O tratamento é impraticável, mesmo quando a infecção é detectada precocemente. As vacinas destinadas a aumentar imunidade celular têm o maior potencial para o sucesso na prevenção da infecção (Hines II et al., 1998).
Hines II et al. (1998), aplicaram dois tipos de vacinas em suínos e verificaram que nenhuma das vacinas impede a infecção, embora uma possa reduzir a gravidade das lesões em 47%, comparativamente com a outra vacina. São necessários estudos adicionais para produzir uma vacina que não só reduza o grau de lesão, mas também evite a infecção e/ou controle o agente.
2.2. POTENCIAL ZOONÓTICO
Antes da descoberta do HIV, o Complexo Mycobacterium avium era ocasionalmente responsável por infecções pulmonares localizadas em pessoas predispostas a infecções pulmonares obstrutivas, bronquiectasias e pneumonias (Falkinham, 1996).Alguns anos após o início da epidemia da SIDA, foi reconhecido o significado de MAC em termos de morbilidade e mortalidade em indivíduos imunodeprimidos, embora já fosse conhecida a sua capacidade de infectar pessoas e animais. O significado, em termos de Saúde Pública, de infecções causadas pelos microrganismos englobados em MAC, tem vindo a ser reforçado pelo isolamento destes microrganismos em pessoas e, tem sido reconhecida como uma das infecções bacterianas oportunistas mais comuns, causando infecção disseminada em indivíduos infectados pelo HIV (Young et al., 1986; Falkinham, 1996; Ristola et al., 1999; Vilela, 2005). Particularmente susceptíveis são os indivíduos imunodeprimidos em função da idade (muito jovens ou idosos), da terapêutica instituída ou da infecção a que estão sujeitos. Nestes casos a contaminação pode ocorrer por via digestiva ou respiratória, originando uma infecção generalizada. No entanto, em indivíduos saudáveis, a infecção por M. avium é rara, surgindo sob a forma de infecções pulmonares em adultos ou linfadenopatias em crianças (Arasteh et al., 2000; Vilela, 2005).
Normalmente, crianças jovens (1 ± 4 anos de idade) e indivíduos imunodeprimidos, como pacientes com SIDA, transplante de medula óssea e pacientes com cancro tornam-se frequentemente infectados com agentes oportunistas do Complexo M. avium (Kurzrock et al., 1984; Bennett et al., 1986; Young et al., 1986). Pensa-se que, carnes indevidamente tratadas infectadas com MAC podem ser potenciais fontes de infecção humana. Estimou-se que mais de 50% dos doentes com SIDA têm infecções co-existentes com MAC, que podem contribuir
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significativamente para a alta mortalidade observada em indivíduos com infecção pelo HIV-1 (Helbert et al., 1990).
As micobactérias atípicas, muito comuns no ambiente, podem causar infecções humanas tão sérias e extensas como a tuberculose clássica, mas, sem dúvida, com capacidade bem menor de causar infecção clínica (Grange e Yates, 1994). Os serótipos 4, 8 e 1 de MAC são os mais frequentemente isolados em pacientes infectados com o HIV (Oliveira et al., 2002).
Membros do grupo EuroSIDA avaliaram a incidência de micobactérias em doentes infectados pelo HIV, entre 1994 e 1999, após terem começado uma terapêutica antivírica específica. O estudo multicêntrico incidiu sobre 7000 doentes e mostrou que a média de incidência de tuberculose e de MAC era, respectivamente, de 1,4 casos por 100 doentes/ano e de 0,2 casos por 100 doentes/ano (Vilela, 2005).
Recentemente, infecções de seres humanos com MAC tornaram-se um problema sério devido aos crescentes casos de pacientes imunodeprimidos com frequente multi-resistência a tuberculostáticos (Dvorska et al., 2002;Biet et al., 2005). Com base nos estudos de biologia molecular, os suínos foram reconhecidos como uma potencial fonte de infecção de MAC para os seres humanos. Ambos os grupos de hospedeiros (suínos e seres humanos) podem estar infectados pela mesma fonte ambiental (Komijnet al.,1999; Pavlik et al., 2000; Tirkkonen et al., 2007). A água potável é considerada como a principal fonte de infecção de MAC nos seres humanos (Ristola et al., 1999).
A origem das infecções provocadas por MAC em seres humanos ainda é uma questão de especulação. Estudos anteriores mostraram que as bactérias de MAC estão presentes nas aves, no solo, adubo, água, suínos e outros animais e até mesmo nos cigarros (Falkinham, 1996; Komijn et al., 1999; Mijs et al., 2002). Pela própria designação, M. avium, pensou-se que as infecções eram derivadas das aves. Mais tarde, a serotipagem mostrou que apenas algumas bactérias de MAC isoladas em humanos representavam os serótipos 1, 2 e 3, que são os serótipos isolados mais comuns entre as aves. Recentemente, novas ferramentas moleculares, como a RFLP com a sequência de inserção IS1245 (IS1245 RFLP), ficaram disponíveis, permitindo progressos. A ocorrência de IS1245 é restrita a M. avium. Num estudo verificou-se uma semelhança de pelo menos 75% entre os padrões IS1245 RFLP de M. avium hominissuis em humanos e suínos isolados. Isto significa que, para os padrões IS1245 RFLP composto por 20 bandas, pelo menos, 15 posições de banda é compartilhada. Ou seja, os seres humanos e os porcos são infectados com o mesmo tipo de estirpes de M. avium (Guerrero et al., 1995; Ritacco et al., 1998; Komijn et al., 1999). Tirkkonen et al. (2007), mostraram uma semelhança superior a 90% de M. avium hominissuis
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isolados entre suínos e humanos. Estes dados indicam que os suínos podem ser um importante veículo de M. avium. Por esta razão, pesquisas eco-epidemiológicas sobre M. avium são importante do ponto de Saúde Pública (Hibiya et al., 2009). Alguns estudos recentes têm demonstrado um aumento da taxa de infecções por MAC, principalmente M. avium hominissuis, em pacientes imunodeprimidos. A biologia molecular tem revelado que os suínos são fontes significativas de infecções de tuberculose aviária para os seres humanos (Komijn et al., 1999; Pavlik et al., 2000; Tirkkonen et al., 2007). Slana et al. (2010), detectaram M.a.h. no musculus gluteus e do ponto de vista da segurança alimentar, a presença M.a.h. nos músculos pode ser considerada como uma possível ameaça para a saúde humana.
Tendo em conta, os aspectos zoonóticos da micobactéria transmitidos pelo ambiente e pelos animais selvagens trata-se de um grande problema mundial de saúde (Biet et al., 2005). Actualmente e, porque não podemos ignorar o potencial de infecciosidade e patogenicidade em humanos de MAC obtidos de suínos, a importância da infecção por MAC deve ser considerada não apenas como um problema de origem alimentar, mas também uma questão de Saúde Pública (Hibiya et al., 2009).
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3. OBJECTIVOS
Nos últimos anos em Portugal, verificou-se um aumento do número de casos de micobacterioses em suínos abatidos para consumo. A sua importância também tem vindo a aumentar, devido ao seu potencial zoonótico e pelos prejuízos económicos provocados aos produtores e às indústrias. Neste contexto, surgiu a necessidade de aprofundar o conhecimento sobre esta infecção assim como as suas técnicas de confirmação de diagnóstico. Com a realização deste trabalho pretende-se contribuir para a caracterização desta infecção micobacteriana em suínos, assim como, promover a segurança alimentar (confiança dos consumidores), através de técnicas rápidas e eficazes para o diagnóstico deste agente.
Tendo por base esta finalidade definiram-se os seguintes objectivos:
- Recolha de amostras de gânglios linfáticos em matadouro com lesões compatíveis com infecção por Mycobacterium spp. em suínos abatidos para consumo.
- Análise e caracterização histopatológica das amostras seleccionadas.
- Detecção de Mycobacterium spp. por técnicas de biologia molecular (PCR). - Comparação de técnicas aplicadas no diagnóstico da infecção.
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4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. RECOLHA DE AMOSTRAS
A recolha das amostras foi efectuada em quatro Matadouros na Região de Trás-os- Montes e Alto Douro, em Portugal, durante o período de Setembro a Dezembro de 2009. Os matadouros foram denominados de A, B, C e D (Figura 4.1).
Figura 4.1. Localização da área de recolha das amostras.
Considerou-se como suíno positivo, todo aquele que apresentasse lesões compatíveis com infecção por Mycobacterium spp. nos gânglios linfáticos submaxilares e/ou mesentéricos. Para cada suíno foram padronizados dois locais de colheita de amostras obrigatórios: o gânglio linfático submaxilar e os gânglios linfáticos mesentéricos.O primeiro local, é obrigatoriamente examinado pelo veterinário oficial e/ou auxiliar oficial durante o exame post mortem, de acordo com o Regulamento 854/2004. Durante este período todos os gânglios linfáticos submaxilares e mesentéricos foram rotineiramente examinados e cortados.
Todos os suínos abatidos foram examinados para a presença de lesões caseosas, caseocalcáreas ou purulentas (principalmente, nestes gânglios), de vários tamanhos e formas (que pode variar em tamanho desde uma cabeça de alfinete até uma ervilha).Cada animal que apresentasse este tipo lesões era cuidadosamente examinado, relativamente às restantes vísceras e carcaça. Sempre que se verificavam lesões compatíveis noutros órgãos/tecidos procedia-se à sua recolha. Cada gânglio linfático recolhido era dividido em duas partes (aproximadamente 2 cm2 cada). Se este tivesse lesões, cada fragmento tinha que conter pelo menos um foco ou parte da lesão.
Todas as amostras colhidas em matadouro foram divididas em duas partes, como referido anteriormente: uma foi acondicionada em saco plástico devidamente identificados, mantidas a 4ºC para posterior congelação a -20ºC até ao seu processamento para exames
C
A
B
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microbiológicos; e outra condicionada em frascos plásticos, fixadas em formol a 10% tamponado, para exames histopatológicos.
4.2. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
4.2.1. Técnicas histopatológicas
De cada animal foram recolhidas amostras de gânglios linfáticos submaxilares (A) e mesentéricos (B), e fixadas numa solução de formol a 10% tamponado separadamente, durante pelo menos 24 horas. Depois da fixação foram seccionados dois a três fragmentos de cada gânglio linfático. Estes foram processados, utilizando um processador de tecidos automático (Shandon Hypercenter XP®), no qual, inicialmente, as amostras foram desidratadas em gradientes crescente de álcoois e clarificadas em xilol, antes da sua inclusão em parafina com o ponto de fusão de 56ºC (Shandon Histocentre 2®).
Uma vez preparados os blocos foram efectuados cortes com 2 a 3 μm de espessura no micrótomo (Leica® Jung Biocut). Para o exame histopatológico, os cortes obtidos foram corados com Hematoxilina e Eosina (HE) (Luna, 1968) e pelo método de Ziehl-Neelsen, seguindo um protocolo padronizado de acordo com o Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (Lourenço, 2008).
Posteriormente, procedeu-se a uma descrição das lesões presentes em cada um dos gânglios linfáticos, com base no tipo de células presentes (eosinófilos, neutrófilos e células gigantes) e a uma classificação dos granulomas de acordo com a presença ou não de necrose, adaptando a classificação proposta por Martín-Hernando et al. (2007) e por Hibiya et al. (2008):
- Granuloma do tipo I: composto predominantemente por células inflamatórias; - Granuloma do tipo II: ligeiramente/fortemente necrótico.
As preparações coradas pelo método de Ziehl-Neelsen foram examinadas, pelo menos durante 5 minutos, com a objectiva de imersão (100x). Estas foram classificadas de acordo com a presença ou ausência de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) da seguinte forma (Adúriz, 1993):
- Negativo: ausência de BAAR compatíveis com Mycobacterium; - Positivo: presença de BAAR compatíveis com Mycobacterium.
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