenas as camadas mais superficiais da parede intestinal (mucosa e submucosa). Os sintomas incluem diarreia com sangue, tenesmo, febre e perda de peso. Ambas as enfermidades podem estar associadas a manifestações extracolônicas, como colangite esclerosante primária, doença hepática autoimune, uveíte, espondiloartrite soronegativa e distúrbios da pele (WALLER, 2017).
2.2 Etiopatogênese da DII
As DII são doenças de etiologia desconhecida, porém, estudos demonstram que provavelmente estão relacionadas à uma combinação de fatores genéticos, ambientais, imunológicos e de barreira. Atualmente, acredita-se que a DII é resultado de uma inflamação intestinal crônica e destruição de tecidos por meio da interação de susceptibilidade genética e impacto ambiental no microbioma, que por meio de uma barreira intestinal enfraquecida, levará à ativação imune intestinal inadequada, e consequente desregulação de moléculas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias (PARK et al., 2017).
Figura 1 - Fatores envolvidos na patogênese da DII
Fonte: Adaptado de Ramos; Papadakis, (2019).
Legenda: Mecanismos envolvidos na patogênese da DII. A patogênese da DII é resultado da interação entre fatores genéticos, ambientais e de resposta imune.
2.2.1 Fatores ambientais e microbioma
Apesar dos avanços genéticos mencionados, apenas cerca de 25% da herdabilidade da DII foi explicada por estudos genéticos (SHOUVAL; RUFO, 2017). Além disso, novas tendências epidemiológicas da DII em países em desenvolvimento após a industrialização sugerem que fatores ambientais podem desempenhar um papel importante na promoção da inflamação intestinal em indivíduos geneticamente suscetíveis (NG et al., 2017).
O tabagismo tem sido um dos fatores mais estudados no cenário da DII. Clinicamente, verificou-se que o cigarro é prejudicial em pacientes com DC, associado a um aumento de risco em 2 vezes, porém, protetor para aqueles com UC (ANANTHAKRISHNAN, 2013). Entre os mais de 4500 componentes químicos na fumaça do tabaco, nicotina, monóxido de carbono e óxido nítrico são os principais moduladores ativos que funcionam no sistema imunológico intestinal e estão envolvidos na Patogênese da DII (TIAN; ZHANG; 2017). O hábito de fumar aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), gerando o estresse oxidativo, o que influencia a função endotelial, afetando a integridade da mucosa colônica, além de alterar a microbiota intestinal (ABEGUNDE et al., 2016, BIEDERMANN et al., 2014).
Além disso, a exposição a dietas ricas em ácidos graxos saturados e carnes processadas tem sido relatada como um fator de risco para DII. Por outro lado, uma dieta rica em fibras demonstrou reduzir o risco de DC em 40%. O metabolismo das fibras alimentares por bactérias do cólon formando ácidos graxos da cadeia curta, que potencialmente possuem propriedades anti-inflamatórias, poderia explicar esse feito protetor (RAMOS; PAPADAKIS, 2019).
Nesse contexto, o consumo de probióticos se faz vantajoso de forma que atuam de maneira semelhante às bactérias residentes da microbiota intestinal, fermentando carboidratos não digeríveis pelo nosso organismo e os transformando em ácidos graxos de cadeia curta, que trazem inúmeros benefícios à saúde humana, podendo ser utilizado como fonte energia, além de melhorar o trânsito intestinal, facilitando a absorção de nutrientes (DELZENNE et al., 2011). São também considerados alimentos benéficos para pacientes com DII, regulando negativamente a síntese de citocinas pró-inflamatórias (como TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8) por meio de uma ativação diminuída de alguns fatores de transcrição nuclear (por exemplo, NF-kB) e diminuição da quimiotaxia de leucócitos e da reatividade das células T (CABRÉ; MAÑOSA; GASSULL, 2012).
O uso de medicamentos, principalmente antibióticos, também tem sido associado ao risco aumentado de DII. Essa associação geralmente resulta de alterações no microbioma intestinal após o uso de antibióticos durante estágios iniciais da vida, quando a microbiota desempenha um papel crítico na formação de células imunes (SHAW; BLANCHARD; BERNSTEIN, 2010). Medicamentos anti-inflamatórios não esteroidais, anticonceptivos e estatinas são outros exemplos de medicamentos que foram associados a um risco dobrado de DC e UC (HASHASH et al., 2015). Estudos correlacionaram a dose alta e a duração de uso prolongada de anti-inflamatórios não esteroidais e aspirina a um risco aumentado de DC e UC (ZHANG, LI; 2014).
O microbioma intestinal foi, há muito tempo, reconhecido por estabelecer a conexão entre o ambiente externo e a mucosa intestinal. A disbiose microbiana, como resultado da diminuição da diversidade do microbioma foi descrita em pacientes com DII. Porém, ainda não está claro se essa é a causa ou consequência da DII. Em pacientes com alta prevalência de DII, há uma diminuição de bactérias com capacidade anti-inflamatória e aumento de bactérias com capacidade inflamatória em comparação com indivíduos saudáveis (ZHANG, LI; 2014, TOMASELLO et al., 2016).
Foi relatado que a diminuição no número de bactérias produtoras de ácidos graxos de cadeia curta (por exemplo, Faecalibacterium prausnitzii) em pacientes com DII, afeta a diferenciação e expansão de Células T Reguladoras (Tregs), bem como crescimento de células epiteliais. O aumento de proteobactérias, principalmente Escherichia coli, com a capacidade de aderir ao epitélio intestinal afeta a permeabilidade do intestino, altera a diversidade e composição da microbiota e induz respostas inflamatórias regulando a expressão de genes inflamatórios (DOLAN; CHANG, 2016).
É provável que mudanças na dieta, higiene, exposição a antibióticos e outros medicamentos, poluentes e toxinas ambientais tenham alterado significativamente a microbiota intestinal humana moderna e, com ela, os mecanismos de tolerância imunológica mediados por bactérias, em comparação com a de nossos ancestrais, principalmente nos países desenvolvidos (ABEGUNDE et al., 2016; HENRICK et al., 2018).
2.2.2 Fatores imunológicos e de barreira
O intestino é a maior área de superfície em contato com o meio ambiente e, portanto, desempenha um papel importante na defesa contra infecções. A principal função do intestino é permitir seletivamente a absorção de nutrientes, evitando simultaneamente a invasão de patógenos (HALLORAN; UNDERWOOD, 2019).
A imunidade da mucosa intestinal, especialmente a resposta das células T, foi estudada extensivamente na patogênese da DII. O TGI normal é controlado por uma resposta imunológica normal, em que o sistema imune age com relação às bactérias do lúmem intestinal determinando uma tolerância imunológica ou uma reação imunológica defensiva. No intestino normal, a microbiota estimula a renovação epitelial, reparo e respostas antibacterianas. Falhas nesses mecanismos de defesa somando com predisposição genética e elevado fator de risco ambiental pode resultar na origem da DII. Somado a isso, a regulação imune falha em diminuir a resposta inflamatória (SCALDAFERRI; FIOCCHI, 2007).
O sistema imunológico é classificado em sistema imune inato e adaptativo. O sistema imunológico inato está na vanguarda da defesa contra patógenos externos no sistema imunológico humano, fornecendo proteção rápida e inespecífica ao hospedeiro por meio do reconhecimento de patógenos, enquanto o sistema
imunológico adaptativo medeia uma imunidade altamente seletiva e duradoura (KIM; CHEON, 2017).
2.2.2.1 Resposta imune normal
O primeiro componente do sistema imunológico intestinal responsável por sua defesa é a barreira intestinal que protege o intestino por meio da sua permeabilidade, não permitindo que microrganismos penetrem nela. É constituída por células epiteliais intestinais (IEC) e células imunes inatas que mantém o equilíbrio entre o conteúdo luminal e a mucosa. A IEC consiste em várias células diferentes, incluindo enterócitos, células caliciformes (produtoras de mucinas, muco protetor essencial para a defesa e reparo da mucosa), células neuroendócrinas, células Paneth (as quais residem na base das criptas do intestino delgado e são responsáveis pela homeostase da cripta, manutenção das células intestinais e secreção de antimicrobianos - defensinas), células M e células-tronco intestinais. Possuem também, as zonas de oclusão, proteínas que ficam entre as IEC mantendo-as unidas e impedindo a e entrada de patógenos (HALLORAN; UNDERWOOD, 2019, TIAN; WANG; ZHANG, 2017, MICHIELAN; D’INCÀ, 2015).
Além da barreira intestinal formada pelas IEC, o sistema imunológico inato do intestino é composto por macrófagos, monócitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, células dendríticas (CD) e células NK. Patógenos intraluminais se comunicam continuamente com células imunes inatas por meio de diversos receptores imunes inatos, como receptores toll like (TLR) e receptores gene do domínio de oligomerização de nucleotídeos (NOD) (SCALDAFERRI; FIOCCHI, 2007). É por intermédio desse reconhecimento, que tais células de defesa realizam seu efeito protetor, onde detectam padrões moleculares associados a patógenos (PAMP) de microrganismos, e consequentemente, ativam vias de sinalização, como NF-kB, produzem citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas e peptídeos antimicrobianos. Em condições não inflamatórias, a sinalização de TLR leva à tolerância a patógenos luminaispor meio da regulação negativa dos receptores de reconhecimento de padrões e promove a cicatrização de mucosas (KIM; CHEON, 2017).
A ativação de macrófagos por citocinas e quimiocinas desempenha um papel na eliminação direta de patógenos por intermédio de radicais livres e proteases e também resulta na apresentação de antígenos ao sistema imunológico adaptativo. As
células apresentadoras de antígeno (APC), como CD e macrófagos, têm um papel fundamental na conexão do sistema imunológico inato e adaptativo (KIM; CHEON, 2017). Tais células apresentadoras de antígenos apresentam patógenos intraluminais para as células T, que se diferenciam em células T CD8 ou citotóxicas, com a principal função de secretar grânulos tóxicos contra os patógenos invasores ou células T CD4 ou auxiliares, que modulam as respostas imunes, ativando células B produtoras de anticorpos (SCALDAFERRI; FIOCCHI, 2007).
Além disso, as citocinas e quimiocinas modulam, nos órgãos linfóides secundários do intestino, a diferenciação das células T CD4 + naives nas células Treg e células T auxiliares, incluindo Th1, Th2 e células Th17. Tais padrões celulares, são gerados pela modulação de um grupo de citocinas específicas, e, por sua vez, estimulam a produção de mais citocinas, gerando um grande ciclo autossustentável (STROBER; FUSS, 2011).
Figura 2 – Diferenciação das células T-helper (Th) naives em células Th1, Th2 e Th17
Fonte: Dave, Papadakis e Faubion (2014).
Legenda: Diferenciação de células T-helper (Th). As células T naives se diferenciam em três tipos principais de células Th efetoras (Th1, Th2 e Th17). O fenótipo funcional final das células T efetoras maduras depende do tipo e quantidade de antígeno e do meio de citocinas presentes no momento da ativação. As APC, ao apresentar antígeno para a célula Th naive em um ambiente contendo IL-12 e IFN-y, se diferencia em células Th1 com produção de IFN-y. Já em um ambiente contendo IL-4, se diferencia em uma resposta Th2 específica, com produção de IL-4, IL-5 e IL-13. Por outro lado, em um ambiente formado por IL-6 e TGF-β, ocorre a diferenciação em células Th17 com aumento da produção de IL-17, IL-21, IL-22 e IL-26. APC: célula apresentadora de antígeno; IL: interleucinas; TGF-β: fator de crescimento transformador-β.
2.2.2.2 Resposta imune alterada
2.2.2.2.1 Imunidade inata
Falhas nos mecanismos de defesa intestinais mencionados acima, podem gerar a DII. Quando a integridade da camada epitelial intestinal é rompida, acredita-se que um alto influxo de conteúdo intestinal e/ou uma alta carga de microrganismos iniciem e mantenham uma resposta inflamatória sustentada, que é considerado um dos mecanismos subjacentes à DII (SARTOR et al., 2006).
Na DII, foram relatados achados de alteração da permeabilidade intestinal em pacientes com DC e alguns de seus parentes de primeiro grau. Além disso, a análise de biópsias intestinais de pacientes com DC revelou uma regulação negativa da caderina epitelial da proteína juncional (ZO-1), que compreende as junções estreitas intestinais (RAMOS; PAPADAKIS, 2019). Experimentos demonstraram que a colite espontânea se desenvolve após mutação no gene MUC2 em camundongos, possibilitando a diminuição na produção de mucina, sendo a depleção de células caliciformes e uma camada reduzida de muco, achados característicos em pacientes com UC. Além disso, alterações genéticas ou estresse do retículo endoplasmático que causam disfunção ou depleção das células de Paneth resultam em disbiose da microbiota comensal e aumento da suscetibilidade à inflamação intestinal (KASER; ZEISSIG; BLUMBERG, 2010).
Defeitos nos receptores de reconhecimento de antígenos invasores, como o gene do domínio de oligomerização de nucleotídeos 2 (NOD2) e TLR, leva a uma falha nesse reconhecimento, e, consequentemente, uma falha na resposta defensora de muitas células intestinais que possuem esse receptor, gerando aumento da permeabilidade intestinal. Estudos genéticos mostraram a associação entre DC e o NOD2 (KIM; CHEON, 2017). Defeitos no NOD2 por exemplo, pode levar ao não reconhecimento de patógenos pelas células de Paneth, o que leva a não produção de defensinas e função antimicrobiana prejudicada (RAMOS; PAPADAKIS, 2019).
Indivíduos com DC apresentam respostas imunes inatas defeituosas, incluindo macrófagos atenuados e recrutamento de neutrófilos comprometidos, facilitando a passagem de microrganismos pelo interior da mucosa (SMITH, RAHMAN, HAYEE; 2009). Com o influxo de patógenos para o lúmen intestinal, diversas células do sistema imune inato (neutrófilos, monócitos, macrófagos, CD e até células não imunes, como
células epiteliais e células estromais) começam a produzir citocinas pró-inflamatórias, como interleucina IL-1, IL-6, IL-18, fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), membros da família IL-12 (IL-12, -23, - 27, -35), interferon (IFN)-α e IFN-β após sinalização de TLR ativado e reconhecimento dos PAMP (PARK et al., 2017).
2.2.2.2.2 Imunidade adquirida
Além da imunidade inata, a imunidade adaptativa consistindo em imunidade humoral, células T efetoras, Treg, células natural killer e células linfóides inatas também revelaram produzir moléculas inflamatórias envolvidas nas patogenias da DII (PARK et al., 2017). As células T envolvidas nas respostas imunes dessas doenças, no entanto, parecem ser diferentes, o que pode explicar fenotipicamente diferenças observadas na prática clínica, bem como resposta a novas terapias direcionadas (RAMOS; PAPADAKIS, 2019).
A resposta imune da mucosa gastrointestinal dos pacientes com DC é basicamente realizada por linfócitos T CD4+ com fenótipo Th1, caracterizado pela produção de IFN-γ e IL-2, que ativam predominantemente os linfócitos T citotóxicos e macrófagos, os quais produzem citocinas pró-inflamatórias como TNF-α e IL-1β. Por outro lado, a resposta imune em pacientes com UC é realizada por linfócitos T CD4+ com fenótipo Th2, caracterizado pela produção de fator de crescimento transformador beta (TGF-β) e IL-5 as quais promovem o aumento da produção de IL-4, IL-5 e IL-6 que favorecem a imunidade humoral, estimulando a proliferação e diferenciação de linfócitos B e a consequente produção de anticorpos. No entanto, em geral, a concentração de citocinas pró-inflamatórias é elevada na lâmina própria da mucosa intestinal de pacientes com DII em atividade. Por exemplo, existe a produção espontânea de TNF-α por células mononucleares da lâmina própria da mucosa intestinal de pacientes com DII ativa em comparação com a mucosa normal (ZHANG, LI; 2014, STROBER; FUSS, 2011).
Na DC, a diferenciação dos tipos de células Th1 e Th17 ocorre em resposta à produção de IL-12, IL-18, IL-23 e TGF-β por APC e macrófagos. Por sua vez, as células Th1 e Th17 secretam citocinas pró-inflamatórias IL-17, interferon gama (IFN-ϒ) e TNF-α que alimentam um ciclo de amplificação autossustentável por meio do qual estimulam APC, macrófagos, fibroblastos e células endoteliais para produzir, TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 e IL-18 (NANAU, NEUMAN; 2012).
O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória produzida por macrófagos, monócitos e linfócitos T ativados, a qual induz a produção de outras citocinas pró-inflamatórias, promove a morte de células epiteliais intestinais e células de Paneth. Mostrou-se que amostras intestinais de pacientes com DC apresentam níveis aumentados de proteína TNF-α e expressão de RNA mensageiro (mRNA). Um estudo experimental revelou que a inibição desta citocina foi capaz de melhorar a colite induzida por sulfato de dextrano de sódio (DSS) em camundongos. Portanto, acredita-se que o TNF-α desempenhe um papel fundamental no desenvolvimento da DII (KIM; CHEON, 2017).
Ressalta-se ainda que a via de sinalização Fator nuclear kappa B (NF-κB) é uma importante via da DII, uma vez que modula a produção de citocinas e moléculas inflamatórias. TLR ativados por estimulação microbiana e TNF-α reconhecidos pelas IEC estimulam eventos de sinalização NF-κB. A ativação de NF-κB pode elevar a transcrição de cinco tipos de genes essenciais na patogênese da DII: primeiro, citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-6, IL-8, IL-16 e TNF-α; segundo, genes que modulam a sobrevivência e a propagação celular, como o modulador de apoptose, regulado por p53, cuja regulação positiva por NF-κB provoca apoptose de células epiteliais e contribui para o desenvolvimento da UC; terceiro, genes associados à permeabilidade da barreira intestinal, por exemplo, a quinase da cadeia leve da miosina, que é regulado pela ativação de NF-κB induzida por TNF-α e leva à degradação da miosina na barreira intestinal; quarto, metaloproteinases, que podem digerir células da mucosa e também são desencadeadas por TNF-α; e quinto, enzimas, incluindo ciclooxigenase-2 (COX-2) e óxido nítrico sintase induzível (iNOS), que ativam NF-κB e interferem na estabilidade da barreira via metabolismo de ERO (STROBER; FUSS, 2011, TIAN; WANG; ZHANG, 2017).
Além da resposta Th1 na DC, também está presente a resposta Th17. As células Th17 produzem níveis mais altos de citocinas associadas às células Th17, como IL-17A e IL-17F, em resposta a níveis elevados de IL-6 e IL-23 após estimulação pela microbiota. Foi relatado que essas citocinas Th17 causam graves danos epiteliais, recrutando neutrófilos e estimulando fibroblastos para secretar mais metaloproteinase da matriz (MMP) por intermédio do aumento dos níveis de 1β, IL-6, IL-8 e TNF na DC (PARK et al., 2017).
Duas outras citocinas importantes na DII são a IL-10 e a IL-1β. Defeitos na função da IL-10 também foram associados com DC e UC (ZHANG, LI; 2014). A IL-10 é uma citocina anti-inflamatória produzida pelas células Treg, e induz a proliferação
de células Treg por meio da ativação do fator de transcrição STAT3. No caso da IL-1β, também foi encontrado um nível elevado na DII, onde verificou-se que ela inicia a inflamação do cólon recrutando granulócitos e ativando IL-17A, secretando células linfoides inatas e células CD4+ Th17 (GEREMIA et al., 2014). A IL-1β, em particular, foi recentemente descrita por promover o crescimento tumoral, aumentando a secreção de IL-6 dependente de macrófagos, que ativa a sinalização STAT3 (MOAYYEDI et al., 2015).
Os fibroblastos na DC foram descritos por expressar níveis elevados de inibidor tecidual da metaloproteinase-1 (TIMP-1), o que impede a MMP de degradar a matriz extracelular. Pensa-se que isso, juntamente com a migração reduzida de fibroblastos na DC, represente fibrose mais pronunciada na DC do que a UC. Devido à atividade aumentada de fibroblastos na prevenção da degradação pelas MMP, altos níveis compensatórios de MMP também foram observados na DII. De fato, tanto a MMP-1 quanto a MMP-2, que degradam principalmente as fibras de colágeno, foram mais expressas em DC. Além disso, expressões elevadas de MMP-3 e MMP-9 na DC também foram identificadas como associadas ao aumento das formações de fístula (PARK et al., 2017).
Na DC, observou-se diminuição na população de células Treg e aumento no número de células T efetoras, sugerindo que as células Treg são importantes supressores da colite mediada por Th1 (PARK et al., 2017). Nesse cenário, os Tregs têm uma função importante não apenas na restrição de efeitos de populações de células T, mas também no controle de mecanismos inflamatórios inatos, tendo sido proposto como uma estratégia alternativa para controlar a inflamação excessiva em DII (MALOY, POWRIE; 2011).
Durante a inflamação da mucosa, as IEC, assim como os neutrófilos e macrófagos, produzem algumas ERO e espécies reativas de nitrogênio como o óxido nítrico, por meio da ativação de iNOS, induzidos por citocinas inflamatórias. Essa sobrecarga de ERO pode danificar proteínas do citoesqueleto e levar a alterações nas junções estreitas e na permeabilidade epitelial nas IEC, auxiliando o rompimento da barreira epitelial intestinal e na iniciação da DII. A própria produção de espécies reativas, por sua vez, estimula a produção de TNF-α no cólon, o que causa infiltração de neutrófilos (por exemplo, por meio da ativação e atuação da molécula de adesão intercelular (ICAM) e produção de P-selectina, causando danos do tecido colônico). O recrutamento de neutrófilos por sua vez, gera a ativação de importantes vias
transcricionais, incluindo o NF-κB e AP-1, que também aumentam a resposta inflamatória e dano tecidual (KOLIOS; VALATAS; WARD, 2004, TIAN; WANG; ZHANG, 2017).
Figura 3 – Resposta imune na mucosa intestinal inflamada
Fonte: RIBEIRO et al., (2016)
Legenda: Imunopatologia da DII: Acredita-se que hajam alterações dos genes dos receptores de reconhecimento de patógenos Toll like (TLR2 e TLR4), que, somado à numa perda de tolerância imunológica, onde o nosso sistema imune passa a ver as bactérias da microbiota como patogênicas e exercer respostas imunes contra elas, leva a uma disbiose intestinal, ou seja, uma desregulação entre as bactérias patogênicas e da microbiota intestinal. Isto gera respostas imunológicas e inflamatórias exacerbadas, levando a apoptose das células epiteliais intestinais com diminuição das células caliciformes e das junções intercelulares. Com isso, há diminuição na produção de mucinas e defensinas que protegem e fazem parte da barreira protetora intestinal, gerando aumento da permeabilidade intestinal e culminando no influxo de bactérias patogênicas para o lúmen intestinal. Há uma migração de células inflamatórias da imunidade inata inicialmente, especialmente as APC e os macrófagos, os quais ativados, aumentam os níveis de citocinas inflamatórias, perpetuando o processo inflamatório. Posteriormente, há a ativação de células T imaturas na diferenciação de uma resposta Th específica, geralmente Th1 para DC e Th2 para UC. Há também infiltração de neutrófilos que estão associados à progressão e gravidade da DII.
2.2.3 Fatores genéticos
Avanços na análise e sequenciamento de DNA nas últimas décadas têm levado à contribuições iniciais a respeito da DII. Pesquisas vêm sendo feitas e vêm demonstrando a presença de alguns loccus gênicos de susceptibilidade à essas doenças, além da presença da agregação familiar e herdabilidade.
A agregação familiar da DII já é bem reconhecida, sendo a DC mais provável a possuir tal componente herdável, com uma taxa de concordância em gêmeos monozigóticos de 30% a 58% em DC, em comparação com 10% a 15% na UC (KHOR; GARDET; XAVIER, 2011). Até 15% dos pacientes com DC relatam história familiar de DC, enquanto uma pequena proporção desses pacientes relata história familiar de UC (GAJENDRAN et al., 2018). O risco relativo de desenvolvimento da doença em parentes de primeiro grau de pacientes com DII pode ser até 5 vezes superior do que em indivíduos não afetados (RAMOS; PAPADAKIS, 2019).
A maioria das informações relacionadas à genética da DII foi obtida por meio de estudos de associação em todo o genoma (GWAS). A base conceitual de GWAS é que desordens genéticas complexas como DII são poligênicas, sendo movidas por múltiplos polimorfismos genéticos comuns (MCGOVERN, KUGATHASAN, CHO; 2015). Estudos de Meta-análise combinando dados do GWAS identificaram 201 loccus gênicos associados à DII. Entre esses, existem 41 específicos para DC e 30 para UC. No entanto, aproximadamente 137 dos 201 (68%) estão associados tanto a DC como para UC, indicando que essas doenças compartilham vias inflamatórias comuns (LIU et al., 2015); (JOSTINS et al., 2012).
Pesquisadores encontraram alguns loccus gênicos de susceptibilidade às essas doenças, sendo o NOD2 o primeiro gene a ser associado a DII, o qual codifica uma proteína de reconhecimento de antígenos bacterianos (ZHANG, LI; 2014); (ABRAHAM; AHMED; ALI, 2017).
Na DC, o gene NOD2/CARD15 foi associado a envolvimento ileal, doença fibrostenótica, idade de início mais precoce e histórico familiar. Pacientes portadores desses genes heterogêneos têm 2 a 4 vezes maior risco de desenvolver DC, enquanto aqueles com alelos homogêneos têm 20 a 40 vezes risco aumentado de desenvolver DC (GAJENDRAN et al., 2018).
Estudos recentes mostraram relações entre uma variedade de polimorfismos de nucleotídeo único e riscos para desenvolver DII: detecção microbiana (NOD2,
IRF5, NFKB1, RELA, REL, RIPK2, CARD9 e PTPN22), eliminação microbiana (ATG16L1, IRGM e NCF4) e integração de respostas imunes adaptativas antimicrobianas (IL23R, IL10, IL12, IL18RAP/ IL1R1, IFNGR / IFNAR1, JAK2, STAT3 e TYK2) (CHO, BRANT. 2011).
2.3 Tratamento
Por se tratarem de doenças crônicas, de etiologia desconhecida e sem cura, o seu tratamento visa na redução dos sintomas, minimizar a progressão e complicações da doença e melhora da qualidade de vida dos indivíduos acometidos. Devido à sua característica recidivante composta por períodos de remissão e de exacerbação (doença ativa), as decisões de tratamento começam com a determinação da gravidade da doença, a qual pode estar ativa ou em remissão. No caso de doenças ativas, é necessário o uso de medicamentos para induzir a remissão. Após a resolução da doença ativa é seguida pela terapia de manutenção da remissão, que tem como objetivo evitar complicações em longo prazo e maximizar o bem estar do paciente. O grau de envolvimento do cólon também desempenha um papel na escolha do medicamento e no método de entrega (KOZUCH; HANAUER, 2008).
A terapia atual consiste no uso de 5-aminosalicilatos (5-ASA), corticosteroides, imunossupressores e agentes biológicos (CELIBERTO et al., 2015). Os fármacos mais utilizados para induzir a remissão incluem os corticosteroides e os inibidores do TNF. Já os relacionadas a manutenção da remissão, estão o ácido 5-aminosalicíclico, os imunossupressores (azatioprina, 6-mercaptopurina, metotrexato) e, também, inibidores do TNF. Nos casos mais graves, os quais incluem perfurações, obstruções e abscessos intestinais, o tratamento cirúrgico passa a ser necessário, os quais incluem: ressecção intestinal, estruroplastia ou drenagem de abscesso (TRIANTAFILLIDIS, 2011).
2.3.2 Aminossalicilatos
O constituinte anti-inflamatório ativo de todos os aminosalicilatos é o ácido 5-aminosalicílico (5-ASA). Todos os diferentes compostos são projetados para fornecer 5-ASA ao lúmen do cólon. A sulfassalazina, uma combinação de 5-ASA e sulfapiridina, foi o primeiro aminosalicilato que demonstrou ser eficaz no tratamento da DII. Os
mecanismos de ação dos aminossalicilatos não são claros, mas podem envolver a inibição da quimiotaxia de leucócitos, reduzindo a produção de citocinas, radicais livres e inibição da produção de mediadores inflamatórios lipídicos (como prostanóides, leucotrienos e fator de ativação de plaquetas) (WALLER, 2017).
O tratamento com 5-ASA é eficaz tanto na indução da remissão quanto na manutenção em pacientes com UC leve a moderada, sendo considerada terapia de primeira linha, seguro e geralmente bem tolerado (DUIJVESTEIN et al., 2018); (SU et al., 2019). Apenas a sulfassalazina, mas não a mesalazina ou seus derivados, mostrou-se modestamente eficaz na indução da remissão, mas não na terapia de manutenção na DC (DUIJVESTEIN et al., 2018).
Os efeitos adversos comuns do 5-ASA incluem flatulência, dor abdominal, náusea, diarreia, dor de cabeça, dispepsia, nasofaringite e agravamento da UC (WANG et al., 2016). O dano renal (NIKNAHAD et al., 2017) e hepático é um sério efeito adverso como observado em muitos estudos utilizando modelos animais (HEIDARI et al., 2016, HEIDARI et al., 2015).
2.3.3 Corticosteroides
Os corticosteroides são utilizados há mais de 60 anos com o primeiro ensaio clínico realizado em 1954 pelos Drs. Truelove e Witts demonstrando benefício na UC. Pensa-se que o modo de ação decorra de sua capacidade de modular a resposta imune por meio da interação com receptores de glicocorticoides no núcleo celular, que inibem a expressão de moléculas de adesão e o tráfego de células inflamatórias no intestino (ABRAHAM; AHMED; ALI, 2017), sendo a supressão de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α e IL-1β, o principal mecanismo subjacente ao modo como os corticosteroides controlam a DII (FLAMMER, ROGATSKY; 2011).
As formulações de corticosteroides, compostas por glicocorticosteróides convencionais (prednisona e prednisolona) e de segunda geração (por exemplo, budesonida) são agentes de indução da remissão eficazes. Embora os de segunda geração tenham um melhor perfil de segurança e tolerabilidade, o uso prolongado de corticosteroides convencionais ou budesonida não é recomendado, devido à gama de efeitos adversos graves (DUIJVESTEIN et al., 2018).
Alguns dos primeiros efeitos adversos observados incluem acne, edema corporal, distúrbios do sono e do humor e intolerância à glicose. Com o uso prolongado
(geralmente maior que 12 semanas), alguns dos efeitos adversos mais graves incluem catarata, osteoporose, osteonecrose da cabeça femoral, miopatia, risco de infecções oportunistas e desenvolvimento de diabetes. Alguns estudos mostram pequeno risco de fissura labial/palatina em bebês de mães expostas a esteroides no primeiro trimestre de gravidez (ABRAHAM; AHMED; ALI, 2017).
2.3.4 Imunomoduladores
O uso de imunomoduladores 6-mercaptopurina, azatioprina (AZA) e metotrexato (MTX) têm sido parte integrante do tratamento da DII, pois eles funcionam como agentes poupadores de esteroides na manutenção da remissão. Da mesma forma, sua aplicação aumentou com o advento da terapia biológica, pois seu uso combinado demonstrou aumentar a eficácia dos agentes anti-TNF, além de diminuir a imunogenicidade (COLOMBEL et al. 2010).
AZA e 6-mercaptopurina foram usados por mais de 40 anos para tratar DII e são eficazes tanto para indução como para manutenção da remissão. No entanto, o lento início de ação da terapia com tiopurina impede seu uso como única terapia para doenças ativas. O MTX está bem estabelecido como uma indução eficaz e terapia de manutenção para pacientes com DC (embora com taxas de abstinência de 17% devido a eventos adversos, principalmente náusea) e poderia ser uma alternativa, especialmente para pacientes intolerantes à tiopurina. Não há boas evidências para apoiar o uso de MTX na UC (SU et al., 2019); (DUIJVESTEIN et al., 2018).
Para terapia de manutenção, a AZA pode ser usada em pacientes que não aceitam aminosalicilatos. AZA e MTX podem diminuir as internações, promover cicatrização da mucosa e limitar a necessidade de cirurgia. Radiografia de tórax, hemograma completo e enzimas hepáticas devem ser solicitadas antes do início da terapia, pois o MTX pode causar pneumonite, supressão da medula óssea e insuficiência hepática (SAIRENJI, COLLINS, EVANS, 2017).
2.3.5 Terapia biológica
A terapia biológica inaugurou uma nova era para a DII. Os principais biológicos são os anti-TNF, já em desenvolvimento por mais de 20 anos. O bloqueio do TNF impede a produção de outras citocinas pró-inflamatórias como IL-1 e IL-8. Quatro
anti-TNF são aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento de DII, 3 em DC (infliximabe, adalimumabe, certolizumabe) e 3 em UC (infliximabe, adalimumabe, golimumabe). Todos, exceto o certolizumab, são moléculas de imunoglobulina G (IgG) que se ligam ao TNF-α solúvel. O certolizumabe é o fragmento Fab da imunoglobulina (que se liga ao TNF-α) ligado a uma molécula de PEG que melhora sua meia-vida (ABRAHAM; AHMED; ALI, 2017).
Os antagonistas do TNF melhoraram bastante o gerenciamento da doença e são eficazes tanto na terapia de indução quanto na manutenção da remissão, diminuem a exposição aos corticosteroides e promovem a cicatrização mucosa. No entanto, até um terço dos pacientes não respondem à terapia de indução da remissão e, dos que respondem inicialmente, até 40%, perdem a resposta devido à exposição subótima ao medicamento (por exemplo, causada por imunogenicidade ou alta depuração do medicamento), intolerância ou outras condições inadequadas (DUIJVESTEIN et al., 2018).
Embora os antagonistas do TNF-α tenham dominado o tratamento de DII nas últimas décadas, o advento de novos produtos biológicos, como anti-integrinas e antagonistas de IL-12/IL-23, oferecem novas alternativas (DUIJVESTEIN et al., 2018). Terapias biológicas baseadas em anticorpos monoclonais e proteínas de fusão têm atraído a atenção, no entanto, por questões de segurança, alto custo e perda de eficácia, as terapias convencionais continuam sendo a base do tratamento para maioria dos pacientes (SU et al., 2019; COHEN; SACHAR, 2017).
2.3.6 Tratamento complementar: Probióticos
O TGI de mamíferos hospeda um número alto e diversificado de microrganismos, conhecidos como microbiota intestinal. Muitos probióticos foram originalmente isolados do TGI, e foram definidos pela Food and Agricultural Organization da World Health Organization como microrganismos vivos que quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde do hospedeiro (QUIGLEY, 2019). Grande parte dos probióticos são obtidos da microbiota comensal no intestino humano saudável e suas propriedades se assemelham aos efeitos homeostáticos desses microrganismos, sendo vários relevantes para a DII (ABRAHAM; QUIGLEY, 2017).
Considerando que vários estudos previamente publicados demonstraram a participação de fatores ambientais, como alterações na microbiota, como um importante causador da DII, a microbiota intestinal agora está sendo explorada como fonte e alvo para novas terapias para essas doenças. Dessa forma, os probióticos vêm sendo amplamente utilizados por pacientes com DII e frequentemente recomendados por seus médicos, geralmente como terapia adjuvante (ABRAHAM; QUIGLEY, 2017).
Os microrganismos probióticos mais comumente usados na nutrição humana são linhagens pertencentes ao gênero Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, bem como linhagens do gênero Propionibacterium e certas leveduras como Saccharomyces boulardii, sendo as espécies de Lactobacillus e Bifidobacterium as principais bactérias probióticas produtoras de ácido lático utilizadas atualmente (SÁNCHEZ et al., 2016).
As LAB são definidas como bactérias que produzem ácido lático como seu principal produto de fermentação. Esse grande grupo inclui Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Bifidobacterium e Leuconostoc. LAB são consideradas seguras e estão amplamente distribuídas na microbiota intestinal de vários animais. O maior gênero nesta ordem é Lactobacillus que contém quase 80 espécies (MASOOD; QADIR; SHIRAZI; KHAN, 2010, GUARNER et al., 2017).
LAB possuem propriedades de adesão ao muco e células epiteliais intestinais, tolerância às condições do TGI, produção de compostos antimicrobianos e estimulação do sistema imune (DICKS; BOTES, 2010). LAB são úteis para seres humanos e animais em muitos aspectos, incluindo prevenção da diarréia, efeitos na intolerância à lactose, atividade antifúngica, papel na prevenção de doenças infecciosas, prevenção de úlceras de estômago, produção de produtos lácteos e preservação de alimentos (MASOOD; QADIR; SHIRAZI; KHAN, 2010).
Para ser considerada uma bactéria probiótica, a cepa deve conter bactérias vivas, ser capaz de sobreviver às condições do TGI, possuir propriedades de adesão intestinal e capacidade de colonizá-lo, ser considerada segura e ter propriedades protetoras em estudos controlados em humanos, permaneça viável no período de tempo determinado na matriz que estiver presente e possuir uma quantidade de UFC suficiente para exercer seus efeitos protetores (que varia de acordo com a cepa e tipo de matriz a qual pertence). (QUIGLEY, 2019, GUARNER et al., 2017, OREL; TROP, 2014)
A quantidade necessária de microrganismos probióticos para alcançar efeitos benéficos para a saúde podem variar dependendo da cepa e produto. Em geral, produtos contendo microrganismos probióticos devem mostrar um número mínimo de bactérias viáveis com eficácia comprovada (conforme encontrado em testes em seres humanos), estimado entre 106-108 UFC / g de produto ou 108-1010 UFC / dia
(considerando a ingestão diária de 100g de produto probiótico). (CELIBERTO et al., 2015).
Estudos demonstram que dentro de uma mesma espécie existem cepas com características próprias e mecanismos de ação diferentes, dentre as quais algumas destacam-se mais em relação às suas propriedades anti-inflamatórias intestinais podendo ser usada como potencial candidato probiótico (CHO, et al., 2011, ŀTOFILOVÁ et al., 2017).
A recente demonstração em um modelo de roedor de que L. rhamnosus ATCC 8530 possui efeitos inflamatórios e analgésicos superiores ao agente anti-inflamatório não-esteroide diclofenaco, ressalta o potencial benefício dessas investigações (AMDEKAR; SINGH, 2016). Estudos com humanos saudáveis demonstraram que a administração de probióticos alterou a microbiota desses indivíduos, diminuindo a abundância de bactérias nocivas e aumentando a produção colônica de ácidos graxos de cadeia curta e, em pacientes com DII gerou alívio dos sintomas gastrointestinais (SÁNCHEZ et al., 2016).
Probióticos em combinação com outros componentes ativos da dieta também representam uma estratégia muito notável para afetar a saúde do hospedeiro de maneira benéfica. Nesse sentido, os simbióticos, ou seja, combinações probitóticas e prebióticas, têm sido utilizadas (SÁNCHEZ et al., 2016). Prebióticos consistem em componentes não digeríveis, que embora sejam metabolizados por microrganismos no intestino, modulam a composição e a atividade da microbiota intestinal, conferindo efeito fisiológico benéfico ao hospedeiro. Moléculas classicamente ditas como prebióticos incluem oligossacarídeos de leite humano, inulina, fruto-oligossacarídeos e galacto-oligossacarídeos (QUIGLEY, 2019).
Diferentes funções estão sendo atribuídas à microbiota intestinal à luz das pesquisas realizadas principalmente no últimos 10 anos, entre as quais: manutenção da barreira epitelial, inibição da adesão de patógenos às superfícies intestinais, modulação e maturação adequada do sistema imunológico, degradação de fontes de carbono não digeríveis como polissacarídeos vegetais e produção de metabólitos diferentes, como vitaminas e ácidos graxos essenciais (SÁNCHEZ et al., 2016).
Eles se envolvem com o sistema imune da mucosa via receptores Toll-like para promover a diferenciação de células do tipo Th1. Como consequência, a produção de anticorpos é aumentada, bem como a atividade de fagócitos e células natural killer e a via NF-kB inibida. A inibição desta via leva à apoptose de células T, regulação positiva de citocinas anti-inflamatórias como IL-10 e fator de crescimento beta e regulação negativa de citocinas pró-inflamatórias como o TNF-α, IFN-ϒ, IL1β e IL-8 (QUIGLEY, 2019, HALLORAN; UNDERWOOD, 2019, ABRAHAM; QUIGLEY, 2017). Estudos com voluntários humanos normais mostraram a capacidade do microrganismo Bifidobacterium longum 35624, administrado por via oral, em aumentar os níveis séricos da citocina anti-inflamatória IL-10. Além disso, esse mesmo microrganismo demonstrou reduzir os níveis da proteína C reativa em pacientes com UC (ABRAHAM; QUIGLEY, 2017).
Probióticos demonstraram papel potencial em infecções entéricas onde eles modulam a composição da microbiota inibindo o crescimento de bactérias patogênicas por meio da produção de bacteriocinas e criação de um ambiente mais ácido, hostil para esses microrganismos, e, ainda, promove crescimento de espécies benéficas como Lactobacillus e Bifidobacteirum (QUIGLEY, 2019).
Alguns metabólitos importantes produzidos pelos probióticos são o lactato e os ácidos graxos de cadeia curta. Em modelos animais de lesão da mucosa, a administração de probióticos está associada ao aumento de lactato, acetato, proprionato e butirato fecal e atenuação da lesão da mucosa (TRINDADE et al., 2018). A demonstração recente de que bactérias produtoras de ácido lático (bifidobactérias e lactobacilos) como L. plantarum, estimulam a expansão de células-tronco intestinais, células de Paneth e células caliciformes, sugere que esses probióticos são importantes na prevenção de lesões da mucosa intestinal (LEE et al., 2018).
Estudos demonstram que probióticos agem beneficamente na camada de muco intestinal, aumentando a produção de mucinas. Muitos organismos comensais são capazes de colonizar a camada externa de muco e usar as mucinas hospedeiras como
