5.1. AMOSTRAS
No decurso da inspecção post mortem de suínos em 4 matadouros da região Norte, foram recolhidos gânglios linfáticos emparelhados (submaxilares e mesentéricos) de 50 animais (Tabela 5.1). Destes animais, todos evidenciavam lesões granulomatosas compatíveis com infecção por Mycobacterium spp., apenas num dos gânglios linfáticos (submaxilar ou mesentérico). Por motivos de logística não foi possível a análise dos gânglios linfáticos sem lesão. Portanto, neste trabalho apenas se refere os resultados obtidos a partir de gânglios linfáticos com lesão granulomatosa.
O número de animais encontrados com lesão revelou-se superior ao que foi estudado neste trabalho, durante o período referido. Como se pode ver pelos dados apresentados no anexo I, a ocorrência de linfadenites compatíveis com Mycobacterium foi de 0,93% (60/6422). Destes apenas 11 amostras foram analisadas laboratorialmente, as restantes foram referenciadas de outros matadouros, na qual não foi possível acompanhar o acto de inspecção. As técnicas de confirmação do agente presente nas lesões foram efectuadas apenas em animais com origem em território nacional. Dos 50 gânglios linfáticos analisados, 78% (39/50) das lesões encontraram-se nos gânglios linfáticos submaxilares e 22% (11/50) nos gânglios linfáticos mesentéricos.
Tabela 5.1. Número de amostras recolhidas com lesão granulomatosa.
Gânglio linfático Positivo (%)
Submaxilar 39 (78)
Mesentérico 11 (22)
Total 50 (100)
Tabela 5.2. Número de amostras recolhidas por matadouro.
Matadouro Amostras recolhidas (%)
A 2 (4)
B 9 (18)
C 38 (76)
D 1 (2)
34
Estas lesões apresentaram tamanhos que variaram desde pequenos focos com um milímetro até ≥ 1 cm de diâmetro e, material caseoso, caseocalcáreo e purulento (dados não apresentados).
Figura 5.1. Gânglios linfáticos submaxilares com lesões compatíveis com infecção por Mycobacterium spp..
Figura 5.2. Gânglios linfáticos mesentéricos com lesões compatíveis com infecção por Mycobacterium spp..
5.2. EXAME HISTOPATOLÓGICO
No exame histológico, verificou-se a presença de lesões granulomatosas em 92% (46/50) das amostras. Na maioria, estas eram constituídas por necrose central de caseificação e/ou liquefacção 78% (39/50), associada a um infiltrado inflamatório por células epitelióides, linfócitos, neutrófilos 92% (46/50), eosinófilos 60% (30/50) e células gigantes multinucledas do tipo Langhans 70% (35/50). Em 64% (32/50) das lesões era evidente uma cápsula de tecido conjuntivo e 46% (23/50) apresentaram calcificação distrófica (Tabela 5.3).
Os granulomas classificados como tipo I representaram 14% do total e, do tipo II 78% das amostras analisadas (Tabela 5.4). A nível estatístico não houve associação entre o tipo de gânglio linfático e as características analisadas no exame histológico (p > 0,05). O tipo de gânglio linfático, nomeadamente, o submaxilar, mostrou associação significativa com a presença de cápsula (χ² = 12,775; p = 0,000).
35
Figura 5.3. Lesão com necrose de liquefacção a nível central, calcificação e delimitada por uma cápsula (H&E, objectiva 20x).
Figura 5.4. Presença de células gigantes de Langhans (H&E, objectiva 40x).
Tabela 5.3. Caracterização das lesões a nível histopatológico*. Lesão Microscópica Nº Total (%) Necrose (%) Neutrófilos (%) Eosinófilos (%) Células gigantes (%) Caseificação Liquefacção Mista
G.l.
submaxillares 39 (78) 2 (4) 17 (34) 11(22) 37 (74) 22 (44) 27 (54)
G.l.
mesentéricos 11 (22) - 5 (10) 4 (8) 9 (18) 8 (16) 8 (16)
Total 50 (100) 2 (4) 22 (44) 15 (30) 46 (92) 30 (60) 35 (70)
*das 50 amostras analisadas, 4 (2 g.l. submaxilares e 2 g.l. mesentéricos) não apresentaram lesões a nível microscópico visíveis.
Tabela 5.4. Caracterização das lesões a nível histopatológico e classificação dos granulomas*. Lesão Microscópica Nº Total (%) Calcificação (%) Cápsula (%) Granuloma (%)
Central Periférica Mista Tipo I Tipo II
G.l.
submaxillares 39 (78) 3 (6) 10 (20) 7 (14) 30 (60) 7 (14) 30 (60)
G.l.
mesentéricos 11 (22) - 1 (2) 2 (4) 2 (4) - 9 (18)
Total (%) 50 (100) 3 (6) 11 (22) 9 (18) 32 (64) 7 (14) 39 (78)
*das 50 amostras analisadas, 4 (2 g.l. submaxilares e 2 g.l. mesentéricos) não apresentaram lesões a nível microscópico visíveis.
Figura 5.5. Granuloma do tipo I: lesão com células inflamatórias, H&E; A- objectiva 4x; B- objectiva 20x.
Figura 5.6. Granuloma do tipo II: necrose a nível central, calcificação, células gigantes e delimitada por uma cápsula pouco evidente (H&E, objectiva 20x).
36
Tabela 5.5. Componentes celulares nos diferentes tipos de granulomas*. Tipo de Granuloma Nº Total (%) Necrose (%) Neutrófilos (%) Eosinófilos (%) Células gigantes (%) Mineralização (%) Cápsula (%) Tipo I 7 (14) - 7 (14) 4 (8) 6 (12) 2 (4) 3 (6) Tipo II 39 (78) 39 (78) 39 (78) 26 (52) 29 (58) 21 (42) 29 (58) Total 46 (92) 39 (78) 46 (92) 30 (60) 35 (70) 23 (46) 32 (64)
*das 50 amostras analisadas, 4 (2 g.l. submaxilares e 2 g.l. mesentéricos) não apresentaram lesões a nível microscópico visíveis.
5.2.1. Técnica de Ziehl-Neelsen
As amostras de gânglios linfáticos coradas pela técnica de ZN foram analisadas individualmente e todas, 100%, revelaram a presença de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) compatíveis com Mycobacterium, sendo consideradas positivas (Figura 5.7). Os gânglios linfáticos com lesão macroscópica que não apresentaram evidências no corte histológico também foram positivos à técnica de ZN.
Figura 5.7. Presença de bacilos álcool-ácido resistentes pelo método de Ziehl-Neelsen (objectiva100x).
5.3. TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
5.3.1. Quantificação de DNA
Os resultados obtidos na quantificação de DNA encontram-se no Anexo II. O método de extracção de DNA com recurso ao kit comercial revelou valores bastante divergentes entre si, que variaram de 61,45 ng/μl a 2978,85 ng/μl. Relativamente, ao grau de pureza, os valores foram mais próximos (entre 1,79 e 2,06) e dentro do intervalo esperado. Posteriormente, realizou-se um gel de agarose a 0,7%, com DNA extraído das amostras para verificar a integridade do mesmo (Figura 5.8).
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Figura 5.8. DNA extraído de algumas amostras; M: marcador.
Os resultados obtidos, no gel anterior, dão conta da presença de DNA em todas as amostras analisadas, contudo, verifica-se alguma degradação de DNA, pela presença de arrastamento.
5.3.2. Reacção em cadeia da polimerase
Na técnica de PCR, 16S rDNA, os resultados foram combinados de forma a classificar as amostras em dois grupos: positivos ou negativos para o género Mycobacterium e para a espécie M. avium e M. intracellulare. O primeiro grupo inclui as amostras classificadas como positivas e duvidosas. Obtiveram-se resultados positivos para o género Mycobacterium em 82% (dos quais 76% positivos e 6% duvidosos) e negativos em 18% (Figura 5.9). Para a espécie M. avium obtiveram-se 60% positivos (40% positivos e 20% duvidosos) e 40% negativos. Relativamente à detecção de M. intracellulare, 6% foram duvidosos e 94% negativos.
Dos 39 (78%) gânglios linfáticos submaxilares analisados para o género Mycobacterium, 31 (62%) deram positivos, 1 (2%) duvidoso e 7 (14%) negativos. Relativamente, aos 11 (22%) gânglios linfáticos mesentéricos submetidos a PCR para detecção do género, 7 (14%) foram positivos, 2 (4%) duvidosos e 2 (4%) negativos.
Na técnica de PCR “multiplex”, os resultados também foram combinados de forma a classificar as amostras como positivas ou negativas para as subespécies M. avium. Para M. a. paratuberculosis obtiveram-se resultados positivos em 8% e, resultados negativos em 92% das amostras. Obtiveram-se resultados positivos para M. a. avium/M. a. silvaticum em 32% (18% positivos e 14% duvidosos) e negativos em 68%. Por uma questão de facilidade, sempre que neste trabalho se refere aos resultados correspondentes à subespécie M. a. avium, está-se na realidade a referir à subespécie M. a. avium e M. a. silvaticum. Não foi possível identificar a subespécie M. a. hominissuis porque na PCR “multiplex” só foi obtida a banda correspondente a IS1245 ou, associada a IS901. A banda correspondente a IS1245 apenas
38
identifica o Complexo Mycobacterium avium. Assim, obtiveram-se 48% resultados positivos (28% positivos e 20% duvidosos) e 52% negativos para o Complexo Mycobacterium avium (Tabela 5.6).
Tabela 5.6. Resultados obtidos pelas técnicas de PCR (16S rDNA e PCR “multiplex”). Positivo Negativo (%) Positivo (%) Duvidoso (%) MYCGEN 38 (76) 3 (6) 9 (18) MYCINT - 3 (6) 47 (94) MYCAV 20 (40) 10 (20) 20 (40) IS900 4 (8) - 46 (92) IS901 9 (18) 7 (14) 34 (68) IS1245 14 (28) 10 (20) 26 (52)
Figura 5.9. Produtos de amplificação obtidos na PCR 16S rDNA; M: marcador molecular; 1,2 e 3: amostras; C+: controlo positivo; C-: controlo negativo. A banda de 1030 pb é indicadora do género Mycobacterium.
A análise estatística entre as características estudadas no exame histopatológico e, as técnicas microbiológicas realizadas neste trabalho apresentaram várias associações. A presença de necrose no exame histopatológico, mostrou associação significativa com a técnica de PCR para a detecção da espécie Mycobacterium avium (χ² = 6,265; p = 0,012), para a subespécie M. a. avium (χ² = 9,885; p = 0,002) e para o Complexo Mycobacterium avium (χ² = 5,381; p = 0,020). O tipo de necrose presente a nível histológico revelou associação com a técnica de PCR para a detecção de M. a. avium (χ² = 9,957; p = 0,019). A presença de
1030 pb
M 1 2 3 C+ C- M
A banda correspondente a MYCGEN identifica o género Mycobacterium; MYCINT identifica a espécie Mycobacterium intracellulare e MYCAV identifica a espécie Mycobacterium avium; a banda correspondente a IS900 identifica a subespécie M. a. paratuberculosis, IS901 identifica M. a. avium e IS1245 identifica o Complexo M. avium.
1031 pb
39
eosinófilos na lesão granulomatosa mostrou associação na detecção da subespécie M. a. avium (χ² = 4,725; p = 0,030). A presença de calcificação nos granulomas mostrou uma associação com a detecção de M. a. avium na biologia molecular (χ² = 4,971; p = 0,026). Entre a presença de cápsula que delimita a lesão e a detecção do Complexo Mycobacterium avium houve associação estatisticamente significativa (χ² = 4,735; p = 0,030). A classificação dos granulomas em dois tipos (I e II), mostrou associação com a técnica de PCR para a detecção da espécie M. avium (χ² = 6,282; p = 0,043) e da subespécie M. a. avium (χ² = 9,885; p = 0,007) (Tabela 5.7).
Tabela 5.7. Associação entre a técnica de PCR e as variáveis estudadas no exame histopatológico.
Técnica de PCR Teste do χ² – valor de p Necrose Tipo de necrose
Neutrófilos Eosinófilos Células gigantes Calcifi- cação Tipo de calcificação Cápsula Classificação dos granulomas Detecção do género M. 0,091 0,190 0,715 0,649 0,309 0,918 0,865 0,327 0,201 Detecção da espécie M. avium 0,012 0,080 0,138 0,556 0,060 0,486 0,565 0,631 0,043 Detecção da subesp. M. a. avium 0,002 0,019 0,072 0,030 0,221 0,026 0,140 0,072 0,007 Detecção do Complexo M. avium 0,020 0,136 0,326 0,729 0,457 0,265 0,512 0,030 0,062
5.4. COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS NAS DIFERENTES TÉCNICAS
5.4.1. Comparação dos resultados obtidos no exame histopatológico com outras técnicas microbiológicas
A comparação dos resultados obtidos efectuou-se entre as características analisadas no exame histopatológico e as outras técnicas microbiológicas.
Quando se comparam as diferentes características histopatológicas com a técnica de PCR para a detecção do género Mycobacterium, observou-se que a necrose foi a mais concordante com a técnica (κ = 0,252) (Tabela 5.8). O valor de concordância em casos positivo foi maior entre a presença de neutrófilos e a detecção do género Mycobacterium, com 38 (76%) amostras, no entanto, apresentaram um coeficiente baixo (κ = 0,048). Obteve-se um
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valor negativo entre a presença de eosinófilos e de cápsula com a PCR para detecção do género, κ = -0,055 e κ = -0,121, respectivamente. Apesar de ambos apresentarem valores de positividade e negatividade superiores a 50%.
Os resultados que se mostraram mais concordantes entre o exame histopatológico e a PCR para detecção do Complexo Mycobacterium avium foram a presença de cápsula (κ = 0,288) e de necrose (κ = 0,257) (Tabela 5.9). Verificou-se um grande número de casos positivos em todas as características histopatológicas, que simultaneamente obtiveram resultados negativos para o Complexo M. avium. Obteve-se apenas uma amostra classificada como negativa no exame histopatológico, presença de neutrófilos, que foi classificada como positiva para o Complexo M. avium na técnica de PCR.
Tabela 5.8. Comparação dos resultados obtidos no exame histopatológico em relação a PCR do género
Mycobacterium. Necrose/ PCR género M. (%) Neutrófilos/ PCR género M. (%) Eosinófilos/ PCR género M.(%) Células gigantes/PCR género M. (%) Calcificação/ PCR género M. (%) Cápsula/ PCR género M. (%) Pos/Pos 34 (68) 38 (76) 24 (48) 30 (60) 19 (38) 25 (50) Pos/Neg 5 (10) 8 (16) 6 (12) 5 (10) 4 (8) 7 (14) Neg/Pos 7 (14) 3 (6) 17 (34) 11 (22) 22 (44) 16 (32) Neg/Neg 4 (8) 1 (2) 3 (6) 4 (8) 5 (10) 2 (4) Total 50 (100) 50 (100) 50 (100) 50 (100) 50 (100) 50 (100) Kappa 0,252 0,048 -0,055 0,140 0,011 -0,121
Tabela 5.9. Comparação dos resultados obtidos no exame histopatológico em relação a PCR do Complexo
Mycobacterium avium. Necrose/ PCR Complexo M. avium (%) Neutrófilos/ PCR Complexo M. avium (%) Eosinófilos/ PCR Complexo M. avium (%) Células gigantes/PCR Complexo M. avium (%) Calcificação/ PCR Complexo M. avium (%) Cápsula/ PCR Complexo M. avium (%) Pos/Pos 22 (44) 23 (46) 15 (30) 18 (36) 13 (26) 19 (38) Pos/Neg 17 (34) 23 (46) 15 (30) 17 (34) 10 (20) 13 (26) Neg/Pos 2 (4) 1 (2) 9 (18) 6 812) 11 (22) 5 (10) Neg/Neg 9 (18) 3 (6) 11 (22) 9 (18) 16 (32) 13 (26) Total 50 (100) 50 (100) 50 (100) 50 (100) 50 (100) 50 (100) Kappa 0,257 0,071 0,048 0,094 0,157 0,288
Observou-se que os resultados mais concordantes com a detecção da subespécie Mycobacterium avium avium pela técnica de PCR se obtiveram na técnica histopatológica para a presença nos granulomas de calcificação (κ = 0,300) e de eosinófilos (κ = 0,254), seguida da presença de necrose (κ = 0,234) e de cápsula (κ = 0,201). Nenhuma amostra foi
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considerada negativa para a presença de necrose e de neutrófilos e positiva para M. a. avium. No entanto, 30 casos (60%) foram classificados como positivos para a presença de neutrófilos e negativos para a detecção da subespécie (Tabela 5.10).
Tabela 5.10. Comparação dos resultados obtidos no exame histopatológico em relação a PCR da subespécie
Mycobacterium avium avium.
Necrose/ PCR M. a. avium (%) Neutrófilos/ PCR M. a. avium (%) Eosinófilos/ PCR M. a. avium (%) Células gigantes/PCR M. a. avium (%) Calcificação/ PCR M. a. avium (%) Cápsula/ PCR M. a. avium (%) Pos/Pos 16 (32) 16 (32) 13 (26) 13 (26) 11 (22) 13 (26) Pos/Neg 23 (46) 30 (60) 17 (34) 22 (44) 12 (24) 19 (38) Neg/Pos 0 (0) 0 (0) 3 (6) 3 (6) 5 (10) 3 (6) Neg/Neg 11 (22) 4 (8) 17 (34) 12 (24) 22 (44) 15 (30) Total 50 (100) 50 (100) 50 (100) 50 (100) 50 (100) 50 (100) Kappa 0,234 0,079 0,254 0,126 0,300 0,201
5.4.2. Comparação dos resultados obtidos na PCR
Na tabela 5.11 encontram-se os resultados obtidos por comparação da técnica de PCR para a detecção do género Mycobacterium. Pela comparação dos resultados obtidos na técnica de PCR para a detecção do género Mycobacterium com a técnica de PCR para a detecção do Complexo M. avium, observa-se que 24 (48%) amostras foram positivas em ambas as técnicas. Dezassete (34%) gânglios linfáticos foram positivos para a detecção do género e negativos para a detecção do Complexo Mycobacterium avium. Estas técnicas apresentaram um valor de Kappa de 0,337.
Tabela 5.11. Comparação dos resultados obtidos pela técnica de PCR do género Mycobacterium com outras técnicas microbiológicas.
PCR género Mycobacterium / PCR Complexo M. avium (%) PCR género Mycobacterium / PCR M. avium avium (%) Pos/Pos 24 (48) 16 (32) Pos/Neg 17 (34) 25 (50) Neg/Pos 0 (0) 0 (0) Neg/Neg 9 (18) 9 (18) Total 50 (100) 50 (100) Kappa 0,337 0,187
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Comparando os resultados da PCR para a detecção do género Mycobaterium com a PCR para a detecção da subespécie M. a. avium observam-se algumas discordâncias. Ambas as técnicas foram positivas para dezasseis (32%) amostras. Vinte e cinco (50%) das amostras foram positivas para a detecção do género e negativas para a detecção da subespécie pela PCR. Neste caso, o valor de Kappa foi inferior (κ = 0,187).
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6. DISCUSSÃO
O diagnóstico in vivo de micobacterioses em suínos é um processo difícil, uma vez que se trata de uma infecção assintomática (Domingos et al., 2009). Este, baseia-se essencialmente em testes post mortem, como o exame macroscópico e histopatológico das lesões, técnicas microbiológicas e moleculares (Sobestiansky et al., 1999).
Em Portugal, existem poucos trabalhos que se debruçam sobre este tema (Domingos et al., 2009). O valor elevado de ocorrência de casos encontrados (0,93%) apenas em quatro meses, no presente estudo, referentes a quatro matadouros, sugere que a situação no Norte de Portugal é preocupante (Anexo I). Este valor aproxima-se da prevalência de MAC de 1% observada na ilha de Okinawa, no Japão, em 1999 (Hibiya et al., 2009). Em relação a alguns países europeus, o valor encontrado é superior quando comparado com a prevalência de 0,34% registado na Finlândia e de 0,5% na Holanda e, inferior aos valores de prevalência da Alemanha (10%) (von Dürrling et al., 1998; Komijn et al., 1999; Ali-Vehmas et al., 2004).
Neste estudo, todos animais inspeccionados em matadouro que apresentaram lesões compatíveis com micobacterioses, apenas tinham lesões nos gânglios linfáticos do tracto gastrointestinal. Matlova et al. (2005), detectaram com maior frequência as lesões granulomatosas nos gânglios linfáticos da cabeça e mesentéricos. Este facto, corrobora com os estudo que referem ser a via oral, a principal porta de entrada do agente em causa (Thoen, 1992). A ocorrência de lesões em gânglios linfáticos submaxilares (78%) foi superior à observada nos gânglios linfáticos mesentéricos (22%), tal como nos estudos efectuados por Komijn et al. (2007), mas, contrariamente ao encontrado por Balian et al. (1997) e Morés et al. (2007).
No que diz respeito, às lesões encontradas macroscopicamente (tamanho e consistência do material) em matadouro, estas estão de acordo com as lesões detectadas por outros autores (Balian et al., 1997; Pavlik et al., 2005; Hibiya et al., 2008).
A nível histopatológico, observou-se a presença de eosinófilos em 60% dos granulomas. Hibiya et al. (2008), também observaram eosinófilos, referindo que se desconhece se o infiltrado é específico para infecção por MAC, pois os eosinófilos são observados mais frequentemente em suínos do que em outras espécies. Em estudos realizados pelos mesmos autores, a infiltração de eosinófilos nas lesões granulomatosas não foi observada em cobaias inoculadas por estirpes de Mycobacterium isoladas de suínos. No entanto, Castro et al. (1991), mostraram que as micobactérias destruídas pelo calor causam rápida quimiotaxia num grande número de eosinófilos. Garrido et al. (2010), também encontraram, em granulomas, a presença de eosinófilos em javalis. Nas lesões granulomatosas
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evidenciaram-se células gigantes multinucleadas, apenas do tipo Langhans. Este achado já foi anteriormente observado por Nakamura et al. (1984), Matlova et al. (2005) e Martín- Hernando et al. (2007). Hibiya et al. (2008), contudo, referem terem observado células gigantes mais frequentemente em granulomas imaturos. Segundo Acland e Whitlock (1986), o aparecimento de células gigantes ocorre entre 6 a 12 semanas após a inoculação de M. avium em suínos, em estudos experimentais. A maioria dos animais que foram utilizados no presente estudo tinha cerca de 6 meses de idade. Talvez os resultados indiquem que as células gigantes são predominantes numa fase inicial do granuloma (Hibiya et al., 2008). Para além destas células, ainda encontramos outras células mononucleadas, como linfócitos, neutrófilos, tal como é referido por Martín-Hernando et al. (2007), Hibiya et al. (2008) e Garrido et al. (2010). Observamos, também, calcificação em 46% das lesões. Nakamura et al. (1984), em estudos experimentais, mostraram que a calcificação se encontra mais, frequentemente, em granulomas avançados de suínos, 12 semanas após a inoculação. Estes resultados podem sugerir que a calcificação ocorre frequentemente cerca de três meses após a infecção em suínos (Hibiya et al. 2008). Neste estudo, dividimos a calcificação em três categorias, a calcificação a nível central na lesão, a nível periférico e a mista, que contem as duas anteriores. Verificamos que a mais frequente foi a calcificação a nível periférico e que os gânglios linfáticos mesentéricos, não apresentaram calcificação central. Contudo, não se encontrou na bibliografia dados que abordem estes critérios, apenas havendo referência à presença ou não de calcificação na lesão granulomatosa (Nakamura et al., 1984; Balian et al., 1997; Martín-Hernando et al., 2007; Morés et al., 2007; Hibiya et al. 2008). Alguns granulomas eram delimitados por uma cápsula, conforme já descrito (Balian et al., 1997; Morés et al., 2007; Hibiya et al. 2008). Segundo Acland et al. (1986), a partir de suínos inoculados experimentalmente com micobactérias, a formação de cápsula surge por volta das 18 semanas após a inoculação.
É interessante realçar a associação estatística encontrada neste estudo, entre o gânglio linfático submaxilar e a presença de cápsula (p = 0,000). Não se encontrou na pesquisa bibliográfica explicação para este facto. Contudo, este facto corrobora com o estudo de Jubb et al. (1992), afirmando haver uma pequena tendência de encapsulamento da lesão decorrente de infecção por M. avium. O aparecimento de necrose está associada a uma fase mais intermédia da infecção (Hibiya et al. 2008). Relativamente, à necrose, distinguimos a de liquefacção, da necrose de caseificação, que diferindo estas apenas na quantidade de detritos celulares presentes, apresentando a primeira grande quantidade de detritos. A base bibliográfica para este estudo apenas refere a presença de necrose ou, necrose de caseificação
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nos granulomas (Nakamura et al., 1984; Balian et al., 1997; Morés et al., 2007; Hibiya et al. 2008).
No presente estudo, verificou-se a existência de diferentes granulomas. Vários estudos examinaram as alterações morfológicas em suínos inoculados, por via oral com micobactérias e mostraram que o granuloma evolui de uma fase inicial constituída, essencialmente, por células epitelióides para um granuloma calcificado e bem capsulado (Nakamura et al., 1984 e Acland e Whitlock, 1986). Assim, é possível explicar as diferentes alterações histopatológicas de granulomas, de acordo, com a diferença no tempo da fase de infecção (Hibiya et al., 2008). Neste trabalho, em alguns casos, o mesmo gânglio linfático apresentou granulomas em diferentes fases de evolução, o que pode ser explicado, pelo facto do animal estar em contacto permanente com o agente, e em diferentes fases da sua vida, visto este ser considerado um organismo ubiquitário (Domingos et al., 2009). Os valores apresentados na classificação dos granulomas por Hibiya et al. (2008), aproximam-se de certa forma dos observados neste trabalho. Como só classificamos em dois tipos de granulomas e, que os classificados como tipo I, não incluem granulomas ligeiramente necróticos, obtiveram-se percentagens inferiores para este tipo de granuloma, o que reflecte também a discrepância de valores do granuloma tipo II. E ainda, o facto de termos quatro gânglios linfáticos com lesão macroscópica, mas a nível histopatológico não apresentaram lesão, isto é justificável pelo facto de termos de dividir a lesão para estudos de biologia molecular e histopatológicos. Tendo em conta, o tamanho da lesão, nem sempre é uma tarefa fácil de realizar, dividindo esta em partes iguais ou mesmo em conseguir dividi-la. Observamos que nos gânglios linfáticos mesentéricos, os granulomas foram todos do tipo II, isto pode dever-se ao facto de terem sido detectados já numa fase mais avançada da infecção.
Neste trabalho, verificamos que todas as amostras com lesão macroscópica mostraram-se positivas ao método de ZN (100%). Este valor é superior ao observado por outros autores. Morés et al. (2007), consideraram o exame macroscópico realizado aquando da inspecção das carcaças fiável, quando se encontram BAAR. Estes autores encontraram BAAR em 72,8% nos gânglios linfáticos com lesões granulomatosas no exame histopatológico. Mas, Brown e Neuman (1979) detectaram micobactérias em 14 de 42 (33%) gânglios linfáticos sem lesão em suínos para consumo humano. O que mostra que a inspecção visual é um método insuficiente para a detecção de micobacterioses em suínos (Tirkkonen et al., 2007). As alterações histopatológicas são inespecíficas e os resultados positivos podem ser explicados pelo facto de que as lesões podem ser causadas por outras bactérias (Slana et al., 2010). Sendo, o exame histopatológico insuficiente para identificar as espécies de
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micobactérias e estabelecer relação entre o tipo de micobactéria envolvida e as características das alterações histopatológicas (Thoen, 1992).
A PCR é uma das técnicas mais utilizada actualmente para diversos fins, uma vez que permite detectar pequenas quantidades de DNA e ser muito mais rápida, comparativamente a outras técnicas (Coelho, 2006). Não existem, no entanto, muitos estudos a partir de DNA de tecidos sólidos de suínos (Biase et al., 2000). É fundamental obter DNA de boa qualidade para obter bons resultados. Ao analisarmos a leitura efectuada no NanoDrop ND-1000®, neste trabalho, verificou-se uma grande variação de valores. Tal poderá dever-se ao facto da distribuição das bactérias no gânglio linfático não ser uniforme (Garrido et al., 2000), o próprio órgão utilizado pode dificultar a extracção de DNA e do método de extracção realizado (Biase et al., 2002; Slana et al., 2010).
Neste estudo, a técnica de PCR, nomeadamente a 16S rDNA foi claramente a mais eficiente para a detecção de micobacterioses (82%). Como referem Miller et al. (1999), a partir de tecidos de suínos, fixados em formol, na qual detectaram 72% pela mesma técnica. Neste trabalho, ao comparar a técnica anterior com a PCR “multiplex”, verificaram-se maiores discrepâncias, o que já era de esperar, pelo facto, de existiram outras micobatérias que não pertencem ao Complexo Mycobacterium avium e que aparecem frequentemente