A instilação intracolônica do DNBS provocou um processo inflamatório intestinal que teve como característica alterações de importantes parâmetros clínicos que estão presentes na DII, como a perda de peso, presença de sangue na região perianal e alteração na consistência das fezes, que estão representados no DAI. A pontuação do DAI estabelece um escore de 0-4, como indica a figura 7A. Pode-se observar que no dia 18 e 19 (primeiro e segundo dias após a indução da inflamação pelo DNBS), todos os grupos obtiveram um aumento no DAI em comparação com o dia 16, onde a inflamação ainda não havia sido induzida. Porém, os grupos tratados com SSZ, LM CNPC007 e LP CNPC003 (p<0,0001), tiveram um valor do DAI menor do que o grupo controle DNBS, os quais diferiram estatisticamente. Tais resultados apontam que, clinicamente, os grupos tratados se apresentavam melhores do que o grupo não tratado (DNBS), demonstrando uma eficácia clínica.
Um parâmetro complementar observado foi o consumo de ração. Na figura 7B, podemos observar que nos dias após a indução da inflamação pelo DNBS (dia 18 e 19), houve uma queda considerável do consumo da ração por todos os grupos em comparação com o grupo saudável, onde a inflamação não foi induzida, e, somado a isso, os grupos tratados com SSZ, LM CNPC007 e LP CNPC003 (p<0,0001), tiveram um aumento do consumo da ração, o qual diferiu do grupo DNBS.
Figura 7 - Efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003
e Lactobacillus mucosae CNPC007 no Índice de Atividade da Doença e no consumo de ração
Legenda: Dados expressos como média ± SEM, n=7. Diferenças estatísticas: *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ****p<0,0001 vs Controle DNBS. S: Saudável; DNBS: Ácido dinitrobenzenosulfônico; SSZ: sulfassalazina; LM: Lactobacillus mucosae; LP: Lactobacillus plantarum. DAI: Índice de Atividade da Doença. A: Efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus
mucosae CNPC007 no DAI; B: Efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 no Consumo de ração.
Nossos resultados mostram que a inflamação intestinal induzida pelo DNBS foi eficaz levando em conta que a administração do ácido gerou características inflamatórias tais como necrose, hiperemia e ulcerações, diferindo dos animais que não receberam, os quais apresentaram seus intestinos livres de qualquer dano (figura 8A). Essas características macroscópicas puderam ser avaliadas pelo Índice de dano macroscópico (IDM), em que após a eutanásia dos animais, seus intestinos foram retirados e a severidade da lesão e a sua respectiva área de extensão foram analisados e determinado um escore macroscópico, que variou de 7 a 10, afetando uma área correspondente a 3 a 8 cm do tecido colônico. A administração de SSZ (p<0,001), LP CNPC003 e LM CNPC007 (p<0,05), provocou uma diminuição do IDM, diferindo do grupo DNBS (figura 8B).
Além disso, o dano intestinal também pôde ser observado pela relação peso/comprimento colônico, a qual foi maior nos intestinos dos animais que receberam DNBS, diferindo significativamente dos grupos tratados com SSZ (p<0,01), LP CNPC003 e LM CNPC007 (p<0,05), os quais não diferiram entre si. Isso pode ser explicado pois a inflamação causa um maior encurtamento (diminuição do
B
A
comprimento) e um espessamento (aumento do seu peso devido à formação de edema) intestinal (figura 8C).
Figura 8 - Efeito do pré-tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 no Índice de Dano Macroscópico Intestinal e na relação peso/comprimento intestinal
LEGENDA: IDM: Índice de dano macroscópico intestinal. S: Saudável; DNBS: Ácido dinitrobenzenosulfônico; SSZ: sulfassalazina; LM: Lactobacillus mucosae; LP: Lactobacillus plantarum. Dados expressos como média ± SEM, n=7. ANOVA e pós teste de Tukey foram utilizados para calcular a significância estatística. Diferenças estatísticas: *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ****p<0,0001 vs Controle DNBS. A: comprimento colônicos. B: efeito do tratatamento dos probióticos no Índice de Dano
Macroscópico Intestinal. C: efeito do tratatamento dos probióticos na relação peso/comprimento
intestinal.
Corroborando com os resultados macroscópicos expressos, pôde-se observar que os animais que receberam o DNBS obtiveram um aumento considerável na atividade da enzima MPO, em comparação com os animais que não receberam o ácido (p<0,0001), o que indica um aumento da infiltração de neutrófilos no local inflamado, e consequente aumento do processo inflamatório intestinal, demonstrando a eficácia do DNBS em produzir a inflamação (Figura 9A). Observou-se também que
A
B
C
A
os pré-tratamentos com SSZ, LP CNPC003 (p<0,0001) e LM CNPC007 (p<0,05) reduziram a atividade da enzima MPO, e diferiram do grupo controle DNBS, apresentando uma redução do processo inflamatório intestinal de cerca de 30% para o LM e 50% para o LP. Além disso, observa-se que o efeito preventivo do LP CNPC003 não expressou diferença com o grupo SSZ, se mostrando tão eficaz em reduzir a infiltração de neutrófilos quanto o tratamento com o fármaco padrão utilizado na DII.
Verificou-se que na figura 9B os níveis de MDA se encontram elevados nos animais que receberam o DNBS, indicando um aumento no estresse oxidativo, corroborando com os resultados do MPO que demonstra a eficácia do ácido em promover a inflamação intestinal. Por outro lado, a administração de SSZ (p<0,0001), LP CNPC003 (p<0,01) e LM CNPC007 (p<0,05), provocou uma diminuição nos níveis de MDA, os quais diferiram do grupo controle DNBS.
Figura 9 - Efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 na atividade da Mieloperoxidase e nos níveis de Malondialdeido
Legenda: MPO: Mieloperoxidase. S: Saudável; DNBS: Ácido dinitrobenzenosulfônico; SSZ: sulfassalazina; LM: Lactobacillus mucosae; LP: Lactobacillus plantarum. A: efeito do tratatamento dos probióticos na atividade da MPO. B: efeito do tratatamento dos probióticos nos níveis de MDA. Dados expressos como média ± SEM, n=7. ANOVA e pós teste de Tukey foram utilizados para calcular a significância estatística. Diferenças estatísticas: *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ****p<0,0001 vs Controle DNBS.
A
A
B
A
A
O grupo controle DNBS apresentou altos níveis de TNF-α e IL-1β (figura 10 A e B), corroborando com o resultados de MPO, que revelam grande infiltração de neutrófilos produtores destas citocinas pró-inflamatórias. No entanto, observou-se uma diminuição significativa do TNF-α nos grupos pré-tratados com a SSZ (p<0,01), LM CNPC007 (p<0,05) e LP CNPC003 (p<0,001) em comparação com o controle DNBS. Ademais, o pré-tratamento com a SSZ, LM CNPC007 e LP CNPC003 também ocasionou uma redução (p<0,001) da IL-β. Por outro lado, a administração de SSZ, LM CNPC007 e LP CNPC003 gerou um aumento (p<0001) na produção da citocina anti-inflamatória IL-10 quando comparado ao grupo controle DNBS, demonstrando que o pré-tratamento foi eficaz em reduzir o processo inflamatório intestinal (figura 10C).
Figura 10 - Efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 nos níveis das citocinas TNF-α, IL-β e IL-10
Legenda: TNF-α: Fator de Necrose Tumoral-α; IL-β: Interleucina-1β; IL-10: interleucina-10. S: Saudável; DNBS: Ácido dinitrobenzenosulfônico; SSZ: sulfassalazina; LM: Lactobacillus mucosae; LP:
Lactobacillus plantarum. A: efeito do tratatamento dos probióticos nos níveis colônicos de TNF-α por
ELISA. B: efeito do tratatamento dos probióticos nos níveis colônicos de IL-β por PCR em tempo real. C: efeito do tratatamento dos probióticos nos níveis colônicos de IL-10 por ELISA. Dados expressos como média ± SEM, n=7. ANOVA e pós teste de Tukey foram utilizados para calcular a significância estatística. Diferenças estatísticas: *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ****p<0,0001 vs Controle DNBS.
A indução da colite pelo DNBS ocasionou um dano na barreira epitelial intestinal, o que pôde ser observado por meio dos marcadores de integridade de barreira MUC-2 e OCL, que foram diminuídos no grupo controle DNBS. O pré- tratamento com o fármaco padrão SSZ (p<0,05) e os probióticos LM CNPC007 (p<0,05) e LP CNPC003 (p<0,01) aumentou a expressão do gene OCL (figura 11A), o que indica uma regeneração da barreira epitelial intestinal e melhora do quadro inflamatório intestinal, corroborando com os demais resultados até então apresentados, porém, apenas a SSZ (p<0,001) e LM CNPC007 (p<0,05) aumentaram a expressão do MUC-2 (figura 11B).
A
B
Figura 11 - Efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 nos níveis dos marcadores de integridade barreira MUC-2 e OCL
Legenda: OCL: ocludina; MUC-2: mucina-2. S: Saudável; DNBS: Ácido dinitrobenzenosulfônico; SSZ: sulfassalazina; LM: Lactobacillus mucosae; LP: Lactobacillus plantarum. A: efeito do tratatamento dos probióticos nos níveis colônicos de OCL. B: efeito do tratatamento dos probióticos nos níveis colônicos de MUC-2. Dados expressos como média ± SEM, n=7. ANOVA e pós teste de Tukey foram utilizados para calcular a significância estatística. Diferenças estatísticas: *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ****p<0,0001 vs Controle DNBS.
Não foram detectadas alterações histológicas na mucosa colônica de ratos do grupo saudável. Na avaliação histológica das amostras de cólon do grupo controle DNBS pôde-se observar uma grande infiltração de leucócitos, predominantemente neutrófilos, perda de cito arquitetura tecidual com destruição do epitélio, redução nas células caliciformes e presença de hemorragias. Nos grupos tratados com SSZ, LM CNPC007 e LP CNPC003, houve redução da inflamação do cólon, o que pode ser observado pela diminuição da infiltração de neutrófilos, maior preservação das células caliciformes e da histologia da mucosa e diminuição da quantidade de hemorragias (Figura 12).
Figura 12 - Efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 nos achados histológicos e no dano microscópico colônico em ratos com colite induzida por DNBS
LEGENDA: Características histopatológicas do tecido colônico representativo, mostrando o fragmento de cólon cortado na direção longitudinal e corado com Hematoxilina/Eosina; escala 100 μm. grupo S (A), grupo controle DNBS (B), grupo SSZ (C) grupo LM (D) grupo LP (E), e avaliação de danos microscópicos (F). Camadas intestinais normais (), células inflamatórias agudas densas se infiltram na mucosa altamente ulcerosa (), infiltrado moderado, () infiltrado leve () e perda de células caliciformes (). S: Saudável; DNBS: Ácido dinitrobenzenosulfônico; SSZ: sulfassalazina; LM:
Lactobacillus mucosae; LP: Lactobacillus plantarum. Dados expressos como mediana e intervalo
interquartil, n=7. Mann-Whitney foi utilizado para calcular a significância estatística. Diferenças estatísticas: *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ****p<0,0001 vs Controle DNBS.
Na avaliação imunohistoquímica foi observado uma redução da imunomarcação (por coloração acastanhada) característica da presença de ZO-1 nos animais que receberam apenas o DNBS. Por outro lado, o pré-tratamento com a SSZ (p<0,01) e com os probióticos LP CNPC003 (p<0,01) e LM CNPC007 (p<0,05) possibilitou um aumento desta marcação indicando uma supra regulação de ZO-1 no tecido colônico, corroborando com o resultado expresso da OCL, o que aponta para uma regeneração do epitélio intestinal danificado pelo DNBS (Figura 13).
O hapteno DNBS levou a uma marcação imunohistoquímica do NF-κB, indicando uma ativação desta via de sinalização pró-inflamatória. Em contrapartida, observou-se que a administração da SSZ (p<0,0001)e dos probióticos LM CNPC007 (p<0,01)e LP CNPC003 (p<0,0001)reduziu a imunomarcação nos tecidos colônicos referentes à esses grupos, demonstrando com isso, que os tratamentos foram capazes de minimizar o processo inflamatório intestinal por meio da infra regulação da cascata de sinalização pró-inflamatória da qual a NF-κB participa (Figura 14).
De acordo com o resultado encontrado para a via de sinalização NF-κB, a qual eleva a transcrição de citocinas pró-inflamatórias e metaloproteínases, foi detectado um aumento da expressão da citocina IL-17 (figura 14) e da metaloproteínase 9 (MMP- 9) (figura 13) no grupo controle DNBS. Por outro lado, a administração da SSZ e dos probióticos LM CNPC007 e LP CNPC003 (p<0,001) gerou uma diminuição da expressão de tais marcadores, indicando redução do processo inflamatório intestinal.
A análise Imunohistoquímica da enzima iNOS revelou um aumento de sua expressão no grupo controle DNBS em comparação ao grupo Saudável. No entanto, os grupos LP CNPC003 (p<0,001), LM CNPC007 (p<0,01) e SSZ (p<0,05) apresentaram redução significativa na expressão desta enzima (figura 13). Com isso, pode-se sugerir que os pré-tratamentos diminuiram a expressão de iNOS, e, como consequência, a produção em excesso de NO, gerando uma redução do estresse oxidativo e do processo inflamatório intestinal, corroborando com os resultados do MDA, importante marcador de estresse oxidativo.
Figura 13 - Efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 na análise Imunohistoquímica colônica para os marcadores ZO-1 e iNOS
LEGENDA: Análise Imunohistoquímica do efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 na mucosa intestinal do cólon no ensaio experimental de colite aguda induzida pelo ácido 2,4-dinitrobenzeno sulfônico (DNBS) em ratos. A imunorreatividade foi reconhecida pela coloração acastanhada nas células inflamatórias. Grupo S (A e F), grupo controle DNBS (B e G), grupo SSZ (C e H) grupo LM (D e I) grupo LP (E e J), e escore de imunoreatividade (K e L). Grupo saudável com imunocoloração baixa para sintase do óxido nítrico induzida(iNOS) e imunocoloração alta para zona de oclusão-1 (ZO-1). Grupo DNBS exibindo intensa imunorreatividade para iNOS e imunocoloração baixa para ZO-1. O círculo tracejado indica concentração de células positivas (com alta imunoreatividade). S: Saudável; DNBS: Ácido dinitrobenzenosulfônico; SSZ: sulfassalazina; LM: Lactobacillus
mucosae; LP: Lactobacillus plantarum. Dados expressos como média ± SEM, n=7. ANOVA e pós teste de Tukey foram utilizados para calcular a significância
estatística. Diferenças estatísticas: *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ****p<0,0001 vs Controle DNBS. (Aumento de 100×).
K
Figura 14 - Efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 na análise Imunohistoquímica colônica para os marcadores IL-17 e NF-κB
LEGENDA: Análise Imunohistoquímica do efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 na mucosa intestinal do cólon no ensaio experimental de colite aguda induzida pelo ácido 2,4-dinitrobenzeno sulfônico (DNBS) em ratos. A imunorreatividade foi reconhecida pela coloração acastanhada nas células inflamatórias. Grupo S (A e E), grupo controle DNBS (B e G), grupo SSZ (C e H) grupo LM (D e I) grupo LP (E e J), e escore de imunoreatividade (K e L). Grupo saudável com imunocoloração baixa para fator nuclear kappa B (NF-κB) e interleucina-17 (IL-17). Grupo DNBS exibindo intensa imunorreatividade para NF-κB e IL-17. O círculo tracejado indica concentração de células positivas (com alta imunoreatividade). S: Saudável; DNBS: Ácido dinitrobenzenosulfônico; SSZ: sulfassalazina; LM: Lactobacillus mucosae; LP: Lactobacillus plantarum. Dados expressos como média ± SEM, n=7. Diferenças estatísticas: *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ****p<0,0001 vs Controle DNBS. (Aumento de 100×).
K
Figura 15 - Efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 na análise Imunohistoquímica colônica para o marcador MMP-9
LEGENDA: Análise Imunohistoquímica do efeito do tratamento com os probióticos Lactobacillus plantarum CNPC003 e Lactobacillus mucosae CNPC007 na mucosa intestinal do cólon no ensaio experimental de colite aguda induzida pelo ácido 2,4-dinitrobenzeno sulfônico (DNBS) em ratos. A imunorreatividade foi reconhecida pela coloração acastanhada nas células inflamatórias. Grupo S (A), grupo controle DNBS (B), grupo SSZ (C) grupo LM (D) grupo LP (E), e escore de imunoreatividade (F). Grupo saudável com imunocoloração baixa para metaproneísase-9 (MMP-9) Grupo DNBS exibindo intensa imunorreatividade para MMP-9. O círculo tracejado indica concentração de células positivas (com alta imunoreatividade). S: Saudável; DNBS: Ácido dinitrobenzenosulfônico; SSZ: sulfassalazina; LM: Lactobacillus mucosae; LP: Lactobacillus plantarum. Dados expressos como média ± SEM, n=7. Diferenças estatísticas: *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 ****p<0,0001 vs Controle DNBS. (Aumento de 100×)