O Desenvolvimento de Vacinas

Apesar do extenso número de publicações acerca de avaliações de moléculas candidatas a vacina a imunoprofilaxia contra as leishmanioses ainda é um desafio. Até o presente, apenas um esquema de vacinação profilática contra a leishmaniose cutânea está em prática no Uzbequistão, o qual faz uso de um processo antigo de indução de resposta imune protetora, conhecido como “leishmanização” (GAFUROV, 1999; revisto em KHAMESIPOUR et al., 2006). Nesta vacina, uma mistura de promastigotas virulentas de L. major, vivas e mortas, isoladas a partir de uma lesão ativa, é administrada em crianças em idade escolar meses antes do início do ciclo de transmissão da doença. Apesar de eficaz, este é um método que apresenta inúmeros riscos, principalmente diante da atual situação frente a infecções por HIV.

Nenhuma vacina contra a leishmaniose visceral humana está em uso, em rotina, em qualquer parte do mundo. Nas últimas décadas, várias moléculas, frações ou subunidades, têm sido identificadas como potenciais candidatas a componentes de uma vacina contra leishmaniose visceral a partir de avaliações em modelos experimentais (Tabela 1). A preparação que se encontra em estágio mais avançado de investigação, inclusive já comercializada no Brasil, faz uso de uma preparação com uma fração protéica denominada ligante de manose-fucose (FML),

purificada a partir de isolados de L. donovani (PALATNIK et al., 1994). Esta preparação, proposta para uso em cães, já foi avaliada experimentalmente em diversos modelos e também em um estudo de fase III, com cães naturalmente expostos à infecção (DA SILVA et al., 2000). No entanto, diante de algumas incompreensões acerca da real efetividade desta vacina na eliminação ou redução da transmissão do parasito do cão para seres humanos, e assim, sobre o controle da leishmaniose visceral humana, o Ministério da Saúde do Brasil não autorizou seu uso como medida de controle da leishmaniose visceral (BRASIL, 2003). Assim, novos experimentos foram realizados na tentativa de solucionar esta questão (NOGUEIRA et al., 2005).

Diversos outros estudos de vacinação em cães foram realizados desde a última década. Além de preparações com frações purificadas de Leishmania, como a descrito anteriormente, tentativas do uso de parasitos mortos e antígenos recombinantes, em uma série de associações com adjuvantes compatíveis com o uso em cães, foram feitas objetivando induzir uma resposta imune protetora contra leishmaniose visceral canina (revisto em BARBIERI, 2006). O uso de promastigotas de L. brasiliensis e de L. infantum, mortas pelo uso de mertiolate ou pelo calor e associadas à BCG como adjuvante, apresentaram resultados promissores em avaliações de fase I e de fase II (MAYRINK et al., 1996, MOHEBALI et al., 2004), mas avaliações de campo não resultaram em proteção ou não foram ainda realizadas (GENARO et al., 1996).

A capacidade de indução de resposta imune protetora em cães tem sido observada também para antígenos secretados em cultura de promastigotas de L. infantum, LiESAp, administrado em associação ao adjuvante muramil dipeptídeo (MDP). Para esta combinação, uma eficácia protetora de 100% foi registrada após infecção experimental e esta proteção foi correlacionada com a indução de uma resposta imune específica tipo Th1, forte e duradoura (LEMERSE et al., 2005). Uma publicação recente apresenta os resultados da avaliação desta preparação em cães naturalmente expostos em uma área endêmica no sul da França, com uma taxa de proteção em torno de 92% num período de dois anos de acompanhamento (LEMERSE et al., 2007). A administração de preparações multicomponentes de antígenos recombinantes de L. infantum (proteína Q + BCG) e de L. infantum/chagasi [TSA, LeIF e LmSTI1 em associação à monofosforil lipídico (MPL)] resultou em alto índice de proteção (90%) contra infecção experimental em cães e capacidade de indução de anticorpos de isotipo IgG2a, respectivamente (MOLANO et al., 2003; FUGIWARA et al., 2005). Esta mesma preparação, quando avaliada em campo, não resultou em proteção significativa dos animais (GRADONI et al., 2005). Vale

ressaltar também que, em estudos anteriores, a produção de anticorpos neutralizadores contra proteínas de promastigotas de L. infantum em cães imunizados não resultou em proteção nos animais vacinados (OGUNKOLADE et al., 1988; DUNAN et al., 1989), o que reforça a associação entre resistência e imunidade mediada por células.

Tabela 1. Preparações antigênicas de moléculas candidatas a vacina, avaliadas no modelo murino

de leishmaniose visceral experimental.

Referência preparação Resultado (redução carga parasitária e citocinas)

1ª geração

STREIT et al., 2001 Infecção subclínica (injeção cutânea alta dose) promastigotas vivas L. chagasi

fígado (75%)

Produção de IFN-γ, IL-4 e IL-10 Não induz TGF-β

BRETON et al.,2005 L. tarentolae promastigotas

vivas

fígado (80%) e baço (85%) - 30 dias após desafio Produção de IFN-γ

IL-4 não detectável 2ª geração

WILSON et al., 1995d Lcr1/Adjuvante de Freund fígado (40%) e baço (37,5%)

proliferação e produção de IFN-γ (pt recomb. em células animais infectados)

SANTOS et al., 1999 FML/rIL-12 FML/BCG

FML/saponina R ou Quil A ou QS21

fígado – preparação FML/QS21 (79,2%) Acs IgG1 = IgG2a (maioria)

DTHa _{em todas combinações exceto BCG, sendo}

QS21 + elevado IFN-γ apenas FML/QS21

FML/IL-12 - falha em reduzir carga parasitária STAGER et al., 2000 rHASPB1 fígado e baço (até 90% após 80 dias infecção)

Resposta de Ac exclusivamente IgG1 com proliferação celular e produção de IFN-γ preferencialmente por T CD8+ e ausência de IL-4

DOLE et al.,2000 rORFF/rBT1 81% (baço e fígado)

Títulos elevados de anticorpos específicos e proliferação de esplenócitos.

PARAGUAI-DE-SOUZA

et al., 2001

gp36 purificada/saponina (R) fígado (68,1%)

Produção de Ac específicos IgG1 e IgG2a Proliferação células linfonodo e resposta de DTH

GHOSH et al., 2001a rA2 fígado - 89%

Produção de Ac específicos IgG1 e IgG2a

Proliferação de esplenócitos e produção elevada de IFN-γ. Animais imunizados e grupo controle apresentam produção de IL-4 a níveis similares

TONUI et al., 2003 LPG + BCG Induz resposta Th1 mas não protege

TEWARY et al., 2004a rORFF/ODN* fígado e baço (84%)

Produção anticorpos IgG1 e IgG2a

Proliferação celular e aumento produção de IFN-γ sem alteração níveis IL-4 em relação aos controles TEWARY et al., 2006 rORFF + pIL-12 82-83% fígado e no baço

Ac IgG1 e IgG2a específicos rORFF com proliferação celular, predomínio de IFN-γ e baixa produção IL-4

ROSA et al., 2007 rLIRIC1 e LIRIC2 baço 50,4% para LiRic1 e 66,9% para LiRic2 Induz proliferação celular e IFN-γ.

Diminuição produção IL-10 e IL-4 após estímulo in vitro. Forte participação células T CD4+

Referência preparação Resultado (redução carga parasitária e citocinas) 3ª. geração

MELBY et al., 2000 “biblioteca” de cDNA amastigota

baço até 1000x - 4 semanas após o desafio Produção de IFN-γ elevada

Produção de IL-4 e IL-10 não detectadas

GHOSH et al., 2001b A2 DNA 65% fígado

Produção de Ac específicos IgG1 e IgG2a Proliferação celular e produção de IFN-γ. Produção de IL-4 não difere dos controles. MARQUES-DA-SILVA

et al., 2005

p36 (LACK) DNA Não houve proteção no fígado e no baço Produção concomitante de IFN-γ e IL-10 TEWARY et al., 2005 rORFF/alum

ORFF-DNA ORFF-DNA primer / rORFF/alum booster

fígado e baço (DNA e DNA/pt) em torno de 75-80% Ac IgG2a > IgG1,

proliferação celular e produção de IFN-γ IL-4 produção mínima

AGUILAR-BE et al., 2005 rNH36/saponina NH36-DNA

fígado: 79% (NH36/sap) e 88% (NH36-DNA) Ac específicos IgG1 e IgG2a. (fraca)

Reação de DTH e aumento de 2-5x T CD4+

produtoras de IFN-γ (NH36-DNA) DONDJI et al.,2005 LACK-DNA primer

LACK-Vaccinia virus booster baço (9-30x), fígado (6-9x), linfonodo (144-244x). Produção de IFN-γ, TNF-alfa e IL-10 (IFN-γ > IL-10)

RAFATI et al., 2006 cpa-DNA/cpb-DNA primer (2x)

seguido por rCPA e rCPB

booster

(Montanide 720 e ODN)

fígado e baço (proteção completa) Predomínio Ac IgG2a

Produção de IFN-γ e IL-5

CARTER et al., 2007 γ-GCS DNA fígado (44%)

Ac IgG1 e IgG2a

Produção de IFN-γ similar aos controles

a _{DTH – reação de hipersensibilidade do tipo tardia} b_{ODN – oligonucleotídeos CpG não-metilados}

Vacinas de DNA Contra Leishmaniose Visceral

A imunização com moléculas de DNA capazes de expressar proteínas recombinantes in vivo é uma tecnologia recente que vem sendo amplamente avaliada como ferramenta para induzir a prevenção ou para o tratamento de doenças infecciosas (WAHREN, 1996; ALARCON et al., 1999). De um modo geral, neste sistema, os cDNAs de antígenos candidatos à vacina são clonados em vetores de expressão, apropriados para células de mamíferos, que utilizam a maquinaria da célula hospedeira necessária para a expressão do gene ou do fragmento do gene de interesse. Estes vetores podem ser injetados diretamente na pele ou no músculo e, rapidamente, são internalizados pelas células locais, onde, após translocação para o núcleo, ocorre a transcrição

do RNA mensageiro e, posteriormente, a produção da proteína recombinante (WOLFF & BUDKER, 2005). Assim, após processamento por células apresentadoras de antígenos e apresentação via moléculas do MHC, na dependência das características imunogênicas da proteína, ocorre a indução de uma resposta imune específica (TANG et al., 1992).

A magnitude e o perfil da resposta imune induzida após injeção de DNA plasmideal são dependentes de fatores relacionados ao antígeno produzido, a características específicas do vetor carreador do gene, e, ainda, da via de administração utilizada. Estudos baseados em avaliação das subclasses de anticorpos e padrão de citocinas têm demonstrado que a resposta imune induzida após injeção intramuscular com DNA plasmideal é preferencialmente do tipo Th1. Este perfil de resposta imune foi observado, inicialmente, em camundongos imunizados com plasmídeocodificando a proteína β-galactosidase, nos quais ocorre uma produção acentuada de anticorpos de isotipo IgG2a e secreção de IFN-γ por células T CD4+, mas não a secreção de IL-4 ou IL-5. Um padrão inverso, com produção de anticorpos de isotipo IgG1 e secreção de citocinas tipo Th2, foi encontrado quando a mesma proteína foi administrada em salina ou hidróxido de alumínio como adjuvante (RAZ et al., 1996). Credita-se a capacidade imunoestimulatória da injeção com DNA a sequências repetitivas de nucleotídeos presentes na molécula de plasmídeo. Estas sequências consistem de dinucleotídeos não-metilados de citosina-fosfato-guanosina (CpG) que podem diretamente estimular células do sistema imune (HALPERN et al., 1996; KLINMAN

et al., 1997; LECLERC et al., 1997).

O primeiro estudo em que foi feita a avaliação de um candidato a vacina sob a forma de DNA contra leishmaniose foi publicado há pouco mais de 10 anos (XU & LIEW, 1994). Neste trabalho foi registrado que a injeção intramuscular de um plasmídeo, capaz de expressar em células eucarióticas o gene gp63, induziu uma forte resposta imune tipo Th1 em camundongos, assim como, uma significante proteção contra infecção por L. major. Subseqüentemente, vários foram os relatos de moléculas candidatas a vacina contra leishmaniose cutânea administradas sob a forma de DNA (GURUNATHAN et al., 1997; SJOLANDER et al., 1998; RAFATI et al., 2001; MENDEZ et al., 2001; SEREZANI et al., 2002; DUMONTEIL et al., 2003; IBORRA et al., 2003; CAMPBEL et al., 2003). A mesma abordagem, para avaliação de moléculas candidatas a uma vacina contra a leishmaniose visceral, tem sido recentemente explorada (Tabela 1).

As proteínas recombinantes A2 (amastigote-specific), ORFF (open read frame F), NH36 (nucleoside hidrolase 36) e CPA/CPB (cisteína proteases), produzidas in vivo após injeção de

plasmídeos recombinantes, foram capazes de induzir a produção de anticorpos específicos de isotipo IgG2a, proliferação celular e produção de IFN-γ em camundongos BALB/c, características típicas de uma resposta imune predominantemente do tipo Th1. A resposta obtida para cada uma destas proteínas foi associada a diversos níveis de proteção contra a infecção, tanto no fígado como no baço dos animais desafiados (GHOSH et al., 2001; SUKUMARAN et al., 2003; AGUILAR-BE et al., 2005; RAFATI et al., 2006). Há apenas três relatos na literatura onde a injeção com plasmídeo recombinante não foi capaz de induzir proteção contra

Leishmania. Dois destes registros mostram que a administração de proteína LACK sob a forma

de DNA apesar de altamente imunogênica, com perfil claro de resposta imune tipo Th1, não conferiu proteção em camundongos BALB/c, quer seja contra L. donovani ou L.

infantum/chagasi (MELBY et al., 2001; MARQUES-DA-SILVA et al., 2005), apesar de sua

eficácia no controle de lesões cutâneas induzidas por L. major (GURUNATHAN et al., 1997). O terceiro registro é de um caso em que uma resposta imune tipo Th2, induzida pela proteína Meta 1, não pode ser revertida para Th1 mesmo quando a injeção com plasmídeo recombinante foi utilizada (SEREZANI et al., 2002).

Até o presente, pelo menos três avaliações de possíveis candidatos a componentes de uma vacina de DNA contra a leishmaniose visceral foram realizadas no modelo canino de infecção experimental. Uma preparação com 10 diferentes cDNAs (H2A, H2B, H1, H3, H4, p36 – LACK, PSA-2, TSA, STI1 e ARP-1) de L. donovani, todos sob a forma de plasmídeo, foram utilizados em um protocolo de imunização e posterior desafio com L. donovani (SALDARRIAGA et al., 2006). Nos outros dois estudos foram avaliados protocolos de imunização heteróloga, nos quais a primeira injeção foi realizada com plasmídeos capazes de codificar a proteína LACK ou as cisteínas proteínases CPA e CPB de L. infantum/chagasi e, posteriomente, um reforço feito com o vírus vaccinia capaz de expressar a proteína LACK e a administração das cisteínas proteínases recombinantes, respectivamente. (RAMIRO et al., 2003; RAFATI et al., 2005).

O protocolo de administração de LACK-DNA (plasmídeo seguido de vírus vaccinia), e posterior desafio com L. infantum/chagasi, conferiu proteção em 60% dos animais vacinados, acompanhados durante um período de 17 meses (RAMIRO et al., 2003). Proteção contra o desafio com L. infantum, em cães, também foi observada após imunização com DNAcodificando cisteínas proteínases seguido de reforço com as proteínas recombinantes. Neste estudo, células mononucleares de sangue periférico de animais imunizados apresentaram uma capacidade

proliferativa específica e produção de RNA mensageiro para IFN-γ elevada quando comparados aos animais do grupo controle não vacinados. Também o perfil da produção de anticorpos e a capacidade de responder ao teste intradérmico de Montenegro foram diferentes entre os grupos, com aumento de IgG2a e reação positiva no grupo imunizado. Além disso, após o desafio com L.

infantum/chagasi, parasitos foram identificados apenas em material da medula óssea do grupo

controle não imunizado (RAFATI et al, 2005). Uma resposta imune com as características descritas acima, também foi observada após a administração da preparação multicomponente em cães (SALDARRIAGA et al., 2006). Neste estudo, o controle da multiplicação do parasito nos linfonodos drenantes ocorreu, nos animais imunizados, após o desafio por L. infantum/chagasi logo na fase inicial da infecção, mas não foi capaz de impedir a disseminação para outros órgãos. Avaliações de fase III para preparações baseadas em imunização com DNA plasmideal não foram realizadas até o momento.

Dentre as várias estratégias utilizadas para identificação de antígenos com potencial para uso em uma vacina, a busca por antígenos que ocorrem no estágio intracelular de Leishmania é freqüentemente utilizada (WILSON et al., 1995; MELBY et al., 2000; MARTINS et al., 2006). A forma amastigota das diversas espécies de Leishmania é a que persiste no interior de células do sistema monofagocítico do hospedeiro vertebrado. Dessa maneira, uma resposta imune protetora deve ser induzida para antígenos expressos neste estágio (McMAHON-PRATT et al., 1998). Assim, nosso grupo de pesquisa confeccionou uma biblioteca de cDNA de formas amastigotas de

L. chagasi e, diferentemente de outros grupos, os antígenos identificados nesta biblioteca foram

selecionados a partir do uso de um pool de soro de cães infectados obtidos de uma área endêmica para leishmaniose visceral (TEIXEIRA et al., 2007). Estes animais apresentavam além de resposta imune humoral, resposta celular com DTH positivo para antígenos de L.

infantum/chagasi. Dessa forma, apenas antígenos naturalmente reconhecidos pelo sistema imune

canino foram selecionados.

Considerando-se que uma vacina canina efetiva contra a leishmaniose visceral deve, em princípio, ser capaz de induzir uma resposta imune predominantemente celular do tipo Th1, a identificação de antígenos, adjuvantes e/ou métodos de imunização que propiciem uma resposta com estas características deve ser o alvo para a obtenção desta vacina. Como demonstrado em experimentos anteriores, o uso de injeções de DNA tem levado a resultados bastante promissores neste sentido (RAMIRO et al., 2003; RAFATI et al., 2005; SALDARRIAGA et al., 2006). Além

disso, a imunização com plasmídeo tem a vantagem de ser altamente estável, reprodutível e de baixo custo. Estes fatores, somados à capacidade de indução de uma resposta imune protetora que seja capaz de impedir e/ou controlar a infecção em cães e contribuir para a interrupção do ciclo de transmissão do parasito para seres humanos, serão avaliados em uma vacina que venha substituir os métodos atualmente empregados para o controle da leishmaniose visceral.

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Avaliar diferentes protocolos de imunização na indução de resposta imune, em camundongos, a moléculas candidatas a componentes de uma vacina contra leishmaniose visceral canina.

3.2. Objetivos específicos

1. Avaliar a capacidade de indução de resposta imune humoral e celular contra antígenos recombinantes de L. chagasi, injetados em camundongos sob forma de plasmídeo, isoladamente ou como uma combinação de plasmídeos ou, ainda, após injeção inicial com DNA e reforço com a proteína recombinante correspondente, nos seguintes aspectos:

a) Produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1; b) Resposta proliferativa de esplenócitos após estimulação específica in vitro; c) Produção de citocinas (IFN-gama, IL-4 e IL-5) em sobrenadantes de

esplenócitos após estimulação específica in vitro.

2. Avaliar a capacidade de antígenos recombinantes de L. chagasi, administrados isoladamente sob a forma de plasmídeo ou como uma combinação de plasmídeos, em induzir proteção e/ou controle contra infecção homóloga em camundongos.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Antígenos