A leishmaniose visceral é, ainda, um grave problema em saúde pública e em medicina veterinária ocorrendo principalmente em países em desenvolvimento (WHO, 2002). As medidas adotadas pelos órgãos públicos de saúde para o controle da doença têm-se mostrado ineficazes ao longo dos anos, de modo que a leishmaniose visceral apresenta-se em elevada expansão em todo mundo, inclusive no Brasil. Isso ocorre, em parte, porque tais medidas são frequentemente descontinuadas e de difícil execução. Uma alternativa para o controle da leishmaniose visceral humana é o controle da infecção no cão, principal hospedeiro reservatório do parasito. Assim, o desenvolvimento de uma vacina efetiva contra leishmaniose visceral canina, que vise à interrupção do ciclo de transmissão do parasito, é um dos objetivos pelo qual nosso grupo de pesquisa vem trabalhando nos últimos anos.
No presente trabalho, o efeito de diferentes protocolos de imunização, em camundongos, usando moléculas candidatas a componentes de uma vacina contra leishmaniose visceral canina, foi avaliado com a finalidade de se identificar uma estratégia de imunização que favorecesse a indução de uma resposta imune celular predominantemente do tipo Th1. Assim, a utilização de plasmídeos como vetor de expressão de DNA foi a base deste trabalho. Os protocolos utilizados consistiram da injeção de plasmídeos capazes de levar à expressão in vivo de cDNAs codificadores de proteínas de formas amastigotas de L. chagasi. Estes plasmídeos foram administrados isoladamente por injeção intramuscular seguida de eletroporação, ou como uma mistura de plasmídeos, associados ou não a plasmídeo capaz de levar à expressão de IL-12 murina, ou, ainda, pela administração inicial de DNA plasmideal e posterior reforço com a proteína recombinante correspondente. A resposta imune foi caracterizada nas duas vertentes, humoral e celular. A produção de anticorpos específicos e a reatividade de esplenócitos pré- sensibilizados ao extrato bruto de antígenos de promastigotas de L. infantum/chagasi, bem como, com cada uma das proteínas recombinantes, foram avaliadas. Dessa forma, o perfil de resposta imune obtido seguindo-se os protocolos utilizados foi determinado. Adicionalmente, os animais foram expostos ao agente etiológico da leishmaniose visceral por infecção experimental com promastigotas de L. chagasi. Assim, a capacidade de responder ao estímulo antigênico natural foi também avaliada.
Embora não completamente esclarecida, a resposta imune capaz de conferir proteção contra a leishmaniose visceral no cão é dita ser predominantemente celular com produção de citocinas por células T CD4+ do tipo Th1 (PINELLI et al., 1995; RHALEM et al., 1999). Dessa forma, a base para o desenvolvimento de uma vacina contra leishmaniose visceral canina implica em induzir uma resposta imune com tais características previamente à exposição ao agente causal.
O modelo murino apresenta algumas vantagens em relação ao uso do cão para uma análise inicial de antígenos candidatos a componente de uma vacina. Este é um modelo de fácil manipulação e, principalmente, tem comercialmente disponível os reagentes necessários para análise da resposta imune. Usando este modelo, a indução de uma resposta imune específica foi avaliada após a injeção de rLc9 em salina, ou associada a cinco diferentes adjuvantes incluindo adjuvante de Freund, saponina, hidróxido de alumínio, óleo de amendoim e IL-12 codificada por um vetor plasmideal. Resultados obtidos em nosso laboratório mostraram que a injeção de rLc9 em camundongos, apenas preparada em salina, leva à indução de uma resposta imune com elevada produção de anticorpos, ausência de resposta proliferativa e indução da produção de citocinas produzidas apenas por células do tipo Th2, como demonstrado pela detecção de IL-5 e ausência de IFN-γ. Esta resposta só foi parcialmente revertida quando rLc9 foi administrada associada à saponina. A injeção de camundongos utilizando esta combinação foi a única a induzir uma resposta imune celular específica com proliferação de células esplênicas e produção de IFN- γ, mantendo, no entanto, a produção de IL-5 além de uma intensa resposta imune humoral específica na qual houve um predomínio de anticorpos IgG da subclasse IgG1 (FRAGA, 2007). Estes achados estão de acordo com dados da literatura, os quais mostram que saponina é capaz de estimular ambos os tipos de células T CD4+ Th1 e Th2 (BOMFORD et al., 1992) e apresenta-se como um dos mais potentes adjuvantes para gerar uma significante resposta imune mediada por células e anticorpos (BOMFORD et al., 1980). Resultado semelhante foi obtido neste trabalho, no qual um grupo de camundongos imunizado com rLc9/saponina foi utilizado para comparação com outros protocolos de imunização, discutido posteriormente.
Atualmente, a vacinação com DNA plasmideal tem se apresentado como uma estratégia promissora para o desenvolvimento de vacinas contra diversos tipos de infecções, principalmente aquelas que envolvem a indução de resposta imune contra patógenos intracelulares. Muitas são as vantagens para o uso de plasmídeos e/ou outras moléculas de DNA como vetores de expressão de
antígenos in vivo. Ao contrário dos métodos convencionais de vacinação, os quais muitas vezes se utilizam patógenos inativados ou vivos e atenuados, a reprodutibilidade e padronização lote-a- lote do material utilizado, além de questões relacionadas à segurança podem ser contornados. Além disso, um adjuvante capaz de induzir preferencialmente uma resposta celular deve ser utilizado para obtenção de uma resposta imune que realmente seja eficiente no controle de infecções intracelulares. O uso de DNA como vetor de expressão de antígenos recombinantes atende a algumas dessas necessidades.
Como descrito neste trabalho, a injeção de plasmídeos capazes de levar à expressão in vivo de cDNAs codificadores de proteínas recombinantes de formas amastigotas de L.
infantum/chagasi, administrados isoladamente, resultou na indução de resposta imune humoral
específica para três de quatro plasmídeos utilizados. Esta resposta foi identificada frente a reatividade de anticorpos com proteínas do extrato bruto de promastigotas (após a injeção de pBK-CMV-Lc9 ou pBK-CMV-Lc14) e contra as proteínas recombinantes (após a injeção de pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18).
A diferente reatividade ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi encontrada entre os grupos injetados com diferentes plasmídeos pode ser explicada pela representatividade, maior ou menor, de cada uma das proteínas de L. chagasi presentes no extrato bruto de antígenos e que correspondem às proteínas recombinantes Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18. Vale ressaltar que os plasmídeos utilizados para a injeção codificam proteínas da forma amastigota de Leishmania. Como existe uma grande variabilidade antigênica entre as diferentes formas do parasito (FONG & CHANG, 1982; HANDMAN et al., 1984) não podemos descartar a possibilidade de ausência ou baixa expressão das proteínas correspondentes à Lc13 e Lc18 em promastigotas. Uma avaliação complementar pode ser feita por Western blotting, na qual extrato bruto de antígenos das formas amastigota e promastigota de L. chagasi seria previamente fracionado por SDS- PAGE. Dessa forma, a reatividade dos anticorpos induzidos pela injeção de plasmídeos poderia ser avaliada em um ensaio de maior sensibilidade e especificidade.
A ausência de reatividade de anticorpos específicos para Lc13 ou para Lc18 à antígenos presentes no extrato bruto de promastigotas pode também estar relacionada a intensidade da resposta imune humoral induzida após a injeção de pBK-CMV-Lc13 ou pBK-CMV-Lc18. Foi observado, em ELISA para detecção de anticorpos específicos para Lc13 ou Lc18 utilizando-se proteínas recombinantes purificadas para sensibilização das placas, que a medida de densidade
óptica encontrada foi semelhante a dos grupos controles ou extremamente baixa, em amostras de animais injetados com pBK-CMV-Lc13 ou pBK-CMV-Lc18, respectivamente, indicando que não houve produção de anticorpos específicos como a observada para as injeções de pBK-CMV- Lc9 ou pBK-CMV-Lc14. A intensidade da resposta imune, por sua vez, depende de fatores como a imunogenicidade inerente a cada proteína, a quantidade de proteína produzida e que vai estimular o sistema imune ou mesmo, como é o caso, de características próprias da imunização com plasmídeo.
As proteínas Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18 são naturalmente imunogênicas para o cão. Estas proteínas foram selecionadas a partir de uma biblioteca de cDNA de formas amastigotas de L.
chagasi, com base na reatividade de cada clone a uma mistura de soro de cães naturalmente
infectados (TEIXEIRA et al., 2007). A imunogenicidade de Lc13 recombinante foi demonstrada em experimentos anteriores realizados em nosso laboratório, onde a injeção de Lc13, administrada como emulsão em adjuvante de Freund ou em combinação à saponina, induziu uma resposta imune humoral de forte intensidade tanto em camundongos como em cães, respectivamente (PENHA FILHO, 2003; SANTOS, 2007). Já em relação a Lc18 recombinante, existe a possibilidade de que a pouca intensidade da resposta imune humoral obtida nos animais injetados com pBK-CMV-Lc18 esteja relacionada a baixa imunogenicidade desta proteína.
A ausência ou fraca indução de resposta imune humoral não é uma característica incomum após injeções com DNA, a qual tende a favorecer uma resposta imune celular (IBORRA et al., 2003; RAFATI et al., 2005). Este fato pode estar relacionado a características imunológicas estabelecidas após a injeção de moléculas de DNA plasmideal. A ativação completa de linfócitos B, frente à exposição a antígenos T dependentes, e sua diferenciação para plasmócitos depende diretamente do micro ambiente onde este tipo de linfócito foi ativado e de interações com células T auxiliares que secretam principalment e as citocinas IL-4 e IL-5, potentes moduladoras da produção de anticorpos. No entanto, frequentemente, injeções com DNA ativam células T auxiliares do tipo Th1, principais produtoras de IFN-γ (LECLERC et al., 1997). Esta característica, intrínsica a moléculas de DNA plasmideal, está associada à presença de seqüências imunomodulatórias, dinucleotídeos CpG não metilados, os quais influenciam diretamente a produção de citocinas como IFN-γ e IL-12 (KLINMAN et al., 1996; LECLERC et al., 1997). No entanto, a produção de IL-6 também é induzida por estas seqüências imunomodulatórias, e esta citocina, que é capaz de promover a ativação e secreção de anticorpos
por células B diferenciadas (KLINMAN et al., 1996; MURAGUCHI et al., 1988) pode contribuir, pelo menos num momento inicial de ativação, para a indução da produção de anticorpos.
Outros pontos que precisam ser mencionados estão relacionados à quantidade de proteína necessária para a indução de uma resposta imune em associação à sua localização celular. Quando comparamos a intensidade da resposta imune humoral específica para Lc9 de grupos de animais injetados com Lc9 associada à saponina, administrada a 100 µg/dose, ou injetados com pBK-CMV-Lc9 a diferença entre os grupos foi da ordem de 40 vezes. Ao contrário da exposição de grande quantidade de rLc9 exposta ao sistema imune após injeção em associação a saponina, a produção das proteínas recombinantes de L. chagasi pelo vetor de expressão pBK-CMV é intracelular e não há em nenhuma das cadeias polipeptídicas um sinal para a secreção das proteínas. Esta condição pode, inclusive, favorecer o estabelecimento de uma resposta imune celular, de interesse para o nosso trabalho (TORRES et al., 1999, DREW et al., 2000).
Paralelamente à avaliação da injeção de plasmídeos recombinantes administrados isoladamente, uma preparação multicomponente foi utilizada para injeção de camundongos, na qual uma mistura em partes iguais de cada um dos plasmídeos, pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV- Lc13, pBK-CMV-Lc14 e pBK-CMV-Lc18, foi administrada em três diferentes condições: injeção intramuscular seguida ou não de eletroporação ou ainda, associada ao plasmídeo pcDNA3.1A-scmu-IL-12, também seguida de eletroporação. A partir destes experimentos, foi observado que houve reatividade de anticorpos ao extrato bruto de antígenos de promastigotas de
L infantum/L. chagasi nas três condições de tratamento utilizadas. No entanto, existe uma forte
possibilidade de que esta reação tenha ocorrido, como visto anteriormente, decorrente da interação de anticorpos específicos para Lc9 e Lc14, produzidos em maior intensidade após injeção isolada de pBK-CMV-Lc9 e pBK-CMV-Lc14, respectivamente.
Uma das vantagens em se utilizar a imunização com DNA plasmideal para a indução de resposta imune é a possibilidade de combinar vários plasmídeos codificando antígenos de diferentes estágios ou linhagens de um mesmo patógeno com diferentes alvos antigênicos ou ainda, de patógenos diferentes, em uma única vacina. Uma vacina multicomponente pode ser mais abrangente na cobertura contra infecções e dessa forma mais eficiente. Relatos anteriores mostram que imunizações com uma mistura de proteína ou de polissacarídeos têm levado a uma diminuição da resposta aos componentes individuais da mistura (HUNT et al., 1994; FATTOM et
al., 1999). Ao contrário, a combinação de moléculas de plasmídeos recombinantes, como em avaliações realizadas no modelo murino de malária e tuberculose, não implica em competitividade de antígenos, mas sim em aumento da resposta imune e de proteção (DOOLAN
et al., 1996; MORRIS et al., 2000; GRIFANTINI et al., 1998).
A compatibilidade de plasmídeos e antígenos deve ser avaliada, caso a caso, porque diferentes combinações podem comportar-se diferentemente (SEDEGAH et al., 2004). Como a medida da reatividade dos anticorpos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi foi semelhante àquela observada quando os plasmídeos pBK-CMV-Lc9 e pBK-CMV-Lc14 foram administrados separadamente, não parece ter havido uma incompatibilidade de componentes nesta preparação. No entanto, quanto à resposta imune celular apenas a estimulação in vitro com Lc9 resultou em produção de IFN-γ, enquanto que, a resposta linfoproliferativa vista anteriormente para Lc14 não foi observada. De qualquer forma, diante dos resultados obtidos pela injeção isolada de plasmídeos, uma nova combinação de plasmídeos, que inclua outros antígenos mais imunogênicos, pode ser uma alternativa para obtenção de uma resposta imune protetora no modelo murino de leishmaniose visceral.
A administração dos plasmídeos quer seja isoladamente ou em combinação, foi realizada por meio de injeções intramusculares seguida de eletroporação. A eletroporação in vivo é uma estratégia utilizada para aumentar a eficiência de transfecção e os níveis de expressão de polipeptídeos após injeção de DNA plasmideal (RIZZUT0 et al., 1999). Esta técnica permite um aumento no nível de expressão de polipeptídeos exógenos, em função do aumento no número de células transfectadas e, provavelmente, pelo aumento no número de cópias de plasmídeo recombinante introduzido em cada célula muscular (AIHARA & MIYAZAKI, 1998). Isso ocorre, em parte, devido à uma rápida desestruturação da membrana celular e abertura de poros que permitem a passagem de grandes moléculas (SOMIARI et al., 2000).
Como apresentado neste trabalho, o uso de eletroporação não induziu um aumento significativo na intensidade da resposta imune como têm sido descrito em diversos outros trabalhos (WIDERA et al., 2000, KADOWAKI et al., 2000 , ZUCCHELLI et al., 2000). Em experimentos anteriores realizados em nosso laboratório, o uso de eletroporação levou a um aumento significativo na expressão do cDNA que codifica IL-12 murina após a injeção do plasmídeo pcDNA3.1A-scmu-IL-12 comparada a administração do mesmo plasmídeo sem eletroporação. Este aumento na produção de IL-12 murina foi demonstrado indiretamente pela
detecção de IFN-γ em níveis elevados apenas no soro dos animais submetidos a eletroporação em relação aos animais que não foram submetidos ao tratamento com choque elétrico (BARROUIN- MELLO et al., dados não publicados). Os plasmídeos utilizados neste trabalho, pBK-CMV (Stratagene) e pcDNA3.1 (Invitrogen), possuem as características apropriadas para a produção de proteína recombinante in vivo em células de mamíferos, como por exemplo a presença de uma forte região promotora para expressão em células eucarióticas (PASLEAU et al., 1985; XIA et al., 2006).
A produção de anticorpos específicos que ocorre naturalmente na infecção por
Leishmania, parece ter pouca, ou mesmo, nenhuma importância na proteção contra a infecção
quer seja em seres humanos ou em cães (BEHFOROUZ et al., 1983; GALVÃO-CASTRO et al., 1984; INIESTIA et al., 2005; REIS et al., 2006). Apesar disso, a avaliação da produção de anticorpos pode fornecer informações gerais a respeito da imunogenicidade de diferentes candidatos a vacina. No modelo murino, a produção de anticorpos das diferentes subclasses de IgG, específicas para o antígeno, é uma medida conveniente para a avaliação da regulação de uma resposta imune mediada por células Th1 ou Th2.
A resposta imune humoral que foi induzida pela administração de plasmídeos capazes de codificar proteínas de formas amastigotas de L. chagasi, quer seja administrados isoladamente ou como uma mistura de plasmídeos, apresentou-se predominantemente com produção de anticorpos de isotipo IgG2a. Em camundongos, a produção de IFN-γ, um marcador da resposta imune celular do tipo Th1, induz a acumulação de RNA mensageiro para cadeia pesada de imunoglobulina gama 2a em células B e correlaciona-se diretamente com uma elevada produção de anticorpos de isotipo IgG2a (SNAPPER et al., 1987). Por outro lado, na presença de IL-4 e/ou IL-5 a produção de anticorpos de isotipo IgG1 é favorecida (SNAPPER et al., 1987; PURKERSON & ISACKSON, 1992). Em todas as avaliações realizadas neste trabalho, na qual plasmídeo foi utilizado para injeção de camundongos, a medida de densidade óptica para detecção de anticorpos de isotipo IgG2a foi maior que a medida de anticorpos de isotipo IgG1. Vale ressaltar que a avaliação da proporção de anticorpos IgG2a/IgG1 é relativa uma vez que para determinação de cada uma destas subclasses se utilizam ensaios imunoenzimáticos distintos. Nossa observação diante de repetidas avaliações é que a relação IgG2a > IgG1 se mantém para injeções com DNA e, torna-se inversa para imunização com proteína, assim como verificado utilizando-se soro de camundongos infectados com L. chagasi (dados não mostrados). Assim,
diante do predomínio de anticorpos de isotipo IgG2a, uma resposta imune celular do tipo Th1, com produção de IFN-γ, foi esperada para os animais injetados com plasmídeos recombinantes.
O uso de plasmídeo como vetor de expressão de antígenos recombinantes foi utilizado no presente trabalho visando à identificação de um protocolo de imunização capaz de favorecer a indução de uma resposta imune celular do tipo Th1, contra antígenos de L. chagasi. A indução de resposta imune celular específica, após as séries de injeções de plasmídeos recombinantes capazes de codificar antígenos de L. chagasi, ocorreu em apenas um grupo de animais os quais foram injetados com pool de plasmídeos associado ao plasmídeo pcDNA3.1-scmu-IL-12. As células esplênicas destes animais produziram IFN-γ in vitro apenas após cultivo com Lc9 recombinante e esta produção foi estatisticamente significante em relação aos demais grupos. A produção de IFN-γ após a série de injeções com um pool de plasmídeos associado a pcDNA3.1- scmu-IL-12 foi de pouca intensidade, mas consistente, pois manteve-se após a infecção com promastigotas de L. chagasi. Após a infecção foi possível detectar a indução de resposta imune celular específica em células de animais injetados com pBK-CMV-Lc9, com produção estatisticamente significante de IFN-γ, e em células de animais injetados com pBK-CMV-Lc14, com resposta proliferativa.
Apesar de pouco intensa, a resposta imune induzida após as injeções de plasmídeos foi predominantemente do tipo Th1. Em nenhum momento a produção de IL-4 ou de IL-5 foi detectada no sobrenadante das culturas, exceto após estimulação com concanavalina A, mostrando que as células eram capazes de produzir tais citocinas. No entanto, não podemos descartar a possibilidade de que tenha ocorrido a indução da produção destas citocinas após estimulação in vitro. As dosagens de IL-4 e IL-5 no sobrenadante de cultura de células precisam ser avaliadas de forma cautelosa, uma vez que o consumo destas citocinas por células estimuladas pode levar a uma medida subestimada e interpretações pouco confiáveis quanto ao tipo de resposta imune que está sendo avaliada (EWEN & BACA-ESTRADA, 2001). Vários autores têm demonstrado que a expressão do receptor de IL-4, tanto em sua forma solúvel como ligado à membrana, pode ser induzida durante diversas condições de estímulo in vitro, incluindo o uso de mitógenos de células T, concanavalina A ou anticorpos anti-CD3, além de IL-4, levando ao consumo da citocina ainda em cultura (RENZ et al., 1991; CHILTON et al., 1993; BLUM et al., 1996). Assim, outras técnicas para avaliação de IL-4 e IL-5, rotineiramente utilizadas por
diversos laboratórios, precisam ser consideradas tal como o uso de RT-PCR ou ELISPOT, por