Produção de antígenos recombinantes de Leishmania chagasi

Em estudos prévios em nosso laboratório, uma biblioteca de DNA complementar (cDNA) de formas amastigotas de L. chagasi (cepa MHOM/BR2000/Merivaldo2) foi confeccionada em fago lambda (fago lambda ZAP Express, Stratagene, La Jolla, CA, EUA), visando à seleção e à avaliação de antígenos protéicos recombinantes para o desenvolvimento de uma vacina, um método imunoterápico e ensaios imunodiagnósticos para leishmaniose visceral humana e canina.

Clones de fagos recombinantes produzindo, em Escherichia coli, antígenos capazes de reagir com anticorpos de uma mistura de soros de quatro cães naturalmente infectados por

Leishmania, que apresentavam resposta imune humoral e celular específicas, foram selecionados

e submetidos à excisão, seguindo-se recomendações da Stratagene, de modo a gerar clones correspondentes de fagímideos, plasmídeos que exibem a seqüência COS de fago lambda (TEIXEIRA et al., 2007). Quatro desses clones de plasmídeo foram denominados pBKCMV- Lc9, pBKCMV-Lc13, pBKCMV-Lc14 e pBKCMV-Lc18. A seqüência de DNA das extremidades 5’ e 3’ de cada inserto desses clones foi determinada e o gene que codifica cada polipeptídio foi identificado no genoma de Leishmania infantum do banco de dados do Instituto Sanger (http://www.genedb.org/genedb/linfantum/), através de uma colaboração com o Dr. Osvaldo Pompilio de Melo Neto do Departamento de Microbiologia do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (FIOCRUZ, Recife, PE). Posteriormente, parte dos insertos que codificam os polipeptídeos Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18 foi subclonado em plasmídeo pRSET (Invitrogen, Carlsbad, California, EUA), gerando as construções pRSETB-Lc9, pRSETB-Lc13, pRSETA- Lc14 e pRSETB-Lc18, respectivamente, capazes de promover super-expressão de cada um dos polipeptídeos recombinantes na linhagem de Escherichia coli BL21(DE3)pLysS (Invitrogen). O plasmídeo pRSET acrescenta, na extremidade amina do polipeptídio recombinante, uma seqüência de seis histidinas.

Cultivo de E. coli e indução da produção de antígenos recombinantes

Para a produção de proteínas recombinantes de L. chagasi Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18 em E. coli, volumes de 2 litros a 10 litros de cultura de E. coli da cepa BL21(DE3)pLysS (Invitrogen) transformada com cada uma das construções plasmidiais pRSETB-Lc9, pRSETB-Lc13, pRSETA-Lc14 e pRSETB-Lc18, respectivamente, foram utilizados. Resumidamente, uma

colônia de cada bactéria transformada com pRSETB-Lc9, pRSETB-Lc13, pRSETA-Lc14 ou pRSETB-Lc18 foi inoculada, separadamente, em um volume de 50 mL de meio de cultura Luria- Bertani [caldo LB: 1% de bacto-triptona (HiMedia, Mumbai, Índia), 0,5% de extrato de levedura (Isofar, Duque de Caxias – RJ), 1% de cloreto de sódio (Isofar), pH 7.0] com 50 µg/mL de ampicilina (Sigma-Aldrich) e 35 µg/mL de cloranfenicol (Sigma-Aldrich), e cultivada a 37°C, em uma incubadora orbital (Orbit Environ Shaker, Lab-Line, Seatlle, WA, EUA), sob agitação constante a 250 rpm, por aproximadamente 16 horas para obtenção de um pré-inóculo. Após esse período, a leitura de densidade óptica (D.O.) de cada pré-inóculo foi avaliada a 600 nm. O pré- inóculo de cada preparação foi utilizado para gerar grandes volumes de cultura, entre 2 a 5 litros por preparação. Cada pré-inóculo foi diluído em meio de cultura LB sem antibióticos, de modo a obter-se uma leitura de D.O. a 600 nm de valor próximo ou igual a 0,1. O volume final de cultivo de cada bactéria foi preparado de acordo com a D.O. obtida de cada pré-inóculo. Frascos Erlenmeyers de 1000 mL e de 2000 mL receberam um volume máximo de 200 mL e 400 mL da cultura recém diluída, respectivamente, não ultrapassando portanto 20% da capacidade máxima de cada frasco. As culturas bacterianas de cada frasco Erlenmeyer foram incubadas, a 37° C, sob agitação constante a 250 rpm. Quando a medida da densidade óptica da cultura, avaliada a 600 nm, atingiu um valor entre 0,4 e 0,6, um volume de isopropil-thio-B-D-galactosídio (IPTG, Invitrogen) preparado a 1M foi acrescentado para obter-se a concentração final de 0,25 mM nas culturas de E. coli transformadas com as construções pRSETB-Lc9 ou pRSETA-Lc14 e concentrações finais de 0,125 mM de IPTG para culturas de E. coli transformadas com as construções pRSETB-Lc13 ou pRSETB-Lc18, com a finalidade de induzir a produção da proteína recombinante. Estas concentrações foram determinadas em experimentos prévios nos quais foram avaliados o pontos máximo de produção de cada uma das proteínas recombinantes a partir de ensaios de dose-resposta e cinética de produção. Após a indução com IPTG, as culturas de cada frasco Erlenmeyer foram incubadas por mais três horas nas condições indicadas acima. A suspensão de bactéria de cada frasco foi centrifugada a 5.000 x g, a 4° C, por 15 minutos. Os sedimentos de cada preparação, correspondentes a todo o volume de cada cultura, foram pesados e armazenados a –20°C até o momento da purificação. Sedimentos obtidos a partir de alíquotas de um mililitro da cultura de bactéria, coletadas antes e após três horas de indução com IPTG, foram usadas para avaliação da produção da proteína recombinante.

Purificação de antígenos recombinantes de L. chagasi

As purificações de antígenos recombinantes foram realizadas separadamente para uso em cultivo celular, para estímulo in vitro de esplenócitos murinos e para uso em ELISA, para sensibilização de placas de microtitulação. As proteínas recombinantes purificadas e utilizadas em cultivo celular foram gentilmente preparadas pelo Dr. Edmilson Domingos da Silva, de Biomanguinhos, Instituto Fundação Osvaldo Cruz, RJ, utilizando-se três metodologias: cromatografia de afinidade com metal imobilizado (como realizado em nosso laboratório), diálise em G25 e troca Iônica (Poros HQ), seguindo-se as instruções dos fabricantes. As proteínas recombinantes de Leishmania chagasi Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18 utilizadas para ensaios de ELISA, foram purificadas apenas usando-se colunas de cromatografia de afinidade preparadas com Sepharose quelada por níquel (“Sepharose Chelating Sepharose Fast Flow”, Amersham Biosciences Corp., New Jersey, EUA), como descrito posteriormente. Uma etapa prévia à purificação das proteínas envolveu a lise bacteriana e obtenção de cada proteína recombinante seja na forma solúvel ou sob a forma de corpúsculos de inclusão, na fração insolúvel da preparação (SAMBROOK & RUSSEL, 2000).

Obtenção de proteínas solúveis ou sob a forma de corpúsculos de inclusão

Para a purificação de Lc9, sedimento bacteriano de 5 litros do cultivo de bactéria [BL21(DE3)pLysS transformada com pRSETB-Lc9, pesando 8.5 g, dividido em quatro tubos de polipropileno do tipo Falcon de 50 mL, foi descongelado a 4°C e ressuspenso em tampão de lise (20 mM Na2HPO4, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0), com auxílio de um agitador vórtex (Labnet, Woodbridge, NJ) e reunidos em um só tubo. Para cada grama de sedimento foram utilizados três mililitros de tampão de lise. Um miligrama de lisozima (Sigma) foi acrescentado para cada mililitro da suspensão. Em seguida, o tubo foi incubado por 20 minutos sobre gelo. Posteriormente, para auxiliar no processo de lise bacteriana, foram adicionados quatro miligramas de ácido deoxicólico (Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany) para cada grama do sedimento bacteriano original. O material foi, então, incubado a 37ºC, durante 15 minutos, em banho-maria. Depois disso, visando à fragmentação de DNA genômico da bactéria, o conteúdo do tubo foi sonicado sob o gelo. Foram aplicados quatro pulsos ultrassônicos com potência de

300 Watts (cada pulso teve 30 segundos duração e os intervalos entre cada dois pulsos consecutivos foram de 10 segundos), usando-se um aparelho ultrasonicador (Sonifier Cell Disruptor, Branson Sonic Power Company, Danbury, Connecticut, EUA). A suspensão resultante foi centrifugada a 17.000 x g, a 4° C, por 15 minutos. O sobrenadante e o sedimento, esse último depois de três lavagens com tampão de lise, foram separadamente transferidos para tubos Falcon de 50 mL, os quais foram armazenados a -20ºC até o uso. Uma amostra do sobrenadante e outra do sedimento, retiradas antes do armazenamento, foram analisadas através de gel de poliacrilamida contendo dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE; LAEMMLI, 1970) para determinar-se qual das duas frações exibia maior enriquecimento da proteína recombinante Lc9. A análise revelou que a fração solúvel exibia cerca de 80 % da proteína Lc9 produzida em E. coli (FRAGA, 2007).

As preparações de Lc13, Lc14 e Lc18, para posterior purificação em coluna de afinidade por cromatografia, foram obtidas seguindo-se o procedimento descrito no parágrafo anterior, com apenas pequenas modificações. Foram utilizados sedimentos bacterianos armazenados em tubos tipo Falcon de 50 mL, equivalentes a volumes de cultura de 2,8 L, 10L e 2L litros do cultivo de bactéria BL21(DE3)pLysS transformada com pRSETB-Lc13, pRSETA-Lc14 ou pRSETB-Lc18, pesando 10,3 g, 14,37 g e 4,62 g, respectivamente. Após a lise bacteriana e etapas de centrifugação, os sedimentos insolúveis de BL21(DE3)pLysS-pRSETB-Lc13, BL21(DE3)pLysS- pRSETA-Lc14 ou BL21(DE3)pLysS-pRSETB-Lc18 foram ressuspensos com aproximadamente 30 mL, 29 mL e 20 mL de tampão de ligação com agente denaturante (20 mM Na2HPO4, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol, 8M uréia, pH 8,0), respectivamente, e armazenados a -20ºC até o momento de uso. Amostras do sobrenadante e dos sedimentos, retiradas antes do armazenamento, foram analisadas através de SDS-PAGE para determinar-se qual das duas frações exibia maior enriquecimento das proteínas recombinantes Lc13, Lc14 e L18. A análise revelou que a fração insolúvel exibia maior concentração de cada uma das proteínas analisadas em relação a fração solúvel.

Purificação em coluna de afinidade

Lc9

Um volume de 25 mL de proteínas da fração solúvel de bactéria BL21(DE3)pLysS- pRSET-Lc9 foi aplicado, oito vezes, sobre uma coluna de 2 mL da resina Sepharose-níquel

(“Sepharose Chelating Sepharose Fast Flow”, Amersham Biosciences Corp., New Jersey, EUA), preparada seguindo-se as recomendações do fabricante. Resumidamente, para preparação da coluna, 2 mL de resina foram lavados três vezes com 10 mL de água destilada de cada vez e, em seguida, expostos a um volume de 1,5 mL de NiSO4 (Merck, São Paulo, São Paulo, Brasil) a 100 mM, por 15 minutos. A resina foi então lavada mais três vezes com água destilada e equilibrada com 10 mL de tampão de uma solução a 20 mM Na2HPO4, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0 e depois transferida para o suporte da resina. Após drenagem do tampão de lise, foram aplicados, em cada passagem, 3 mL da fração solúvel mencionada acima. Depois de 30 minutos, o fluxo foi ajustado para permitir exposição das proteínas à resina por mais 30 minutos. A resina foi lavada três vezes com 10 mL de solução Na2HPO4 a 20 mM, NaCl a 500 mM, imidazol a 31,25 mM, pH 8,0 (solução de lavagem) de cada vez e, em seguida, proteínas foram eluídas da coluna com quatro lavagens de 4 mL de solução Na2HPO4 a 20 mM, NaCl a 500 mM, imidazol a 500 mM, pH 8,0 (solução de eluição) de cada vez. Amostras efluentes da coluna, obtidas após aplicação das proteínas, durante a lavagem e durante a eluição, foram coletadas para análise por SDS-PAGE, juntamente com o material inicialmente aplicado na coluna para avaliação do processo de purificação da proteína recombinante. As frações cromatrográficaS exibindo Lc9 foram reunidas e submetidas à diálise contra PBS, pH 7.2, realizada em três banhos de 8 horas a 4° C. Após a diálise, a fração solúvel obtida após a centrifugação a 17000 g durante 15 minutos a 4° C, foi quantificada através do método da fluorescamina (Sigma-Aldrich) de determinação protéica, e armazenadas, em PBS, a -20°C até o momento de uso. Algumas amostras, antes de serem armazenadas, foram submetidas à esterilização por irradiação gama, como descrito anteriormente, para uso posterior em ensaios celulares.

Lc13, Lc14 e Lc18

As proteínas recombinantes Lc13, Lc14 e Lc18 foram purificadas por cromatografia de afinidade, como descrito para a purificação de Lc9, usando-se uma resina quelada com níquel, exceto que, para estas purificações foi utilizado o método de centrifugação (“batch”) ao invés de coluna, propriamente dita. Um volume de aproximadamente 1 mL, 29 mL e 20 mL de proteínas da fração insolúvel de bactéria BL21(DE3)pLysS-pRSETB-Lc13, BL21(DE3)pLysS-pRSETA- Lc14 ou BL21(DE3)pLysS-pRSETB-Lc18 foi utilizado para purificação, em tubos tipo Falcon de

15 mLcontendo 2 mL da resina de Sepharose carregada com níquel (“Sepharose Chelating Sepharose Fast Flow”, Amersham Biosciences Corp., New Jersey, EUA), preparada seguindo-se as recomendações do fabricante. As amostras foram incubadas durante 30 minutos, a temperatura ambiente, sob agitação constante tipo end-over-end em agitador hematológico (Fisher Scientific, EUA). Posteriormente, os tubos foram centrifugados a 500 x g, durante 5 minutos a 4oC. O sobrenadante foi removido e armazenado para análise. A resina foi lavada três vezes com 10 mL de tampão fosfato a 20 mM, NaCl a 500 mM, imidazol a 31,25 mM, uréia a 8 M, pH 8,0 (solução de lavagem) de cada vez e, em seguida, proteínas foram eluídas da resina com quatro lavagens de 4 mL de tampão fosfato a 20 mM, NaCl a 500 mM, imidazol a 500 mM, uréia a 8 M, pH 8,0 (solução de eluição) de cada vez. As frações cromatrográficas das purificações de Lc13, Lc14 ou Lc18 foram analisadas por SDS-PAGE, e submetidas à diálise contra PBS, pH 7.2, realizada em três banhos de 8 horas a 4°C. Após a diálise, as frações insolúveis obtidas após a centrifugação a 17000 x g durante 15 minutos a 4° C, foram quantificadas através do método da fluorescamina (Sigma-Aldrich) de determinação protéica e armazenadas, em PBS, a -20°C até o momento de uso.