INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
TESE DE DOUTORADO
AVALIAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA INDUÇÃO
DE RESPOSTA IMUNE CONTRA ANTÍGENOS
RECOMBINANTES DE Leishmania chagasi
LENITA RAMIRES DOS SANTOS
Salvador-Bahia
2007
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS - GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
TESE DE DOUTORADO
AVALIAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA INDUÇÃO
DE RESPOSTA IMUNE CONTRA ANTÍGENOS
RECOMBINANTES DE Leishmania chagasi
LENITA RAMIRES DOS SANTOS
Orientador: Dr. Geraldo Gileno de Sá Oliveira
Salvador-Bahia
2007
Tese apresentada ao Curso de Pós-graduação em Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia para obtenção do grau de Doutor em Imunologia
AVALIAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA INDUÇÃO
DE RESPOSTA IMUNE CONTRA ANTÍGENOS
RECOMBINANTES DE Leishmania chagasi
LENITA RAMIRES DOS SANTOS
Folha de Aprovação
COMISSÃO EXAMINADORA
Dra Fabíola Cardillo -Pesquisadora Associada - CPqGM-FIOCRUZ-BA
______________________________________________________________________________ Dr. Alan McBride – Pesquisador Visitante - CPqGM-FIOCRUZ-BA
______________________________________________________________________________ Dr. Nicolaus Albert Borges Schriefer – Professor da Pós-graduação em Imunologia – UFBA ______________________________________________________________________________ Dr. Roberto José Meyer Nascimento – Professor da Pós-graduação em Imunologia - UFBA ______________________________________________________________________________ Dr. Geraldo Gileno de Sá Oliveira – Pesquisador Associado– CPqGM-FIOCRUZ-BA-
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Patologia e Bio-Intervenção (LPBI) do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz (CpqGM) - BA da Fundação Instituto Oswaldo Cruz com recursos financeiros do Programa RENORBIO (MCT), Programa INOVABIO
Dedico esta tese a minha família, que soube compreender mais este período de ausência...
Em especial à Julinha, que não se cansa de dizer:
AGRADECIMENTOS
Os meus sinceros agradecimentos ao Dr. Geraldo Gileno de Sá Oliveira, por ter confiado a mim uma parte tão importante de seu trabalho. Agradeço também por sua orientação e pelo exemplo de conduta profissional.
Ao Dr. Lain Carlos Pontes de Carvalho, pelo acompanhamento ao longo de todo o trabalho e pelas sugestões e correções nas etapas finais de elaboração da tese. Agradeço também ao Dr. Washington Luís Conrado dos Santos, pelas sugestões e incentivos, científicos e culturais, durante todo o período em que estive no laboratório.
Ao Dr. Edmilson Domingos da Silva (Biomanguinhos-RJ), pela produção e purificação de parte das proteínas recombinantes utilizadas neste estudo.
Ao Dr. Oswaldo Pompílio (CPqAM-PE), pelas subclonagens de dois clones utilizados e sequenciamento dos insertos dos plasmídeos utilizados neste trabalho.
Ao Dr. Yuri Pepe (Departamento de Física-UFBA), pela elaboração do aparelho de eletroporação e à Dra. Stella Maria Barrouin-Mello (UFBA), que esteve à frente na confecção deste equipamento e nos primeiros experimentos utilizando eletroporação em nosso laboratório.
A Ricardo Fraga, Cristiane Pinheiro, Patrícia Meira, Elivani Sacramento, Andréa
Mendes, Diego Moura e Valdir Cerqueira pelo apoio na execução de diversos experimentos
aqui descritos.
Aos demais colegas do LPBI, pelo agradável convívio e incentivo, em especial à Micely
Hermida e Cláudia Santana, companheiras de defesa.
Ao Programa de Pós-graduação em Imunologia da Universidade Federal da Bahia, pelos ensinamentos proporcionados e apoio administrativo e à Fundação Instituto Oswaldo
Cruz, por disponibilizar toda sua infra-estrutura possibilitando a execução deste trabalho.
A todas as pessoas que participaram da realização deste estudo através de inúmeras contribuições técnicas e administrativas:
Ana Maria Fiscina (Biblioteca-CPqGM)
Fabienne Petitinga de Paiva (Biotério-CPqGM)
Rejane Márcia Chaves de Menezes (Biotério-CPqGM) José Fernando Oliveira Costa (LETI-CPqGM)
Matheus Santos de Sá (LETI-CPqGM) Sérgio Vasconcelos (LPBI-CPqGM)
Em especial, meus agradecimentos à Gyselle Baccan e Sebastião Martins de Souza
Neto, pelo incentivo, sugestões e apoio em todas as etapas deste trabalho e pela compreensão,
RESUMO
AVALIAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA INDUÇÃO DE RESPOSTA IMUNE CONTRA ANTÍGENOS RECOMBINANTES DE Leishmania chagasi. Lenita Ramires dos Santos. A leishmaniose visceral (LV), causada pela L. infantum/L. chagasi, é uma doença infecciosa na qual o cão doméstico é considerado o principal reservatório do agente causal. Uma vacina canina efetiva pode contribuir para o controle da LV tanto no homem como no cão. Nosso grupo de pesquisas está avaliando um painel de proteínas recombinantes de formas amastigotas de L.
chagasi a fim de identificar potenciais candidatos à vacina. Neste estudo, foram testados
diferentes protocolos de imunização objetivando induzir uma resposta imune específica tipo Th1 para tais moléculas candidatas. Grupos de camundongos BALB/c foram injetados 3 vezes em intervalos de 3 semanas, com (a) salina, (b) plasmídeo pBK-CMV vazio, (c) pBK-CMV-Lc9, (d) pBK-CMV-Lc13, (e) pBK-CMV-Lc14, (f) pBK-CMV-Lc18; (g) uma mistura de plasmídeos ou (h) uma mistura de plasmídeos associado a pcDNA.3.1-sc-muIL-12. Os plasmídeos foram injetados por via intramuscular seguida de eletroporação. Três outros grupos de animais foram introduzidos no estudo e injetados com (i) uma mistura de plasmídeos por via intramuscular sem eletroporação e (j) Lc9 recombinante (rLc9) associada à saponina e (k) plasmídeo pBK-CMV-Lc9 nas duas primeiras séries de injeções e rpBK-CMV-Lc9/saponina na terceira e última injeção. Após a terceira série de injeções, a produção de anticorpos específicos da classe IgG, assim como a produção de anticorpos das subclasses IgG1 e IgG2a, foram avaliadas por ELISA e a resposta imune celular foi avaliada em termos de resposta proliferativa e produção de citocinas (IFN-γ, IL-4, IL-5). No dia 30 e 90 após a terceira série de injeções, os grupos de camundongos de (a) a (i) foram desafiados pela injeção de L. chagasi e a carga parasitária no baço foi determinada, respectivamente. Os grupos injetados com pBK-CMV-Lc9 e pBK-CMV-Lc14 produziram anticorpos específicos da subclasse IgG, com predomínio de anticorpos da subclasse IgG2a. A indução de resposta imune celular foi evidenciada após o desafio com promastigotas de
L.infantum/chagasi pela produção específica de IFN-γ no grupo injetado com pBK-CMV-Lc9
(12,77 ng/mL, p < 0,05) e resposta proliferativa em células do grupo de animais injetado com pBK-CMV-Lc14. A produção de IFN-γ foi induzida também após a injeção de uma mistura de plasmídeos associado a pcDNA3.1-scmu-IL-12 após estimulação in vitro com rLc9, antes (0,32 ng/mL, p < 0,05) e após o desafio (7,7 ng/mL, p < 0,05). Entretanto, em apenas dois de seis animais do grupo injetado com pBK-CMV-Lc9 houve diminuição da carga parasitária no baço. Provavelmente a intensidade da resposta imune específica induzida não foi forte o suficiente para induzir proteção nos animais imunizados. O protocolo de imunização com a administração inicial de DNA plasmideal pBK-CMV-Lc9 seguida de reforço com a proteína rLc9/saponina foi capaz de aumentar a intensidade da resposta imune específica. Novos experimentos serão realizados a fim de explorar a capacidade protetora induzida por Lc9, neste e em outros esquemas de imunização.
ABSTRACT
EVALUATION OF PROTOCOLS TO INDUCE IMMUNE RESPONSE AGAINST RECOMBINANT ANTIGENS OF Leishmania chagasi. Lenita Ramires Dos Santos. Visceral leishmaniasis (VL) caused by L. infantum/L. chagasi is an infectious disease which dogs are considered the major reservoir of the causal agent. An effective canine vaccine might contribute to human and dog VL control. Our group is evaluating a panel of L. chagasi amastigote recombinant proteins to identify potential vaccine candidate antigens. In this study we tested different immunization protocols aiming to induce a specific Th1 immune response. Groups of BALB/c mice were injected 3 times, at 3-week intervals, with (a) saline; (b) pBK-CMV empty plasmid; (c) pBK-CMV-Lc9, (d) pBK-CMV-Lc13, (e) pBK-CMV-Lc14, (f) pBK-CMV-Lc18; (g) a pool of plasmid or (h) a pool of plasmid associated to pcDNA.3.1-sc-muIL-12. Plasmid DNA was injected through intramuscular injections followed by electroporation. In addition, three another groups of animals were used: (i) pool of plasmid without electroporation; (j) Lc9 recombinant protein (rLc9) associated to saponin as adjuvant and (k) pBK-CMV-Lc9 twice and once with rLc9 (protein). After immunization, specific total IgG as well as IgG1 and IgG2a isotypes were measure by ELISA and cellular immune response was assessed by lymphoproliferative assays and cytokine production (IFN-γ, IL-4, IL-5). At 30 and 90 days after immunization, mice from groups (a) to (i) were challenged by L. chagasi and the splenic parasite burden was determined, respectively. The mice immunized with Lc9, pBK-CMV-Lc14 and pBK-CMV-Lc18 developed specific total IgG production with, almost, exclusively IgG2a isotype. The immune cellular immune response was showed after challenge with L.
infantum/chagasi by specific IFN-γ production in the group that was injected with
pBK-CMV-Lc9 (7.7 ng/mL, p < 0.05) and proliferative response by splenic cells of pBK-CMV-Lc14 group (p < 0.05). The IFN-γ production was induced also after injection of a pool of plasmid in association with pcDNA3.1-scmu-IL-12 and in vitro stimulation with rLc9, before (0.32 ng/mL, p < 0.05) and after challenge (12.77 ng/mL, p < 0.05). However, only in two out of six mice of the pBK-CMV-Lc9 injected group a reduction of spleen parasite burden was observed. Probably, the specific immune response intensity was not strong enough to induce protection in the immunized animals. The DNA primer/protein booster immunization protocol was able to increase the intensity of the Th1 specific immune response to rLc9 protein. Experiments are underway to assess a possible protective response to these and others immunization schedules.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1,
reativos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi, de animais injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente...68
FIGURA 2. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1,
reativos a Lc9 ou Lc14, de animais injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente...70
FIGURA 3. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG, reativos a Lc18, de animais
injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente...71
FIGURA 4. Avaliação de proliferação celular e produção de IFN-γ por células esplênicas de
camundongos injetados com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, após cultivo com concanavalina A (Con A) ou extrato bruto de L. chagasi...74
FIGURA 5. Avaliação de proliferação celular e produção de IFN-γ por células esplênicas de
camundongos injetados com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, após cultivo com proteínas recombinantes de L. chagasi...76
FIGURA 6. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1
reativos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi em animais previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente, .após a infecção por L. chagasi...78
FIGURA 7. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG reativos a proteínas
recombinantes de L. chagasi em animais previamente injetados com plasmídeos recombinantes
administrados isoladamente, .após a infecção por L.
chagasi...80
FIGURA 8. Avaliação de resposta proliferativa e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, após injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, em animais previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente...83
FIGURA 9. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente, após a injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc9 recombinante...86
FIGURA 10. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente, após a injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc14 recombinante...89
FIGURA 11. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente, após a injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc18 recombinante...92
FIGURA 12. Avaliação da capacidade de proteção e/ou controle da infecção por L. chagasi em
animais previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente...94
FIGURA 13. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1,
reativos ao extrato bruto de antígenos de promastigotas de L. chagasi, de animais injetados com um pool de plasmídeos recombinantes...96
FIGURA 14. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, injetados com um pool de plasmídeos recombinantes, após cultivo com concanavalina A (Con A) ou extrato bruto de antígenos de L. chagasi...99
FIGURA 15. Avaliação de proliferação celular e produção de IFN-γ por células esplênicas de
camundongos injetados com um pool de plasmídeos recombinantes, após cultivo com proteínas recombinantes de L. chagasi...102
FIGURA 16. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1, reativos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi, de animais previamente injetados com um
pool de plasmídeos recombinantes e desafiados pela injeção de promastigotas de L. chagasi...104
FIGURA 17. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de camundongos, previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes e desafiados pela injeção de promastigotas de L. chagasi, após cultivo com concanavalina A (Con A) ou extrato bruto de antígenos de L. chagasi...107
FIGURA 18. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes e desafiados pela injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc9 recombinante...109
FIGURA 19. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes e desafiados pela injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc14 recombinante...113
FIGURA 20. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes e desafiados pela injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc18 recombinante...114
FIGURA 21. Avaliação da capacidade de proteção e/ou controle da infecção por L. chagasi. em
animais previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes...116
FIGURA 22. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1,
reativos a extrato bruto de antígenos de L. chagasi, de animais injetados com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9...118
FIGURA 23. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1,
reativos a Lc9, de animais injetados com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9...120
FIGURA 24. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, injetados com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9, após cultivo com concanavalina A (Con A)...122
FIGURA 25. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de
camundongos, injetados com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9, após cultivo com Lc9...126
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Preparações antigênicas de moléculas candidatas a vacina, avaliadas no modelo
murino de leishmaniose visceral experimental...38
TABELA 2. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente...72
TABELA 3. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados na presença ou na ausência de proteínas recombinantes de L. chagasi, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente...75
TABELA 4. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
de cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de camundongos submetidos previamente a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, e desafiados com promastigotas de L. chagasi...82
TABELA 5. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados com Lc9 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos previamente a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, e desafiados com promastigotas de L. chagasi...85
TABELA 6. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados com Lc14 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos previamente a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, e desafiados com promastigotas de L. chagasi...88
TABELA 7. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados com Lc18 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, e desafiados com promastigotas de L. chagasi...91
TABELA 8. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos...98
TABELA 9. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos
de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos, cultivados na presença ou na ausência de proteínas recombinantes de L. chagasi...101
TABELA 10. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por
esplenócitos cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos e desafiados com promastigotas de L. chagasi...106
TABELA 11. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por
esplenócitos cultivados em meio de cultura ou meio de cultura com Lc9 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos, e desafiados com promastigotas de L. chagasi...111
TABELA 12. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por
esplenócitos cultivados em meio de cultura ou meio de cultura com Lc14 ou Lc18 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos, e desafiados com promastigotas de L. chagasi...112
TABELA 13. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por
esplenócitos cultivados com concanavalina A, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9...121
TABELA 14. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por
esplenócitos cultivados com Lc9 em diferentes concentrações, obtidos .de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9...125
LISTA DE ABREVIATURAS
DMSO Dimetilsufóxido
cDNA ácido desoxirribonucleico complementar
DNA ácido desoxirribonucleico
CpG citosina-fosfato-guanosina
Con A concanavalina A
D.O. densidade óptica
EDTA ácido etilenodiaminotetracético
EL eletroporação
ELISA ensaio imunoenzimático
GM-CSF fator estimulador de colôniasde granulócitos e monócitos
IFN-γ interferon gama
Ig imunoglobulina
IL interleucina
IPTG isopropil-β−D-thiogalactosídeo
HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil) piperazina-1-etano- sulfônico
LB Luria Bertani
LC leishmaniose cutânea
LMC leishmaniose mucocutânea
LV leishmaniose visceral
LVZ leishmaniose visceral zoonótica
LCPK leishmaniose cutânea pós-kalazar
MDP muramil dipeptídeo
MHC complexo principal de histocompatibilidade
MS Ministério da Saúde
MPL monofosforil lipídico
NK natural killer
PMSF fluoreto de fenilmetilsufonila
RPMI 1640 Meio 1640 do Instituto Roswell Park Memorial
SBF soro bovino fetal
SDS-PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida
TAE tris-acetato-EDTA
Th T helper
TNF-α fator de necrose tumoral alfa
SUMÁRIO
RESUMO ABSTRACT LISTA DE ABREVIATURAS 1. INTRODUÇÃO E RELEVÂNCIA... 19 2. REVISÃO DE LITERATURA... 222.1. Leishmaniose – Aspectos Gerais ... 22
2.2. Leishmaniose Visceral... 24
2.2.1. Aspectos Epidemiológicos ... 24
2.2.2. Aspectos Clínicos da Leishmaniose Visceral... 26
Em Seres Humanos... 26
Em Cães... 27
2.2.3. A Resposta Imune na Leishmaniose Visceral ... 28
Aspectos Gerais da Imunidade na Leishmaniose ... 28
Leishmaniose Visceral Humana ... 30
Leishmaniose Visceral Canina ... 33
Leishmaniose Visceral Experimental – O Modelo Murino... 34
2.3. O Controle da Leishmaniose Visceral ... 36
2.3.1. O Desenvolvimento de Vacinas ... 37 3. OBJETIVOS ... 46 3.1. Objetivo Geral ... 46 3.2. Objetivos específicos... 46 4. MATERIAL E MÉTODOS ... 47 4.1 Antígenos ... 47
4.1.2 Produção de antígenos recombinantes de Leishmania chagasi... 49
Cultivo de E. coli e indução da produção de antígenos recombinantes ... 49
Purificação de antígenos recombinantes de L. chagasi ... 51
Obtenção de proteínas solúveis ou sob a forma de corpúsculos de inclusão ... 51
Purificação em coluna de afinidade... 52
4.1.3 Obtenção de plasmídeos para imunização... 54
Purificação de plasmídeos pBK-CMV com insertos de antígenos recombinantes de L. chagasi e de plasmídeocodificando IL-12 murina - pcDNA3.1-scmu-IL12... 55
4.2 Animais ... 57
4.3 Imunização ... 57
4.4. Infecção com Leishmania chagasi ... 59
4.5. Avaliação da resposta imune ... 59
4.5.1 Avaliação da resposta imune humoral... 59
Mensuração de anticorpos da classe IgG por ELISA... 60
Avaliação de anticorpos das subclasses IgG1 e IgG2a por ELISA... 61
4.5.2 Avaliação da resposta imune celular ... 62
Avaliação de proliferação celular... 62
ELISA para quantificação de IFN-γ, IL-4 e IL-5 de camundongo... 64
4.6. Avaliação de proteção contra desafio com Leishmania chagasi... 66
4.6.1. Determinação de carga parasitária... 66
4.7. Análise estatística... 67
5. RESULTADOS ... 68
5.1. Avaliação da resposta imune em camundongos injetados com plasmídeos codificando proteínas de L. chagasi ... 68
5.1.3. Avaliação da resposta imune humoral após desafio com L. chagasi ... 79
5.1.4. Avaliação da resposta imune celular após desafio com L infantum/chagasi ... 83
5.1.5. Avaliação de proteção contra infecção por L. chagasi... 95
5.2. Avaliação da resposta imune em camundongos injetados com uma combinação de plasmídeos codificando proteínas de L. chagasi ... 97
5.2.1. Avaliação da resposta imune humoral... 97
5.2.2. Avaliação da resposta imune celular ... 99
5.2.3. Avaliação da resposta imune humoral após desafio com L.infantum/chagasi... 105
5.2.4. Avaliação da resposta imune celular após desafio com L. chagasi... 107
5.2.5. Avaliação de proteção contra infecção por L. chagasi... 117
5.3. Avaliação da resposta imune em camundongos injetados DNA plasmideal seguido por proteína recombinante – DNA primer/proteína booster... 119
5.3.1. Avaliação da resposta imune humoral... 119
5.3.2. Avaliação da resposta imune celular ... 123
6. DISCUSSÃO ... 129
7. CONCLUSÕES... 142
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 143
9. APÊNDICES ... 164
9.1. Apêndice A – Desenho experimental... 165
9.2. Apêndice B - Foto do Aparelho eletroporador...166
9.3. Apêndice C – Mapa qualitativo das respostas imunes aos diferentes imunógenos em ensaios com e sem desafio com L. chagasi...167
9.4. Apêndice D – Manuscrito – primeira versão – a ser submetido posteriormente para publicação em revista científica indexada...168
1. INTRODUÇÃO E RELEVÂNCIA
Doenças parasitárias causadas por protozoários constituem um dos maiores problemas em saúde pública no mundo. Várias das doenças causadas por estes microorganismos são as maiores causas de mortalidade e de morbidade em países tropicais, principalmente naqueles considerados em desenvolvimento.
A leishmaniose visceral é uma doença causada por parasitos protozoários do gênero
Leishmania. Em sua forma clássica, a doença caracteriza-se pelo comprometimento de órgãos
internos como o fígado e o baço de indivíduos infectados, a partir da disseminação do parasito (EVANS et al., 1985; de BEER et al., 1991). É uma das formas mais graves de leishmaniose, sendo fatal quando não tratada.
Em todo o mundo estima-se que 500.000 mil casos de leishmaniose visceral sejam registrados anualmente (World Health Organization - WHO, 2002). No Brasil, onde a leishmaniose visceral é causada pela L. infantum/chagasi, a doença era considerada típicamente de ambientes rurais. Atualmente, há um grande aumento no número de casos registrados em várias regiões do país, inclusive em áreas urbanas e suburbanas de grandes cidades (COSTA et al., 1990; JERONIMO et al., 1994; MARZOCHI et al., 1994).
Na forma zoonótica da leishmaniose visceral, o cão doméstico é o principal reservatório do agente causal (DEANE & DEANE, 1954; LAINSON et al., 1987; MORENO-ALVAR et al., 2002). O elevado parasitismo na pele de cães infectados, possivelmente mesmo sem apresentação de sinais característicos da doença, propicia a infecção de insetos vetores e, consequentemente, a transmissão para o homem (MOLINA et al., 1994).
A estratégia de controle da leishmaniose visceral zoonótica adotada pelo Ministério da Saúde do Brasil, compreende pelo menos quatro medidas. São elas: o diagnóstico e tratamento de casos humanos da doença, atividades de educação em saúde, controle do inseto vetor com borrifação de inseticidas e a identificação e eliminação de cães errantes ou com diagnóstico positivo de infecção por Leishmania (BRASIL, 2003). No entanto, essas medidas não têm sido sistematicamente realizadas e por um tempo suficientemente longo e, possivelmente por isso, não apresentam a eficácia necessária ao controle da doença. Isso ocorre, em parte, porque tais
medidas são de difícil execução e de alto custo, o que implicaria em um maior investimento de recursos na área de Saúde Pública.
A eliminação de cães infectados, identificados por inquérito sorológico, como medida efetiva no programa de controle da leishmaniose visceral zoonótica, tem sido questionada (DIETZE et al., 1997; ASHFORD et al., 1998; COURTENAY et al., 2002). Inclusive, tal medida não é bem aceita pela comunidade, o que dificulta, em parte, sua implementação. No entanto, há um consenso geral de que o controle da infecção canina pode reduzir a prevalência da doença humana em áreas endêmicas para leishmaniose visceral. Uma alternativa proposta para alcançar este controle seria o desenvolvimento de uma vacina efetiva contra a leishmaniose visceral canina (TESH, 1995; DYE, 1996). Como no Brasil o uso de medicamentos para o tratamento da leishmaniose visceral não é recomendado para o cão (BRASIL, 2003), a imunoprofilaxia canina atenderia interesses tanto na área de Saúde Pública como em Medicina Veterinária.
O desenvolvimento de uma vacina para o cão é vantajoso por vários motivos. Economicamente, o desenvolvimento de uma vacina canina é extremamente viável. O custo e o tempo necessário para o desenvolvimento de uma vacina para o cão seriam menor que para uma vacina para seres humanos. A experiência no país com programas de vacinação animal, como o da vacina anti-rábica canina, é bem sucedida, com campanhas de vacinação de ampla abrangência. Além disso, uma vacina para o cão teria grande aceitação pela comunidade em áreas endêmicas, pois evitaria o sacrifício dos animais, como proposto atualmente.
Visando o desenvolvimento de uma vacina contra a leishmaniose visceral canina, nosso grupo de pesquisas vem trabalhando na identificação, produção e análise de moléculas candidatas a componentes de uma vacina, quer seja, antígenos de Leishmania, como também moléculas imunomoduladoras, como citocinas caninas. Assim, considerando que hospedeiros vertebrados infectados por Leishmania apresentam a forma intracelular do parasito e que a indução da resposta imune específica ocorre para antígenos expressos neste estágio, uma biblioteca de cDNA de formas amastigotas de L. infantum/chagasi foi confeccionada por um dos pesquisadores de nosso grupo (TEIXEIRA et al., 2007), com o objetivo de identificar antígenos em potencial para o desenvolvimento de uma vacina. Clones desta biblioteca, reativos a amostras de soro de cães naturalmente infectados, foram selecionados e as proteínas recombinantes correspondentes foram produzidas, sendo que algumas delas já estão em fase de avaliação. Em experimentos iniciais, dois destes antígenos, denominados Lc9 e Lc13, foram administrados em cães saudáveis em
associação ao adjuvante saponina. Os animais injetados com esta preparação montaram uma resposta imune humoral específica intensa, mas, nestes experimentos, a indução de resposta imune celular não foi observada (SANTOS, 2007), resultado este contrário ao tipo de resposta imune específica que se espera induzir para obtenção de proteção contra infecção por Leishmania em cães. No cão, a capacidade de controlar a infecção e apresentar resistência ao estabelecimento da doença, como vista em animais infectados assintomáticos, parece ser dependente da indução de uma resposta imune celular específica do tipo Th1 (PINELLI et al., 1994; PINELLI et al., 1995; RHALEM et al., 1999a). As células Th1 estão envolvidas, principalmente, na produção de IFN-γ e conseqüentemente, na ativação de macrófagos e destruição de parasitos intracelulares.
Em uma etapa posterior, em experimentos realizados em camundongos, a injeção da proteína recombinante Lc9 induziu uma resposta imune específica, humoral e celular, com característica tipicamente Th2. Assim, o uso de diferentes adjuvantes foi avaliado na tentativa de se obter uma reversão do perfil de resposta imune induzida para Lc9. De cinco adjuvantes testados, apenas a combinação do antígeno recombinante à saponina foi capaz de levar a uma resposta específica contra Lc9 com produção mista de anticorpos IgG das subclasses IgG2a e IgG1 e das citocinas IFN-γ e IL-5 (FRAGA, 2007).
Diante destas observações, foi proposto no presente trabalho a avaliação de diferentes protocolos de imunização, em camundongos, para a definição de condições adequadas para a indução de resposta imune do tipo Th1 à moléculas candidatas a componentes de uma vacina contra leishmaniose visceral canina. A imunização realizada com DNA plasmideal, como demonstrado em diversos estudos, tende a induzir uma resposta imune com tais características (LECLERC et al., 1997; ROMAN et al., 1997; ZANGH et al., 2001). Assim, os protocolos utilizados tiveram como base a injeção de plasmídeos como vetores dos cDNAs correspondentes a quatro antígenos de L. infantum/chagasi, denominados Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18. As injeções consistiram da administração de plasmídeos isoladamente, de uma mistura de plasmídeos associados ou não a plasmídeocodificando IL-12 murina e, ainda, de uma injeção inicial de DNA plasmideal seguida de reforço com a proteína recombinante.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Leishmaniose – Aspectos Gerais
As leishmanioses, um grupo de doenças infecto-parasitárias de amplo espectro clínico causadas por protozoários do gênero Leishmania (ROSS, 1903), família Trypanosomatidae, ordem Kinetoplastidae, compreendem enfermidades de crescente impacto e preocupação mundial. Estão distribuídas em diversas regiões do mundo e são consideradas endêmicas em pelo menos 88 países, dentre os quais 72 são países em desenvolvimento (DESJEUX, 1996). Estima-se uma prevalência mundial de 12 milhões de casos e uma população com risco de infecção de quase 350 milhões de indivíduos (WHO, 2002). O aumento crescente no número de casos de leishmanioses é decorrente, em parte, de rápidas mudanças ambientais e do comportamento humano observadas nos últimos anos e se relaciona com a atual situação sócio-econômica dos países afetados (DESJEUX, 1996; WHO, 2002).
O impacto real das leishmanioses como um problema em saúde pública é considerado subestimado (ASHFORD et al., 1991; DESJEUX, 1996). Enquanto a estimativa de ocorrência mundial de leishmanioses está em torno de 1,5 a 2 milhões de novos casos por ano, apenas aproximadamente 600.000 casos são registrados oficialmente. Em parte, isso se deve à falta de obrigatoriedade de notificação, que ocorre em apenas 48 países dentre os 88 considerados endêmicos (DESJEUX, 1996). Casos de doença não diagnosticados, muitas vezes pela falta de acesso aos serviços de saúde, também contribuem para esta subestimativa.
As leishmanioses caracterizam-se pelo amplo espectro de manifestações clínicas apresentadas pelos indivíduos em decorrência da infecção pelo parasito. As formas clínicas apresentadas e a magnitude da doença são dependentes de muitos fatores, entre eles, a espécie do parasito e a imunocompetência do hospedeiro. Comumente, a doença vem sendo dividida em 5 principais síndromes clínicas: a leishmaniose cutânea (LC), a leishmaniose cutânea difusa (LCD), a leishmaniose mucocutânea (LMC), a leishmaniose visceral (LV) e a leishmaniose cutânea pós-kalazar (LCPK). Até o presente, pelo menos 20 espécies de Leishmania foram identificadas como sendo agentes etiológicos de infecções em seres humanos (GRIMALDI et al., 1989; ASHFORD, 2000; DESJEUX, 2004).
A transmissão do parasito ocorre através da picada dos insetos vetores, flebotomíneos pertencentes ao gênero Phlebotomus e Lutzomyia, encontrados no Velho e no Novo Mundo, respectivamente (LAINSON et al., 1977). O parasito apresenta ciclo de vida digenético, o que confere à Leishmania uma significante diversidade antigênica (FONG & CHANG, 1982; CHANG & FONG, 1982; HANDMAN et al., 1984). No hospedeiro invertebrado, formas promastigotas flageladas são encontradas no intestino médio de insetos fêmeas enquanto que, em hospedeiros vertebrados, formas aflageladas e intracelulares obrigatórias, as amastigotas, sobrevivem e replicam-se nos fagolissosomos de células do sistema fagocítico mononuclear (BARD, 1989). O ciclo de transmissão se inicia quando fêmeas de flebotomíneos ingerem formas amastigotas de Leishmania de um hospedeiro vertebrado infectado. Formas infectivas, denominadas metacíclicas, diferenciam-se no trato digestivo do inseto vetor e são regurgitadas intradermicamente no local da picada em novos hospedeiros durante novo repasto sangüíneo (BARD, 1989; WALTERS et al., 1989a e b; WALTERS et al., 1993).
O ciclo de transmissão do parasito é geralmente zoonótico, mas pode apresentar-se como antroponótico em focos restritos (DESJEUX, 1991 revisto em ASHFORD et al., 1996). A infecção por Leishmania no ser humano é considerada incidental para a maior parte das espécies e o homem assume o papel de hospedeiro secundário (DESJEUX, 1991; DEDET, 1992; ASHFORD, 1996). No entanto, seres humanos infectados efetuam o papel de hospedeiro reservatório, em casos como na leishmaniose cutânea causada por L. tropica e na doença visceral por L. donovani, que ocorrem no Velho Mundo (DESJEUX, 1991; BERMAN, 2006). Os animais considerados como hospedeiros reservatórios podem incluir roedores, canídeos e outros mamíferos (ASHFORD, 1996). O cão doméstico, em muitos casos, é considerado também como hospedeiro secundário, mas desempenha um papel importante como reservatório, contribuindo para a manutenção do ciclo de transmissão de um dos agentes etiológicos de uma das formas mais severas de leishmaniose, a leishmaniose visceral zoonótica (LVZ; DEANE & DEANE, 1954; ASHFORD, 1996).
2.2. Leishmaniose Visceral
2.2.1. Aspectos Epidemiológicos
A leishmaniose visceral, também conhecida como calazar na Ásia e na África, é causada por parasitos do complexo Leishmania donovani, o qual compreende talvez três espécies,
Leishmania (Leishmania) donovani, Leishmania (L.) infantum, e Leishmania (L.) chagasi
(LAINSON et al., 1987). Posteriormente, avaliações fenotípicas e genotípicas dentro do complexo L. donovani foram realizadas em diferentes níveis, bioquímicos e moleculares, (MOMEN et al., 1987; RIOUX et al., 1990; CUPOLILLO et al., 1994; MAURÍCIO et al.1999; MAURÍCIO et al., 2000). Os resultados das avaliações sugerem que as espécies L. infantum e L.
chagasi são indistinguíveis entre si e, por isso, alguns autores passaram a considerá-las como
sendo a mesma espécie e a utilizar os nomes como sinônimos. No transcorrer desta revisão, a denominação L. infantum/chagasi será utilizada como referência para L. infantum e L. chagasi, embora o nome L. infantum seja considerado o mais apropriado (MAURICIO et al., 2000; DANTAS-TORRES, 2006a) uma vez que sua descrição em 1908, por NICOLLE, antecede a de
L. chagasi (CUNHA & CHAGAS, 1937).
A distribuição da LV no mundo é mais restrita quando comparada às outras formas de leishmaniose. Em todo mundo, cerca de 90% dos casos são registrados em apenas cinco países, sendo eles, Índia, Nepal, Sudão, Bangladesh e Brasil. Segundo a Organização Mundial da Saúde, a incidência anual está em torno de 500.000 casos e mais de 200 milhões de indivíduos estão sob risco de infecção (WHO, 2002). A taxa de mortalidade pode chegar a valores próximos ou mesmo maiores que 10% do número de casos em tratamento, mesmo em regiões com baixa incidência de LV, como no estado de São Paulo, assim como em outras regiões do Brasil (JERÔNIMO et al., 1994; EVANS et al 1992; CVE, 2006).
No Brasil, a média anual de casos registrados entre os anos de 1994 e 2002 foi de 3.156 casos, com uma incidência de dois casos a cada 100.000 habitantes. Na última década, aproximadamente noventa por cento (90%) dos casos de LV foram registrados na região Nordeste do país, acometendo principalmente os estados da Bahia, Maranhão, Ceará e Piauí. No entanto, esta situação vem se modificando. O número de casos registrados na Região Nordeste, no período entre os anos de 2000 e 2002, apresentou uma redução percentual para setenta e sete
por cento, o que não resulta propriamente em um controle regional, visto que, neste mesmo período ocorreu uma expansão territorial da doença, com surtos ocorridos em outras áreas, como Rio de Janeiro - RJ, Belo Horizonte - MG, Araçatuba - SP, Santarém - PA e Corumbá – MS (BRASIL, 2003).
Vários são os fatores que contribuem para o avanço da LV no Brasil e no mundo. As transformações ambientais, as quais incluem fatores eco-epidemiológicos e sócio-econômicos, aparecem como uma das principais causas (DESJEUX, 1996). Estas transformações têm sido provocadas por processos migratórios humanos mais intensos, desmatamento de florestas nativas, crescimento desordenado das cidades e consequentemente baixas condições econômicas e sociais da população. Além disso, outros fatores podem alterar a susceptibilidade do hospedeiro, como as mudanças na resposta imune em indivíduos infectados com o vírus da imunodeficiência adquirida humana (HIV) (BRASIL, 2003; DESJEUX, 1996; GUERRA, 2004; ALVAR et al., 1997).
Na LVZ o cão doméstico participa da manutenção do ciclo de transmissão do parasito, atuando como hospedeiro reservatório de fundamental importância (DEANE & DEANE, 1954; LAINSON & SHAW, 1987; MARZOCHI et al. 1994; VIEIRA & COELHO, 1998; MORENO & ALVAR, 2002). A LV canina chega a apresentar quase 12% de incidência anual, como registrado recentemente no município de Jequié, no nordeste da Bahia (MOREIRA et al., 2003). Uma alta taxa de cães infectados tem sido encontrada em regiões endêmicas para LV humana, com valores que variam em torno de 40%, a depender do teste utilizado para avaliação, seja pela pesquisa de anticorpos específicos ou por análise microscópica da presença do parasito em culturas (EVANS
et al., 1992; VIEIRA & COELHO, 1998; CORTADA et al., 2004; DANTAS-TORRES, 2006b).
Com a introdução de técnicas mais sensíveis, como a detecção de DNA por PCR, um número maior de animais infectados, mesmo sem qualquer sinal da doença, pode ser encontrado, com taxas de positividade de até 80% (ASHFORD et al., 1995; BERRAHAL, et al., 1996; QUINNELL, et al., 2001; CORTES et al., 2004). Estes valores reforçam a LV canina como sendo um grave problema em Saúde Pública, uma vez que tanto animais sintomáticos como assintomáticos podem participar do ciclo de transmissão para o inseto vetor (ABRANCHES et al., 1991; VEXENAT et al., 1993).
2.2.2. Aspectos Clínicos da Leishmaniose Visceral Em Seres Humanos
A infecção por L. infantum/chagasi em humanos não necessariamente resulta em manifestações clínicas, uma vez que existe diferença de susceptibilidade entre os insivíduos. Isso ocorre, em parte, na dependência de fatores genéticos, status imunológico e comprometimento nutricional de cada indivíduo (CERF et al., 1987; GRADONI & GRAMICIA, 1994). Assim, a infecção pode resultar em casos assintomáticos ou oligossintomáticos (BADARÓ et al., 1986a; GAMA et al., 2004) que podem evoluir para cura clínica espontaneamente ou para a doença plenamente manifesta, a chamada forma clássica da doença.
Na forma clássica da doença, seja em crianças, jovens ou adultos, as manifestações clínicas são: por febre irregular, palidez discreta e letargia, sendo o estado geral do paciente preservado. Na medida em que a doença evolui, outros sinais e sintomas são comumente encontrados, como por exemplo, hepatoesplenomegalia, perda de peso e anorexia, que variam de grau moderado a acentuado, seguidos por sintomas ou sinais menos frequentes como sangramentos espontâneos, icterícia e edema (HO et al., 1982; EVANS et al., 1985; de BEER et al., 1991). Dados laboratoriais geralmente indicam um grau elevado de pancitopenia (anemia, plaquetopenia e leucopenia), hipoalbuminemia e hipergamaglobulinemia. Infecções secundárias pulmonares (broncopneumonias) em pacientes hospitalizados levam ao agravamento dos casos e contribuem para a mortalidade. O óbito, que ocorre frequentemente em crianças menores de 5 anos e em indivíduos com idade avançada, está associado a carga parasitária elevada, anemia profunda, excessiva perda de massa corporal e distúrbios digestivos com episódios de vômitos durante o curso de tratamento (SEAMAN et al., 1996).
O tratamento da LV humana é realizado mais comumente com antimoniais pentavalentes. Apesar de existirem duas diferentes formulações no mercado, apenas o antimoniato de N-metil glucamina, o Glucantime, está disponível em nosso país, e é a droga de primeira escolha para o tratamento da LV humana. O surgimento de resistência a este medicamento já foi relatado em algumas regiões do mundo, como na Índia e no Sudão (JACKSON et al., 1990; GROGL et al., 1992), mas, no Brasil, não existe nenhuma documentação acerca da presença de cepas de L.
infantum/chagasi resistentes in vitro. No Brasil, o medicamento é distribuído pelo Ministério da
(BRASIL, 2003). Alternativamente o tratamento pode ser realizado com drogas como a anfotericina B e a miltefosina, mas o uso dessas drogas é recomendado apenas em casos especiais, como reincidivas (SUNDAR et al., 2002). Em geral, pacientes com LV respondem bem ao tratamento com Glucantime e desenvolvem cura clínica com aparente resistência à reinfecções (PAMPIGLIONE et al., 1975; BADARÓ et al., 1986).
Em Cães
Cães infectados com L. infantum/chagasi apresentam um amplo espectro de manifestações clínicas. Animais infectados podem apresentar-se como assintomáticos, oligossintomáticos ou polissintomáticos (MANCIANTI et al., 1988; ABRANCHES et al., 1991; OLIVEIRA et al., 1993; PINELLI et al., 1994). A intensidade do parasitismo em cães pode estar diretamente associada à gravidade do quadro clínico (BARROUIN-MELO, et al., 2004; REIS et al., 2006).
Os sinais típicos de LV canina compreendem lesões cutâneas (80 %) - alopecia generalizada ou localizada, descamação, eczema em focinho e orelhas, pelos opacos, ulcerações nas orelhas, focinho, cauda e articulações; perda de peso e do apetite; linfoadenopatia localizada ou generalizada; onicogrifose e lesões oculares (73 %); anemia; diarréia crônica; coriza e edema das patas. Em casos avançados, são relatados: falência renal, apatia e sonolência intensas, neuralgia, poliartrite, polimiosite, rachaduras nos cochins plantares, úlceras interdigitais e lesões ósseas (ALMEIDA et al., 2005).
Há várias alterações bioquímicas e hematológicas em cães infectados naturalmente ou experimentalmente com L. infantum/chagasi, algumas das quais podem estar correlacionadas ao estado clínico do animal (REIS et al., 2006). Os achados laboratoriais incluem anemia normocítica/normocrômica e aumento dos níveis de proteínas totais do soro, com hipergamaglobulinemia marcante (CIARAMELLA et al., 1997; ALMEIDA et al., 2005).
No Brasil, até o presente momento não há recomendação de tratamento para LV canina [SÃO PAULO (ESTADO) – nota técnica do MS]. As tentativas realizadas com drogas tradicionalmente utilizadas para o tratamento de casos humanos apresentam baixa eficácia (MANCIANTI et al., 1988; GRAMICCIA et al., 1992; BANETH & SHAW, 2002). Em muitos casos, melhora clínica e redução do parasitismo são observados. No entanto, o tratamento é incapaz de promover cura clínica persistente e eliminar a infectividade do cão para o inseto vetor
(MOLINA et al.1994, FERRER et al. 1995). Além disso, devido à ineficácia do tratamento em cães com as drogas utilizadas para o tratamento humano, existe a possibilidade de seleção de cepas resistentes de L. infantum/chagasi (JACKSON et al., 1990; GROGL et al., 1992; LIRA et al., 1999; ABDO et al., 2003).
2.2.3. A Resposta Imune na Leishmaniose Visceral Aspectos Gerais da Imunidade na Leishmaniose
Considerando-se que as Leishmania sp. são parasitas intracelulares obrigatórios em seus hospedeiros vertebrados, a imunidade mediada por células é o principal mecanismo de defesa do organismo, particularmente pela ação de macrófagos ativados por citocinas derivadas de células auxiliadoras do tipo Th1. No entanto, uma resposta imune com estas características depende, dentre outros fatores, da resposta imune inicial, seguindo-se a interação do patógeno com as células do hospedeiro, o que pode resultar no controle ou no estabelecimento da infecção (revisto em MULLER, 1989).
Em uma fase bastante inicial, a capacidade de um microorganismo se multiplicar no interior de células fagocíticas pode ser, em parte, controlada geneticamente. Estudos em camundongos mostram a participação de um gene envolvido no controle da multiplicação parasitária, o Scl11A1 (CROKER et al., 1984; VIDAL et al., 1995). Este gene codifica uma proteína transmembrana, altamente depende de pH, presente na superfície lissosomal, que participa do fluxo de cátions divalentes contra um gradiente de prótons e regula a homeostase de íons metálicos (ferro, manganês e zinco) em células de origem macrofágica/monocítica. Estudos funcionais com Scl11A1 murino implicam seu envolvimento na ativação de macrófagos, incluindo regulação de citocinas e quimiocinas, proteínas do complexo principal de histocompatibilidade II (MHC classe II) e indução de óxido nítrico síntase (iNOS) (BARTON et al., 1995; JABADO et al., 2000). Polimorfismos presentes neste gene afetam diretamente a resistência inata do hospedeiro à infecções intracelulares. Estudos recentes em leishmaniose visceral humana e canina, apontam para a existência de polimorfismos no gene Scl11A1 tanto no homem como no cão, ressaltando a potencial importância de características genéticas na susceptibilidade ou resistência à infecção na leishmaniose visceral (ALTET, 2002; MOHAMED
Fatores genéticos têm sido implicados com susceptibilidade ou resistência a leishmaniose visceral não apenas na resposta imune inicial, no controle da infecção, mas também no desenvolvimento de uma resposta imune adquirida, podendo influenciar no progresso da infecção e no aparecimento de doença visceral propriamente dita. Neste caso, alterações funcionais em genes que codificam proteínas relacionadas ao sistema imune, principalmente relacionados ao complexo principal de histocompatibilidade, estariam envolvidos, mas há dados controversos em seres humanos e ainda escassos para análise em cães (QUINNEL et al., 2003). No modelo murino de leishmaniose visceral, genes relacionados ao MHC controlam a susceptibilidade à L.
infantum e L. donovani (BLACKWEL et al., 1980; LECLERCQ et al., 1996) e uma mutação
específica na cadeia I-A beta do MHC classe II está associada à resistência a infecção por L.
donovani (SEN & ROY, 1998). Em seres humanos, um estudo da freqüência de antígenos HLA
de classe 1 em associação à leishmaniose visceral mostrou uma associação significante apenas de um antígeno, o HLA-A26, e prevalência em indivíduos doentes no Irã (FAGHIRI et al., 1995), enquanto que outros estudos não apresentam qualquer associação entre alelos HLA e susceptibilidade à leishmaniose visceral humana (MEDDEB-GARNAOUI et al. 2001; PEACOCK et al. 2002; SINGH et al., 1997).
Já nos primeiros estágios da infecção, protozoários do gênero Leishmania são capazes de evadir-se às barreiras imunes naturais do organismo. Alterações na constituição de proteínas na superfície de formas infectantes de Leishmania permitem ao parasito escapar à lise mediada pelo complemento. Exemplo disso é a super-expressão de gp63 (glicoproteína) e de longas moléculas de LPG (lipofosfoglicanos), observada durante o desenvolvimento de promastigotas procíclicas em promastigotas metacíclicas, ainda no interior do tubo digestivo do inseto vetor, previne a inserção do complexo lítico C5b-C9 (MAC – complexo de ataque a membrana) na superfície do parasito (PUNTES et al., 1990; BRITTINGHAM et al., 1995). Já no interior da célula, estas moléculas agem impedindo a maturação do fagossomo e inibindo a ação de enzimas líticas, presentes no lissosomo (DESJARDINS et al., 1997; DERMINE et al.,2000). Outros mecanismos envolvem a inibição das vias de sinalização celular, a inibição da produção de óxido nítrico e de citocinas (DESCOTEAUX, 1992; MOORE, 1993; REINER et al., 1994; PROUDFOOT, 1995; CARRERA et al., 1996). Percebe-se que o parasita evoluiu de maneira a explorar o sistema imune do próprio hospedeiro, modulando-o e proporcionando um ambiente favorável para o
estabelecimento da infecção. O desequilíbrio da relação parasita-hospedeiro seria a causa tanto da eliminação da infecção, quanto do processo patogênico nas leishmanioses.
Leishmaniose Visceral Humana
A leishmaniose visceral humana caracteriza-se por uma deficiência da resposta imune mediada por célula específica para a Leishmania. Neste contexto, observam-se uma diminuição de resposta de células T, proliferação e citotoxicidade, com ausência da produção de citocinas do tipo Th1, como interferon-gama (IFN-γ), interleucina (IL)-2 e IL-12. Indivíduos com leishmaniose visceral, em sua forma clássica, não apresentam reatividade em resposta ao teste de Montenegro, o qual mede uma resposta de hipersensibilidade tardia a antígenos de Leishmania injetados na pele (HALDAR et al., 1983; HO et al., 1983; SARAN et al., 1991). Da mesma forma, em ensaios in vitro, células do sangue periférico de indivíduos doentes são incapazes de proliferar ou produzir IFN-γ em resposta a antígenos específicos (CARVALHO et al., 1981; HALDAR et al., 1983; HO et al., 1983; NEOGY et al., 1988). Já o perfil imunológico observado na maioria dos pacientes infectados assintomáticos caracteriza-se por apresentar a capacidade linfoproliferativa e de produção de IFN-γ mantidos frente a exposição in vitro a antígenos específicos (CARVALHO et al., 1992; HOLADAY et al., 1993a). A imunodeficiência específica observada em indivíduos com leishmaniose visceral é revertida após tratamento terapêutico, com o aparecimento da capacidade proliferativa, produção de citocinas do tipo Th1 e resposta positiva ao teste intradérmico de Montenegro em um período que varia de 2 a 20 semanas (CARVALHO
et al., 1981; HALDAR et al., 1983; HO et al., 1983; HOLADAY et al., 1993).
O controle e a proteção na leishmaniose visceral é, em geral, dependente da produção de IFN-γ, que, entre outras funções, ativa a capacidade microbicida de macrófagos infectados e aumenta a expressão de MHC classe I e MHC classe II em células fagocíticas, regulando a diferenciação e expansão de populações de linfócitos Th1 CD4+ e T CD8+ antígeno-específicos (MURRAY et al., 1983a; MURRAY et al., 1983b). Dessa forma, a incapacidade de células de indivíduos doentes em proliferar frente ao estímulo específico e de produzir IFN-γ implica diretamente no aumento da carga parasitária e nos processos patológicos observados na leishmaniose visceral humana. Vários são os fatores que regulam a produção de IFN-γ na
leishmaniose visceral, mas as citocinas IL-12 e IL-10 têm papel fundamental neste controle (BACELLAR et al., 2000).
A interleucina 12 (IL-12) é um potente indutor de resposta celular do tipo Th1, agindo como fator estimulador de células natural killer (NK) e fator de maturação de linfócitos T citotóxicos e Th1, desempenhando um importante papel na indução da produção de IFN-γ por células T e NK (KOBAYASHI et al., 1989). A IL-12 é produzida por macrófagos, monócitos, neutrófilos e células dentríticas e, em menor escala, por linfócitos B, mediante estímulos inflamatórios gerados por bactérias, parasitos intracelulares e fungos (TRINCHIERI et al., 2003). Na leishmaniose visceral humana, células do sangue periférico de indivíduos na fase ativa da doença não são capazes de produzir IL-12, subunidade p40, após estímulo in vitro com lisado de
L. donovani, mas essa produção é observada em indivíduos curados (GHALIB et al., 1995).
Além disso, a adição de IL-12 recombinante em cultura de células de indivíduos com leishmaniose visceral induz a produção de IFN-γ e a capacidade proliferativa destas células ao estímulo por antígenos de Leishmania, ao passo que, sua neutralização, com anticorpos específicos anti-IL-12, em cultura de células do sangue periférico de indivíduos assintomáticos, inibe estes mesmos efeitos do estímulo antigênico (GHALIB et al., 1995; BACELLAR et al., 1996; BACELLAR et al., 2000).
Fatores imunossupressores que atuam em células de indivíduos com leishmaniose visceral humana estão presentes tanto em nível celular quanto no soro de indivíduos doentes. Foi demonstrado inicialmente, em um co-cultivo de células de um mesmo indivíduo, obtidas antes e após o tratamento quimioterápico, que a capacidade de responder a antígenos de Leishmania, restaurada após o tratamento, podia ser inibida na presença de células obtidas antes do tratamento (CILLARI et al., 1988; CARVALHO et al., 1989). Dentre estes fatores estão células imunossupressoras (T TCR γ-δ+ CD4+, T CD8+ e T CD4-CD8-), as citocinas IL-4, IL-6, IL-10 e IL-13 e receptores solúveis de IL-4 e de IL-2 (ZWINGENBERGER et al., 1990; BARRAL-NETTO et al., 1991; SANG et al., 1999; BABALOO et al., 2001).
A IL-10 foi inicialmente caracterizada como uma citocina produzida por células do tipo Th2 (FIORENTINO et al., 1989). Posteriormente foi observado que sua produção ocorre em diversos tipos celulares, inclusive por macrófagos (MOSMANN & MOORE, 1991; WILLIANS
et al., 1996; PROBST et al., 1997). Esta citocina desempenha um papel central na patogênese da
predominante nos casos de resistência e cura da infecção (GHALIB et al., 1993; HOLADAY et al., 1993b). Estas afirmações são suportadas pelas observações das funções supressoras de IL-10 exercidas sobre macrófagos, desativação e inibição das atividades leishmanicidas e supressão da produção de IFN-γ (GAZINELLI et al., 1992).
A participação de IL-10 na leishmaniose visceral humana foi inicialmente observada a partir da expressão de RNA mensageiro, em amostras obtidas de aspirado de linfonodo e baço de indivíduos na fase ativa da doença, em pacientes do Sudão e da Índia (GHALIB et al., 1993; KARP et al., 1993). Ainda nestes dois trabalhos, a análise da expressão de RNA mensageiros que codificam IL-10 e IFN-γ, demonstrou a co-existência destas duas citocinas no tecido, o que implicaria na supressão, mediada por IL-10, das funções macrofágicas induzidas por IFN-γ. A produção de RNA mensageiro que codifica IL-10 e a liberação desta citocina no sobrenadante de cultura de células também é induzida em células mononucleares do sangue periférico de indivíduos com leishmaniose visceral quando estimuladas com antígeno de L. donovani ou L.
infantum/chagasi, respectivamente (GHALIB et al., 1993; HOLADAY et al., 1993b). Neste
mesmo contexto, ocorre ausência de proliferação e liberação de IFN-γ no sobrenadante das culturas. Assim, a presença de IL-10, mais que a ausência de IFN-γ, seria um fator que beneficiaria a progressão da infecção para a doença ativa. O uso de IL-10 humana recombinante ou a sua neutralização com anticorpos monoclonais específicos resultam, in vitro, na modulação negativa ou positiva, respectivamente, da capacidade de células mononucleares do sangue periférico de indivíduos com leishmaniose visceral ativa, tratados ou assintomáticos, em responder frente ao estímulo com antígenos específicos (GHALIB et al., 1993; HOLADAY et al., 1993b; CARVALHO et al, 1994; GHALIB et al., 1995; BACELLAR et al., 2000).
A participação de IL-4 na imunosupressão e, consequentemente, na patogenicidade da leishmaniose visceral humana ainda é questionável. Esta citocina, embora presente no soro de indivíduos doentes (ZWINGENBERGER et al., 1990) está ausente ou é detectável em quantidades muito baixas após em cultivo celular após estímulo específico e a neutralização de sua atividade não implica na reversão da imunodepressão característica da leishmaniose visceral humana (CARVALHO et al., 1994; BACELLAR et al., 2000). Apesar disso, quando a neutralização de IL-4 ocorre simultaneamente com a de IL-10, com o uso de anticorpos monoclonais específicos para cada uma das citocinas, o efeito de indução da capacidade linfoproliferativa e de produção de IFN-γ ocorre sinergisticamente, mostrando o envolvimento de
IL-4 na modulação da resposta imune induzida na leishmaniose visceral humana (CARVALHO
et al., 1994).
A resposta imune humoral na leishmaniose visceral humana caracteriza-se pela ativação policlonal de linfócitos B, com produção de altas concentrações de anticorpos e de complexos-imune no soro (BEHFOROUZ et al., 1983; GALVÃO-CASTRO et al., 1984). Títulos elevados de anticorpos específicos parecem estar relacionados mais à patogênese da doença, como uma disfunção imunológica, que à proteção propriamente dita. Em seres humanos, a presença de anticorpos correlaciona-se a alta parasitemia e esta produção é controlada seguindo-se ao tratamento (MILES et al., 2005).
Leishmaniose Visceral Canina
A resposta imune na leishmaniose visceral canina assemelha-se em muitos aspectos à resposta induzida na leishmaniose visceral humana. A resposta imune específica mediada por células, quando presente, é capaz de controlar a infecção e, assim, os animais podem permanecer sem qualquer sinal da doença (PINELLI et al., 1994). De fato, o desenvolvimento de sinais na leishmaniose visceral canina está associado a mudanças imunológicas que envolvem a supressão da imunidade celular, como a ausência de resposta linfoproliferativa a antígenos de Leishmania de LUNA et al., 1999; MORENO et al., 1999), incapacidade de produção de IFN-γ e de IL-2 (SANTOS-GOMES et al., 2002), além de uma diminuição no número de células T no sangue periférico de animais naturalmente infectados, predominantemente de células T CD4+ (BOURDOISEAU et al., 1997; MORENO et al., 1999).
Os mecanismos efetores implicados na resistência e no controle da infecção por L.
donovani e L. infantum/chagasi no cão são dependentes do estabelecimento de uma resposta
específica de células Th1, com elevada produção de IFN-γ, IL-2 e TNF-alfa (PINELLI et al., 1994; PINELLI et al., 1995). O desenvolvimento deste tipo de resposta celular no cão também está associado à ação de IL-12 (OKANO et al., 1997; SALDARRIAGA et al., 2006). O papel da IL-12 na indução e manutenção de uma resposta Th1 na leishmaniose visceral canina têm sido recentemente investigado. Células de sangue periférico de cães com leishmaniose visceral ativa respondem ao tratamento in vitro com esta citocina pelo aumento na expressão de RNA mensageiro para IFN-γ e pela detecção desta citocina no sobrenadante de cultura de células (dos SANTOS et al., 2004; STRAUSS-AYALI, 2005). Além disso, a produção de IFN-γ induzida por
IL-12, na presença de antígenos de Leishmania, ocorre com maior intensidade, o que sugere que seu uso como agente imunoterápico é factível (STRAUSS-AYALI, 2005).
O envolvimento de citocinas produzidas por células Th2 na susceptibilidade à leishmaniose visceral canina ainda não está esclarecido. Os dados implicam para a existência de uma resposta mista Th1/Th2, mesmo em cães assintomáticos, embora IFN-γ e IL-2 predominem nesta situação (SANTOS-GOMES et al., 2002; CHAMIZO et al., 2005). No entanto, comumente observa-se a expressão de RNA mensageiro para IL-10 e IL-4 em células derivadas de animais com sinais clínicos de leishmaniose visceral, após estimulação inespecífica com mitógenos ou com antígenos de Leishmania (PINELLI et al., 1999; QUINNELL et al., 2001). Entretanto, em cães experimentalmente infectados por L. infantum, a expressão de RNA para IL-10 não têm sido geralmente detectada, ocorrendo apenas excepcionalmente em períodos mais tardios de infecção (SANTOS-GOMES et al., 2002; RAFATI et al., 2005).
Em relação à resposta imune humoral na leishmaniose visceral canina, assim como em seres humanos, está claro que infecções sintomáticas estão associadas à produção elevada de anticorpos específicos IgG, IgE e IgA (INIESTIA et al., 2005; REIS et al., 2006). Entretanto, apesar de um grande número de publicações na área de investigação da cinética e distribuição das subclasses de imunoglobulinas G, seguindo-se às infecções natural ou experimental em cães, não há um padrão consistente que aponte para um predomínio de subclasses diferentes de imunoglobulinas associado ao desenvolvimento ou não de sintomas (DEPLAZES et al., 1995; BOURDOUISEAU et al., 1997; LEANDRO et al., 2001; REIS et al., 2006).
Leishmaniose Visceral Experimental – O Modelo Murino
A maior parte do que se sabe hoje sobre os mecanismos envolvidos na estimulação e manutenção da resposta imune nas leishmanioses é derivado de estudos realizados em camundongos. No entanto, a infecção experimental de camundongos de diversas linhagens, seja com L. donovani ou L. infantum/chagasi, não reproduz o curso fatal da infecção, a exemplo do que ocorre na leishmaniose visceral humana e canina (KAYE, 2004). Ao contrário, no modelo murino de leishmaniose visceral experimental, mesmo animais geneticamente susceptíveis à infecção são capazes de controlar o parasitismo nos diferentes órgãos afetados (WILSON et al.,
