Extracção de DNA

De cada amostra, inicialmente, armazenada a -20ºC retirou-se 200 mg de tecido que foi colocada num almofariz e com o pilão, moída em nitrogénio líquido. Posteriormente, colocou-se 25 mg do macerado num tubo de 2 ml e o restante noutro. Estes tubos foram conservados a -20ºC até à realização da extracção de DNA.

Realizou-se a extracção de DNA através do “kit” comercial “DNeasy Blood & Tissue Kit” (Qiagen®

, Hilden, Germany), de acordo com as instruções do fabricante. Nesta técnica, os ácidos nucleicos celulares vão ligar-se selectivamente à membrana de sílica da coluna de extracção e o DNA ligado à coluna, é posteriormente lavado com o tampão indicado, para remoção de eventuais contaminantes celulares. Finalmente, a eluição com tampão de baixa concentração salina vai possibilitar a libertação do DNA da membrana (Miranda, 2009).

Com as amostras armazenadas em tubos de 2 ml efectuou-se uma incubação a 56ºC com 20 μl de proteinase K e 180 μl de tampão de lise (Buffer ATL), até se obter a lise completa dos tecidos.

Adicionou-se, posteriormente, 200 μl tampão de ligação (Buffer AL) e agitou-se vigorosamente recorrendo ao vórtex. Juntou-se 200 μl de etanol a 96% e homogeneizou-se a mistura. Combinou-se a coluna de extracção com o tubo de recolha, pipetou-se o total da mistura para a coluna e centrifugou-se durante 1 minuto a 6000 g, à temperatura ambiente.

Desprezou-se o fluido recolhido, combinou-se a coluna com o novo tubo de recolha. Adicionou-se 500 μl de tampão de lavagem (Buffer AW1) e centrifugou-se durante 1 minuto a 6000 g, à temperatura ambiente. Desprezou-se o fluído recolhido e combinou-se a coluna com um novo tubo de recolha. Realizou-se uma lavagem, durante 1 minuto a 20000 g, com 500 μl de tampão de lavagem (Buffer AW2).

Por fim, eluiu-se o DNA extraído com 200μl de tampão de eluição (Buffer AE) e centrifugou-se durante 1 minuto a 6000 g. Depois de extraído, o DNA foi conservado a -20ºC até posterior utilização.

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4.2.2.1.2. Quantificação de DNA

A luz ultravioleta (UV) é absorvida pelos ácidos nucleicos, num comprimento de onda de 250 até 280 nm, com o máximo em 260 nm. A leitura a 260 nm permite o cálculo da concentração de ácidos nucleicos na amostra. A razão entre a leitura a 260 e 280 nm permite estimar a pureza da amostra de ácidos nucleicos.

A quantificação do DNA foi efectuada no NanoDrop ND-1000® (NanoDrop Technologies). Foi efectuada a medição da Absorvância a diferentes comprimentos de onda, para cada uma das amostras foram consideradas duas leituras, uma a 260 nm que permite quantificar e, outra a 280 nm, pois a razão A260/A280 permite estimar a pureza do DNA. A

fracção entre os valores das A260/A280 em preparações puras de DNA dá valores entre 1,8 e 2

(Sambrook et al., 1989). Utilizou-se água destilada esterilizada como controlo negativo do protocolo.

A fórmula I(A260)=50 μg/ml foi a seguida para efectuar a quantificação do DNA.

4.2.2.1.3. Amplificação

A reacção de PCR foi efectuada a partir do DNA extraído das micobactérias presentes nos tecidos. Todas as amostras foram inicialmente testadas por uma técnica de PCR 16S rDNA modificada por Moravkova et al. (2008), sendo descrita previamente por Wilton e Cousins (1992). A reacção de amplificação foi realizada com um volume final de 20 μl por reacção, misturou-se 2 μl de DNA genómico, 1 μl de cada primer (10 μM), 10 μl de Taq PCR Master Mix (Qiagen®, Hilden, Germany) e água ultrapura (Qiagen®) para perfazer o volume. As soluções foram posteriormente colocadas num termociclador (Biometra® TProfessional Basic, Goettingen, Germany), as condições dos ciclos e as temperaturas utilizadas encontram- se na tabela 4.1. O produto de amplificação foi conservado a 4ºC até a sua resolução através de electroforese em géis de agarose.

Tabela 4.1. Ciclos, temperaturas e tempos utilizados no ensaio 16S rDNA.

Ciclos Temperaturas Tempos

1 94ºC 1 min.

94ºC 1 min.

30 62ºC 2 min.

72ºC 1 min.

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Esta técnica permite a identificação do género Mycobacterium pela presença de uma banda de 1030 pb e permite a distinção entre M. avium (180 pb) e M. intracellulare (850 pb) (Tabela 4.2).

Tabela 4.2. Primers e respectivas sequências utilizados no ensaio 16S rDNA.

Nome de primer Sequência do primer

Tamanho do produto de PCR Nota 16S rDNA MYCGEN-F MYCGEN-R 5’- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3’ 5’- TGC ACA CAG GCC ACA AGG GA -3’

1030 pb

MYCAV-R 5’- ACC AGA AGA CAT GCG TCT TG -3’ 180 pb Com MYCGEN-F MYCINT-F 5’- CCT TTA GGC GCA TGT CTT TA -3’ 850 pb Com MYCGEN-R

Posteriormente, efectuou-se o ensaio de PCR “multiplex” adaptado de Moravkova et al. (2008), que foi realizado com um volume final de 40 μl (Tabela 4.3). As condições dos ciclos e temperaturas empregues estão registadas na tabela 4.4. Esta reacção permite a identificação de M. a. paratuberculosis pela presença da IS900 (215 pb) e dnaJ (140 pb), M. a. avium/M. a. silvaticum pela presença da IS901 (577 pb), IS1245 (385 pb) e dnaJ (140 pb) e por fim M. a. homnisuis é identificado pela presença da IS1245 (385 pb) e dnaJ (140 pb) (Tabela 4.5). A presença simultânea da IS901, IS900, IS1245 e dnaJ sugere uma infecção mista por M. a. paratuberculosis e M. a. avium. A presença da IS1245, IS900 e dnaJ é indicativa de uma infecção mista por M. a. paratuberculosis e M. a. hominissuis.

Tabela 4.3. Reagentes e concentrações utilizados no ensaio PCR “multiplex”.

Reagentes Concentração IS901 10 pmol IS1245 10 pmol IS900 10 pmol DnaJ 20 pmol DNTPs 94 μM MgCl2 2,5 mM

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Tabela 4.4. Ciclos, temperaturas e tempos utilizados no ensaio PCR “multiplex”.

Ciclos Temperaturas Tempos

1 96ºC 2 min.

96ºC 10 seg.

35 58ºC 10 seg.

72ºC 1 min.

1 72ºC 2 min.

Tabela 4.5. Primers e respectivas sequências utilizados no ensaio PCR “multiplex”. Gene, sequência

de inserção Sequência do primer Tamanho do produto de PCR

dnaJ 5’- GAC TTC TAC AAG GAG CTG GG -3’

5’- GAG ACC GCC TTG AAT CGT TC -3’ 140 pb IS900 5’- TGG TTG CTG TGT TGG ATG GC -3’

5’- ACC ATG CAG TAA TGG TCG GC -3’

215 pb

IS1245 5’- GAG TTG ACC GCG TTC ATC G -3’

5’- CGT CGA GGA AGA CAT ACG G -3’ 385 pb IS901 _{5’- GGA TTG CTA ACC ACG TGG TG -3’}

5’- GCG AGT TGC TTG ATG AGC G -3’ 577 pb

Para poder validar os resultados, incluiu-se em cada reacção de PCR, como controlo positivo, DNA da estirpe de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ATCC19698 e como controlo negativo, água.

4.2.2.1.4. Eletroforese

Após a PCR, os produtos de amplificação do ensaio 16S rDNA foram submetidos a electroforese num gel de agarose a 1,5% (p/v) e os produtos de amplificação obtidos na PCR “multiplex” num gel de agarose a 2% (p/v), ambos em tampão de Tris-Borato-EDTA (TBE) 1X, deixando-se ferver a mistura até obter uma completa dissolução da agarose. Posteriormente, o conteúdo foi vertido para um suporte com pente e deixou-se arrefecer até à solidificação.

Após a preparação, o gel foi colocado numa tina de electroforese e cobriu-se com tampão de electroforese, TBE, até ficar completamente submerso. A cada microtubo com 20 μl de produto amplificado, foi adicionado 3μl de solução de deposição (glicerol 50%, EDTA 1mM e azul de bromofenol a 0,25%), sendo o volume final colocado em cada poço de gel. O mesmo processo foi efectuado para os controlos positivos e negativos. Nos extremos do gel incluíram-se os marcadores de peso molecular GeneRuler®100pb (DNA Ladder Plus - MBI

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Fermentas). A separação dos fragmentos foi efectuada mediante electroforese horizontal em géis de agarose (Sambrook et al., 1989) com uma voltagem constante de 100 V, durante cerca de 2 horas.

Após a electroforese, procedeu-se à coloração utilizando uma solução de brometo de etídio (10 mg/mL) durante 30 minutos e a visualização dos produtos obtidos efectuou-se mediante um transiluminador de luz ultravioleta (VilbertLourmat®) conectado a um sistema informático de tratamento de imagens (Programa BioCapt®version 99.02 for Windows).

O tamanho dos fragmentos de DNA amplificados foram calculados em função da sua migração, quando comparada com a migração dos fragmentos do marcador de peso molecular, cujo tamanho de fragmentos é conhecido (3000, 2000, 1500, 1200, 1031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 pb).

4.3. ANÁLISE DE DADOS

Os cálculos foram executados com recurso ao programa SPSS 15® (SPSS Inc., Chicago III, USA) para Windows. A análise estatística foi estritamente descritiva, recorrendo- se à análise univariada, tendo sido o tratamento da informação do tipo quantitativo. Efectuou- se a análise, recorrendo a medidas de frequência absoluta e relativa. Para análise estatística da associação entre variáveis foi usado o teste de Qui-quadrado (χ²). Um nível de probabilidade (p) < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo na associação de variáveis.

Para comparar a eficácia das técnicas, no estudo comparativo dos métodos utilizados, usou-se o coeficiente “Kappa” (κ) de Choen que mediu a concordância proporcional não aleatória sobre os resultados obtidos nas diferentes provas laboratoriais (Altman, 1991). Um valor de κ de 0,5 indica um moderado nível de concordância entre as técnicas. Um valor de κ > 0,80 representa excelente concordância proporcional não aleatória.

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5. RESULTADOS

5.1. AMOSTRAS

No decurso da inspecção post mortem de suínos em 4 matadouros da região Norte, foram recolhidos gânglios linfáticos emparelhados (submaxilares e mesentéricos) de 50 animais (Tabela 5.1). Destes animais, todos evidenciavam lesões granulomatosas compatíveis com infecção por Mycobacterium spp., apenas num dos gânglios linfáticos (submaxilar ou mesentérico). Por motivos de logística não foi possível a análise dos gânglios linfáticos sem lesão. Portanto, neste trabalho apenas se refere os resultados obtidos a partir de gânglios linfáticos com lesão granulomatosa.

O número de animais encontrados com lesão revelou-se superior ao que foi estudado neste trabalho, durante o período referido. Como se pode ver pelos dados apresentados no anexo I, a ocorrência de linfadenites compatíveis com Mycobacterium foi de 0,93% (60/6422). Destes apenas 11 amostras foram analisadas laboratorialmente, as restantes foram referenciadas de outros matadouros, na qual não foi possível acompanhar o acto de inspecção. As técnicas de confirmação do agente presente nas lesões foram efectuadas apenas em animais com origem em território nacional. Dos 50 gânglios linfáticos analisados, 78% (39/50) das lesões encontraram-se nos gânglios linfáticos submaxilares e 22% (11/50) nos gânglios linfáticos mesentéricos.

Tabela 5.1. Número de amostras recolhidas com lesão granulomatosa.

Gânglio linfático Positivo (%)

Submaxilar 39 (78)

Mesentérico 11 (22)

Total 50 (100)

Tabela 5.2. Número de amostras recolhidas por matadouro.

Matadouro Amostras recolhidas (%)

A 2 (4)

B 9 (18)

C 38 (76)

D 1 (2)

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Estas lesões apresentaram tamanhos que variaram desde pequenos focos com um milímetro até ≥ 1 cm de diâmetro e, material caseoso, caseocalcáreo e purulento (dados não apresentados).

Figura 5.1. Gânglios linfáticos submaxilares com lesões compatíveis com infecção por Mycobacterium spp..

Figura 5.2. Gânglios linfáticos mesentéricos com lesões compatíveis com infecção por Mycobacterium spp..

5.2. EXAME HISTOPATOLÓGICO

No exame histológico, verificou-se a presença de lesões granulomatosas em 92% (46/50) das amostras. Na maioria, estas eram constituídas por necrose central de caseificação e/ou liquefacção 78% (39/50), associada a um infiltrado inflamatório por células epitelióides, linfócitos, neutrófilos 92% (46/50), eosinófilos 60% (30/50) e células gigantes multinucledas do tipo Langhans 70% (35/50). Em 64% (32/50) das lesões era evidente uma cápsula de tecido conjuntivo e 46% (23/50) apresentaram calcificação distrófica (Tabela 5.3).

Os granulomas classificados como tipo I representaram 14% do total e, do tipo II 78% das amostras analisadas (Tabela 5.4). A nível estatístico não houve associação entre o tipo de gânglio linfático e as características analisadas no exame histológico (p > 0,05). O tipo de gânglio linfático, nomeadamente, o submaxilar, mostrou associação significativa com a presença de cápsula (χ² = 12,775; p = 0,000).

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Figura 5.3. Lesão com necrose de liquefacção a nível central, calcificação e delimitada por uma cápsula (H&E, objectiva 20x).

Figura 5.4. Presença de células gigantes de Langhans (H&E, objectiva 40x).

Tabela 5.3. Caracterização das lesões a nível histopatológico*. Lesão Microscópica Nº Total (%) Necrose (%) _Neutrófilos (%) Eosinófilos (%) Células gigantes (%) Caseificação Liquefacção Mista

G.l.

submaxillares 39 (78) 2 (4) 17 (34) 11(22) 37 (74) 22 (44) 27 (54)

G.l.

mesentéricos 11 (22) - 5 (10) 4 (8) 9 (18) 8 (16) 8 (16)

Total 50 (100) 2 (4) 22 (44) 15 (30) 46 (92) 30 (60) 35 (70)

*das 50 amostras analisadas, 4 (2 g.l. submaxilares e 2 g.l. mesentéricos) não apresentaram lesões a nível microscópico visíveis.

Tabela 5.4. Caracterização das lesões a nível histopatológico e classificação dos granulomas*. Lesão Microscópica Nº Total (%) Calcificação (%) _Cápsula (%) Granuloma (%)

Central Periférica Mista Tipo I Tipo II

G.l.

submaxillares 39 (78) 3 (6) 10 (20) 7 (14) 30 (60) 7 (14) 30 (60)

G.l.

mesentéricos 11 (22) - 1 (2) 2 (4) 2 (4) - 9 (18)

Total (%) 50 (100) 3 (6) 11 (22) 9 (18) 32 (64) 7 (14) 39 (78)

*das 50 amostras analisadas, 4 (2 g.l. submaxilares e 2 g.l. mesentéricos) não apresentaram lesões a nível microscópico visíveis.

Figura 5.5. Granuloma do tipo I: lesão com células inflamatórias, H&E; A- objectiva 4x; B- objectiva 20x.

Figura 5.6. Granuloma do tipo II: necrose a nível central, calcificação, células gigantes e delimitada por uma cápsula pouco evidente (H&E, objectiva 20x).

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Tabela 5.5. Componentes celulares nos diferentes tipos de granulomas*. Tipo de Granuloma Nº Total (%) Necrose (%) Neutrófilos (%) Eosinófilos (%) Células gigantes (%) Mineralização (%) Cápsula (%) Tipo I 7 (14) - 7 (14) 4 (8) 6 (12) 2 (4) 3 (6) Tipo II 39 (78) 39 (78) 39 (78) 26 (52) 29 (58) 21 (42) 29 (58) Total 46 (92) 39 (78) 46 (92) 30 (60) 35 (70) 23 (46) 32 (64)

*das 50 amostras analisadas, 4 (2 g.l. submaxilares e 2 g.l. mesentéricos) não apresentaram lesões a nível microscópico visíveis.

5.2.1. Técnica de Ziehl-Neelsen

As amostras de gânglios linfáticos coradas pela técnica de ZN foram analisadas individualmente e todas, 100%, revelaram a presença de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) compatíveis com Mycobacterium, sendo consideradas positivas (Figura 5.7). Os gânglios linfáticos com lesão macroscópica que não apresentaram evidências no corte histológico também foram positivos à técnica de ZN.

Figura 5.7. Presença de bacilos álcool-ácido resistentes pelo método de Ziehl-Neelsen (objectiva100x).

5.3. TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR