Obtenção de plasmídeos para imunização

Como descrito anteriormente, no item 4.1.2., uma biblioteca de cDNA de formas amastigotas de L. chagasi foi confeccionada, por um dos pesquisadores do nosso laboratório, tendo como um dos objetivos o desenvolvimento de uma vacina contra a leishmaniose visceral canina, na qual antígenos protéicos recombinantes, provenientes desta biblioteca, seriam utilizados. Clones da biblioteca de cDNA, que foi confeccionada em fago lambda (fago lambda ZAP Express, Stratagene, La Jolla, CA, EUA), são capazes de gerar facilmente, por um processo denominado de excisão, fagimídios (pBK-CMV). Tais fagimídios comportam-se como plasmídeos e são capazes de levar a expressão de proteínas recombinantes tanto em células procarióticas (E. coli) quanto em células eucarióticas (células de mamíferos). Dessa forma, plasmídeos purificados podem ser utilizados diretamente para injeção de animais e avaliados como vacinas de DNA pela análise da imunogenicidade de cada proteína recombinante produzida in vivo. Quatro desses clones de plasmídeos denominados pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBKCMV-Lc14 e pBKCMV-Lc18 foram selecionados e obtidos para imunização de camundongos BALB/c. Cada um destes plasmídeos é capaz de produzir in vivo a proteína

recombinante correspondente acrescida de uma seqüência de 32 aminoácidos de β-galactosidase, devido à uma seqüência de nucleotídeos que codifica para B-galactosidase que antecede o sítio de inserção do cDNA clonado. Por este motivo, pBK-CMV, sem inserto exógeno, foi purificado e utilizado como controle negativo.

Purificação de plasmídeos pBK-CMV com insertos de antígenos recombinantes de L.

chagasi e de plasmídeocodificando IL-12 murina - pcDNA3.1-scmu-IL12

Para obtenção de plasmídeos pBKCMV-B-gal, pBKCMV-Lc9, pBKCMV-Lc13, pBKCMV-Lc14, pBKCMV-Lc18 e pcDNA3.1-scmu-IL-12, usados para injeção dos animais, foram utilizadas colunas de troca iônica (sílica-DEAE) para a purificação de DNA em média escala (Qiagen Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA, EUA), seguindo-se as recomendações do fabricante. Resumidamente, E. coli da linhagem TOP10, transformadas previamente com cada uma das construções, pBKCMV-B-gal, pBKCMV-Lc9, pBKCMV-Lc13, pBKCMV-Lc14, pBKCMV-Lc18 e pcDNA3.1-scmu-IL-12, foram semeadas, a partir de um estoque de bactéria permanente armazenado a -70oC, em uma placa de meio de cultura LB-ágar (Gibco) com 50 µg/mL de kanamicina ou 50 µg/mL de ampicilina (para TOP10/pcDNA3.1-scmu-IL-12) e cultivadas por 18 horas a 37oC. No dia posterior à preparação de cada placa, uma colônia de TOP10 de cada um dos clones de plasmídeo foi inoculada em um tubo de vidro estéril de 50 mL contendo 5 mL de meio de cultura LB (Gibco) com 50 µg/mL de kanamicina ou 50 µg/mL de ampicilina e cultivada por 8 horas a 37oC sob agitação constante de 250 rpm. Em seguida, 4 mL de cada pré-inóculo foi misturado a 2 litros de meio LB com 50 µg/mL de kanamicina ou 50 µg/mL de ampicilina resultando em uma diluição de 1:500. O volume total de cada cultura foi redistribuído em 5 frascos Erlenmeyers de 2000 mL, sendo 400 mL de cultura em cada um. Cada cultura foi incubada durante cerca de 18 horas a 37oC sob agitação constante de 250 rpm. O sedimento bacteriano de cada cultura foi obtido após centrifugação a 6000 x g, por 15 minutos, a 4oC e armazenado a -20oC até o momento do uso.

Para obtenção dos plasmídeos em fase aquosa/solúvel para posterior passagem na coluna de purificação foi realizada lise alcalina como recomendado pelo fabricante do kit de purificação. Então, cada sedimento bacteriano de TOP10 transformada com pBKCMV, pBKCMV-Lc9, pBKCMV-Lc13, pBKCMV-Lc14, pBKCMV-Lc18 ou pcDNA3.1-scmu-IL-12 foi ressuspenso

completamente com 200 mL de tampão P1 (50 mM Tris-Cl, pH 8,0; 10 mM EDTA; 100 µg/mL RNAse A) em um frasco Erlenmeyer de 1000 mL. Em seguida foram adicionados à suspensão bacteriana 200 mL de solução P2 (200mM NaOH, 1% SDS) e, após agitação suave por inversão de 4 a 6 vezes, incubados a temperatura ambiente por 5 minutos. Após este período de incubação foram adicionados 200 mL de solução P3 (3M acetato de potássio, pH 5,5) seguido novamente de agitação suave por inversão de 4 a 6 vezes seguida de incubação por 30 minutos no gelo. O lisado bacteriano de cada preparação foi transferido para frascos de centrifugação (Beckman Coulter, EUA) em volumes de aproximadamente 150 mL por frasco e centrifugados a 20.000 x g durante 30 minutos a 4o C. O sobrenadante foi removido, transferido para novos frascos e submetidos a centrifugação de 20.000 x g por 15 minutos a a 4o C. Após esta última centrifugação, o sobrenadante foi passado através de um filtro de pano de algodão para completa remoção de partículas.

Cada coluna utilizada para purificação dos plasmídeos foi preparada seguindo-se as instruções do fabricante. Resumidamente, 35 mL de tampão QBT (750mM NaCl; 50 mM MOPS, pH7,0; 15% isopropanol; 0,15% Triton X-100) foi utilizado para equilibrar cada coluna. A passagem de cada tampão pela coluna, assim como das amostras contendo plasmídeo, ocorreu por fluxo gravitacional. Após a aplicação da amostra foram adicionados a cada coluna 200 mL de tampão de lavagem QC (1M NaCl; 50 mM MOPS, pH 7,0; 15% isopropanol). A eluição foi feita com 35 mL de tampão QF (1,25 M NaCl, 50 mM Tris.Cl, pH 8,5; 15% de isopropanol). Cada eluato foi armazenado em tubos Falcon de 50 mL a 4o C até o momento da precipitação do DNA. Para a precipitação, foram adicionados 24,5 mL de isopropanol (Sigma, St Louis, EUA) para cada eluato. Após agitação suave, o material foi centrifugado a 5000 x g durante 60 minutos a 4o C. O sobrenadante da centrifugação foi descartado e cada sedimento obtido foi lavado com 3,5 mL de etanol 70% por centrifugação de 5000 x g durante 60 minutos a 4o C. Ao final, o sedimento contendo DNA plasmideal foi ressuspenso com cerca de 1 mL de água Mili Q, para armazenamento, ou solução salina [cloreto de sódio a 0,85 %, (Isofar)], para uso em injeções, e solubilizado a 65o C por cerca de 30 a 60 minutos. A concentração de plasmídeo e a pureza do material obtido foi determinada pela leitura de densidade óptica em filtro de 260 nm e 280 nm, respectivamente, em aparelho espectrofotômetro Ultrospec. Cerca de 100 ng de cada plasmídeo foi analisado em gel de agarose (Amersham Biosciences) a 1% corado com brometo de etídeo (Sigma-Aldrich) a 0,5 µg/mL em tampão Tris-acetato-EDTA (TAE; 20 mM de Tris, 0,1% de

ácido acético e 1 mM de EDTA – pH 8,0) após eletropforese por 1 hora a 80V. Uma amostra de marcadores de pares de bases (1 Kb DNA ladder; Invitrogen Corporation) também foi fracionado no gel. A migração das bandas presentes no gel foi documentada pelo sistema Eagle Eye II (Stratagene, La Jolla, CA, EUA). Os plasmídeos foram armazenados em alíquotas a -20 oC até o uso.