O diagnóstico in vivo de micobacterioses em suínos é um processo difícil, uma vez que se trata de uma infecção assintomática (Domingos et al., 2009). Este, baseia-se essencialmente em testes post mortem, como o exame macroscópico e histopatológico das lesões, técnicas microbiológicas e moleculares (Sobestiansky et al., 1999).
Em Portugal, existem poucos trabalhos que se debruçam sobre este tema (Domingos et al., 2009). O valor elevado de ocorrência de casos encontrados (0,93%) apenas em quatro meses, no presente estudo, referentes a quatro matadouros, sugere que a situação no Norte de Portugal é preocupante (Anexo I). Este valor aproxima-se da prevalência de MAC de 1% observada na ilha de Okinawa, no Japão, em 1999 (Hibiya et al., 2009). Em relação a alguns países europeus, o valor encontrado é superior quando comparado com a prevalência de 0,34% registado na Finlândia e de 0,5% na Holanda e, inferior aos valores de prevalência da Alemanha (10%) (von Dürrling et al., 1998; Komijn et al., 1999; Ali-Vehmas et al., 2004).
Neste estudo, todos animais inspeccionados em matadouro que apresentaram lesões compatíveis com micobacterioses, apenas tinham lesões nos gânglios linfáticos do tracto gastrointestinal. Matlova et al. (2005), detectaram com maior frequência as lesões granulomatosas nos gânglios linfáticos da cabeça e mesentéricos. Este facto, corrobora com os estudo que referem ser a via oral, a principal porta de entrada do agente em causa (Thoen, 1992). A ocorrência de lesões em gânglios linfáticos submaxilares (78%) foi superior à observada nos gânglios linfáticos mesentéricos (22%), tal como nos estudos efectuados por Komijn et al. (2007), mas, contrariamente ao encontrado por Balian et al. (1997) e Morés et al. (2007).
No que diz respeito, às lesões encontradas macroscopicamente (tamanho e consistência do material) em matadouro, estas estão de acordo com as lesões detectadas por outros autores (Balian et al., 1997; Pavlik et al., 2005; Hibiya et al., 2008).
A nível histopatológico, observou-se a presença de eosinófilos em 60% dos granulomas. Hibiya et al. (2008), também observaram eosinófilos, referindo que se desconhece se o infiltrado é específico para infecção por MAC, pois os eosinófilos são observados mais frequentemente em suínos do que em outras espécies. Em estudos realizados pelos mesmos autores, a infiltração de eosinófilos nas lesões granulomatosas não foi observada em cobaias inoculadas por estirpes de Mycobacterium isoladas de suínos. No entanto, Castro et al. (1991), mostraram que as micobactérias destruídas pelo calor causam rápida quimiotaxia num grande número de eosinófilos. Garrido et al. (2010), também encontraram, em granulomas, a presença de eosinófilos em javalis. Nas lesões granulomatosas
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evidenciaram-se células gigantes multinucleadas, apenas do tipo Langhans. Este achado já foi anteriormente observado por Nakamura et al. (1984), Matlova et al. (2005) e Martín- Hernando et al. (2007). Hibiya et al. (2008), contudo, referem terem observado células gigantes mais frequentemente em granulomas imaturos. Segundo Acland e Whitlock (1986), o aparecimento de células gigantes ocorre entre 6 a 12 semanas após a inoculação de M. avium em suínos, em estudos experimentais. A maioria dos animais que foram utilizados no presente estudo tinha cerca de 6 meses de idade. Talvez os resultados indiquem que as células gigantes são predominantes numa fase inicial do granuloma (Hibiya et al., 2008). Para além destas células, ainda encontramos outras células mononucleadas, como linfócitos, neutrófilos, tal como é referido por Martín-Hernando et al. (2007), Hibiya et al. (2008) e Garrido et al. (2010). Observamos, também, calcificação em 46% das lesões. Nakamura et al. (1984), em estudos experimentais, mostraram que a calcificação se encontra mais, frequentemente, em granulomas avançados de suínos, 12 semanas após a inoculação. Estes resultados podem sugerir que a calcificação ocorre frequentemente cerca de três meses após a infecção em suínos (Hibiya et al. 2008). Neste estudo, dividimos a calcificação em três categorias, a calcificação a nível central na lesão, a nível periférico e a mista, que contem as duas anteriores. Verificamos que a mais frequente foi a calcificação a nível periférico e que os gânglios linfáticos mesentéricos, não apresentaram calcificação central. Contudo, não se encontrou na bibliografia dados que abordem estes critérios, apenas havendo referência à presença ou não de calcificação na lesão granulomatosa (Nakamura et al., 1984; Balian et al., 1997; Martín-Hernando et al., 2007; Morés et al., 2007; Hibiya et al. 2008). Alguns granulomas eram delimitados por uma cápsula, conforme já descrito (Balian et al., 1997; Morés et al., 2007; Hibiya et al. 2008). Segundo Acland et al. (1986), a partir de suínos inoculados experimentalmente com micobactérias, a formação de cápsula surge por volta das 18 semanas após a inoculação.
É interessante realçar a associação estatística encontrada neste estudo, entre o gânglio linfático submaxilar e a presença de cápsula (p = 0,000). Não se encontrou na pesquisa bibliográfica explicação para este facto. Contudo, este facto corrobora com o estudo de Jubb et al. (1992), afirmando haver uma pequena tendência de encapsulamento da lesão decorrente de infecção por M. avium. O aparecimento de necrose está associada a uma fase mais intermédia da infecção (Hibiya et al. 2008). Relativamente, à necrose, distinguimos a de liquefacção, da necrose de caseificação, que diferindo estas apenas na quantidade de detritos celulares presentes, apresentando a primeira grande quantidade de detritos. A base bibliográfica para este estudo apenas refere a presença de necrose ou, necrose de caseificação
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nos granulomas (Nakamura et al., 1984; Balian et al., 1997; Morés et al., 2007; Hibiya et al. 2008).
No presente estudo, verificou-se a existência de diferentes granulomas. Vários estudos examinaram as alterações morfológicas em suínos inoculados, por via oral com micobactérias e mostraram que o granuloma evolui de uma fase inicial constituída, essencialmente, por células epitelióides para um granuloma calcificado e bem capsulado (Nakamura et al., 1984 e Acland e Whitlock, 1986). Assim, é possível explicar as diferentes alterações histopatológicas de granulomas, de acordo, com a diferença no tempo da fase de infecção (Hibiya et al., 2008). Neste trabalho, em alguns casos, o mesmo gânglio linfático apresentou granulomas em diferentes fases de evolução, o que pode ser explicado, pelo facto do animal estar em contacto permanente com o agente, e em diferentes fases da sua vida, visto este ser considerado um organismo ubiquitário (Domingos et al., 2009). Os valores apresentados na classificação dos granulomas por Hibiya et al. (2008), aproximam-se de certa forma dos observados neste trabalho. Como só classificamos em dois tipos de granulomas e, que os classificados como tipo I, não incluem granulomas ligeiramente necróticos, obtiveram-se percentagens inferiores para este tipo de granuloma, o que reflecte também a discrepância de valores do granuloma tipo II. E ainda, o facto de termos quatro gânglios linfáticos com lesão macroscópica, mas a nível histopatológico não apresentaram lesão, isto é justificável pelo facto de termos de dividir a lesão para estudos de biologia molecular e histopatológicos. Tendo em conta, o tamanho da lesão, nem sempre é uma tarefa fácil de realizar, dividindo esta em partes iguais ou mesmo em conseguir dividi-la. Observamos que nos gânglios linfáticos mesentéricos, os granulomas foram todos do tipo II, isto pode dever-se ao facto de terem sido detectados já numa fase mais avançada da infecção.
Neste trabalho, verificamos que todas as amostras com lesão macroscópica mostraram-se positivas ao método de ZN (100%). Este valor é superior ao observado por outros autores. Morés et al. (2007), consideraram o exame macroscópico realizado aquando da inspecção das carcaças fiável, quando se encontram BAAR. Estes autores encontraram BAAR em 72,8% nos gânglios linfáticos com lesões granulomatosas no exame histopatológico. Mas, Brown e Neuman (1979) detectaram micobactérias em 14 de 42 (33%) gânglios linfáticos sem lesão em suínos para consumo humano. O que mostra que a inspecção visual é um método insuficiente para a detecção de micobacterioses em suínos (Tirkkonen et al., 2007). As alterações histopatológicas são inespecíficas e os resultados positivos podem ser explicados pelo facto de que as lesões podem ser causadas por outras bactérias (Slana et al., 2010). Sendo, o exame histopatológico insuficiente para identificar as espécies de
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micobactérias e estabelecer relação entre o tipo de micobactéria envolvida e as características das alterações histopatológicas (Thoen, 1992).
A PCR é uma das técnicas mais utilizada actualmente para diversos fins, uma vez que permite detectar pequenas quantidades de DNA e ser muito mais rápida, comparativamente a outras técnicas (Coelho, 2006). Não existem, no entanto, muitos estudos a partir de DNA de tecidos sólidos de suínos (Biase et al., 2000). É fundamental obter DNA de boa qualidade para obter bons resultados. Ao analisarmos a leitura efectuada no NanoDrop ND-1000®, neste trabalho, verificou-se uma grande variação de valores. Tal poderá dever-se ao facto da distribuição das bactérias no gânglio linfático não ser uniforme (Garrido et al., 2000), o próprio órgão utilizado pode dificultar a extracção de DNA e do método de extracção realizado (Biase et al., 2002; Slana et al., 2010).
Neste estudo, a técnica de PCR, nomeadamente a 16S rDNA foi claramente a mais eficiente para a detecção de micobacterioses (82%). Como referem Miller et al. (1999), a partir de tecidos de suínos, fixados em formol, na qual detectaram 72% pela mesma técnica. Neste trabalho, ao comparar a técnica anterior com a PCR “multiplex”, verificaram-se maiores discrepâncias, o que já era de esperar, pelo facto, de existiram outras micobatérias que não pertencem ao Complexo Mycobacterium avium e que aparecem frequentemente associadas às lesões granulomatosas nos suínos, nomeadamente, M. fortuitum, M. chenonae, M. terrae, M. phlei (Dvorska et al., 1999; Mathova et al., 2004; Moravkova et al., 2008).
Neste estudo, detectou-se por biologia molecular a presença de Mycobacterium avium paratuberculosis (M.a.p.), agente etiológico da paratuberculose, em 4 (8%) gânglios linfáticos. Três nos gânglios linfáticos submaxilares e um nos mesentéricos. Estes casos foram confirmados pela técnica descrita por Garrido et al. (2000). A paratuberculose, afecta principalmente os ruminantes, originando uma enterite crónica granulomatosa (Chiodini et al., 1984; Hermon-Taylor et al., 2000). Existem poucos estudos de M.a.p., em suínos. Foi previamente identificado em suínos porJorgensen (1969), Larsen et al. (1971), Bartos et al. (2006) e Turenne et al. (2008). No entanto, do nosso conhecimento é a primeira vez que se fez a detecção do agente a partir da PCR, directamente de tecidos. O isolamento do agente da paratuberculose em alguns casos de doença de Crohn, uma enterocolite granulomatosa do homem, de etiologia desconhecida, tem lançado o interesse sobre o potencial zoonótico de M.a.p., embora, até ao momento não existam estudos suficientes que possam implicar esta micobactéria na doença (Hermon-Taylor et al., 2000). Recentemente, alguns estudos mostraram existir uma associação específica de 7 para 1 entre M.a.p. e a Doença de Crohn em humanos (Feller et al., 2007). Também se provou a associação de M.a.p. com Diabetes Mellitus Tipo I em humanos (Rosu et al., 2009). A descoberta da sequência de inserção
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IS900, a sua caracterização como sendo específica de M.a.p., e a sua descrição por Vary et al. (1990) tem proporcionado uma excelente ferramenta de identificação desta espécie, mediante uma simples reacção de PCR (Vary et al., 1990; Collins et al.1993b; Challans et al., 1994; Benazzi et al., 1997). Contudo, e de acordo com Cousins et al. (1999), foram anteriormente identificadas sequências de inserção semelhantes a IS900 em outras micobactérias. Identificaram-se estipes de Mycobacterium spp., relativamente próximas de M. scrofulaceum que possuem 71% a 79% de homologia com M.a.p. na região IS900, o que poderá originar resultados falsos positivos na técnica de PCR. Os problemas causados pelo M.a.p. constituem um problema de saúde pública de proporções trágicas para o qual uma série de medidas correctivas são urgentemente necessárias (Hermon-Taylor et al., 2000).
Nas associações encontradas entre as características histopatológicas e as técnicas microbiológicas, observou-se que a presença de necrose foi a que apresentou maior número de associações. Contudo, não se encontrou na pesquisa bibliográfica explicação para este facto.
Ao analisar os resultados obtidos no exame histopatológico com as técnicas de biologia molecular realizadas, neste trabalho, verificamos certas discordâncias. A concordância observada nas características histopatológicas com a técnica de PCR para a detecção do género Mycobacterium é aceitável. Uma vez que, os resultados positivos para o exame histopatológico e negativos para a detecção do género, resultam da observação de alterações histopatológicas inespecíficas, podendo ser causadas por outras bactérias (Slana et al., 2010). Quando se comparam os resultados histopatológicos com outras técnicas, como a detecção para o Complexo Mycobacterium avium e para a detecção da subespécie M. a. avium, a percentagem de casos considerados positivos para as características histopatológicas e negativos para as outras técnicas aumentam, respectivamente. Isto pode ser explicado, pelo facto do exame histopatológico não identificar as espécies de Mycobacterium e não permitir estabelecer uma relação entre o tipo de micobactérias presentes com as alterações histopatológicas encontradas (Thoen, 1992). Contudo, na comparação entre a presença de necrose e eosinófilos e, a detecção da subespécie por PCR, não houve nenhum caso considerado negativo para a histopatologia e positivo para a PCR. É importante, realçar uma vez mais, que no exame histopatológico consideraram-se quatro amostras negativas, por ausência de granulomas, embora a nível macroscópico existissem. O que pode explicar alguns casos de discordâncias entre as técnicas analisadas.
Se comparamos os resultados obtidos pela técnica de ZN (100% considerados positivos) e pela PCR para a detecção do género Mycobacterium (82% positivos) não são surpreendentes, uma vez que, ambas as técnicas detectam o mesmo género. A técnica de ZN é
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uma prova rápida e sensível que oferece bons resultados no diagnóstico de micobacterioses (Huebner et al., 1993). No entanto, existe o género Nocardia que também se identifica como bacilos álcool-ácido resistentes pela técnica de ZN (Prescott et al., 2002), assim como, o descoramento insuficiente das lâminas histopatológicas pode deixar corados de vermelho outros bacilos, que se confundem com os BAAR, o que pode levar a falsos positivos. Mas, também se pode assumir que os resultados positivos na técnica de ZN e negativos na técnica de PCR para detecção do género, se tratam de falsos negativos. A falta de amplificação destas amostras na PCR poderá ser atribuída à destruição da sequência alvo devido ao processo de extracção de DNA, diminuindo o número de sequências alvo intactas para um nível abaixo do limite de detecção (Suresh et al., 2007). Outra justificação para os resultados negativos observados na PCR para a detecção do género, podem dever-se à presença de lesões isoladas ou de tamanho reduzido que não foram incluídas no processo de extracção, visto que a quantidade de material necessário para a execução da técnica de PCR é menor e, a uma ineficiente extracção de DNA das micobactérias a partir das amostras (Erume et al., 2001; Garrido, 2002). O excesso de restos celulares e de proteínas podem inibir o processo de amplificação (Saiki, 1990). Uma das razões dos falsos negativos na PCR é a presença de inibidores nas amostras (Vary et al., 1990). A co-purificação destes produtos com o DNA alvo podem bloquear a reacção e, produzir falsos negativos (Collins et al., 1993b). Com a realização de uma dupla amplificação ou através da utilização de várias diluições, poderia eliminar-se os efeitos inibidores e, a presença de produtos de amplificação inespecíficos, que competem com o DNA das micobactérias, mas implicaria o encarecimento do diagnóstico (Saiki, 1990; Garrido, 2000). A presença de bandas de tamanho não esperado também foi observada por Moravkova et al. (2008). O tipo de órgão utilizado em PCR directamente de tecido, pode influenciar os resultados. Biase et al. (2002), realizaram extracções de DNA a partir de diferentes órgãos de suíno e, verificaram que a presença de células fibrosas dificulta a extracção, obtendo uma menor concentração de DNA. Neste trabalho, apenas se utilizaram gânglios linfáticos, que são estruturas encapsuladas altamente organizadas. No estudo, realizado por Coelho (2006), verificou-se que o gânglio linfático foi o tecido, que teve menos resultados positivos, quando comparado com outros órgãos.
A análise comparativa das técnicas de PCR, revelou discordâncias. Entre os resultados da PCR para a detecção do género Mycobacterium e PCR para a detecção da subespécie M. a. avium verificou-se mais discordâncias, visto que nem todas as bactérias pertencentes ao Complexo M. avium são M. a. avium. Tendo sempre em conta, que os inibidores da PCR são um grande problema (Erume et al., 2001).
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Neste estudo, a impossibilidade de detectar todas as subespécies pertencentes ao Complexo M. avium poderá dever-se à competição de primers utilizados na PCR “multiplex”, o que poderá justificar a diminuição da sensibilidade da técnica ou poderá dever- -se à existência de um menor número de micobactérias em relação a outras espécies presentes nas amostras, conduzindo a uma situação de competição entre as diferentes espécies pelos primers disponíveis, como é referido por Miranda (2009). Na PCR “multiplex”, a ausência de amplificação pode ser atribuída à presença de inibidores da Taq polimerase (Erume et al., 2001). A técnica de PCR “multiplex” desenvolvida por Moravkova et al. (2008), é considerada simples, rápida e barata. Apesar da técnica descrita permitir a detecção de infecções mistas provocadas por M. a. paratuberculosis e M. a. hominissuis e por M. a. paratuberculosis e M. a. avium, não revela uma infecção mista por M. a. avium e M. a. hominissuis ou, a distinção entre M. a. avium e M. a. silvaticum (Moravkova et al., 2008). Mediante isto, no nosso trabalho, alguns dos casos ou mesmo todos, considerados positivos para M. a avium, podem na realidade apresentarem uma infecção mista por M. a. avium e M. a. hominissuis.
Pelos valores de concordância obtidos, verifica-se que a combinação das técnicas poderá aumentar a sensibilidade do diagnóstico, uma vez que a confirmação e identificação do agente causador da infecção apenas é realizada por PCR. A inspecção post mortem revelava-se uma ferramenta essencial na detecção destas infecções, contudo é insuficiente, uma vez que, os exames post mortem são utilizados para o diagnóstico definitivo de linfadenites granulomatosas em suínos (Cvetnić et al., 2009). Offermann (1997) citado por Komijn et al. (1999) relataram o isolamento de M. a. hominissuis em 48 de 345 (13,9%) gânglios linfáticos mesentéricos, sem lesões granulomatosas, de suínos para abate.
As técnicas de PCR utilizadas, neste trabalho, a partir de tecidos requerem pesquisas adicionais, para uma melhor optimização. Os relatos sobre a identificação de espécies pertencentes ao Complexo M. avium directamente do tecido infectado são poucos, sem cultura anterior (Slana et al., 2010). Métodos baseados em PCR em tempo real, para a detecção de infecções directamente do material analisado, nomeadamente, tecidos (Slana et al., 2010), podem mostrar-se vantajosos, mas apresentam um elevado custo associado a amostras previamente testadas (Moravkova et al., 2008). A identificação exacta do agente presente numa infecção permite a introdução de medidas preventivas contra a sua propagação em animais de produção (Moravkova et al., 2008). Estudos posteriores são necessários para obter a confirmação da presença de micobactérias de uma forma fácil e rápida, assim como a identificação da subespécie, e permitir um diagnóstico num menor espaço de tempo possível.
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