O controle da PPS através da detecção do agente é fundamental para evitar a transmissão e disseminação do A. pleuropneumoniae entre rebanhos, principalmente daqueles que visam o melhoramento genético e multiplicação de animais. A infecção de um rebanho de reprodutores, principalmente por animais denominados portadores assintomáticos, constitui uma fonte de infecção permanente devido à distribuição e comércio destes animais, podendo disseminar a doença para todo o País.
O App possui diversos fatores de virulência ainda pouco entendidos que podem estar associados ao desenvolvimento da doença clínica. No entanto, muitas amostras são isoladas do trato respiratório de animais portadores assintomáticos que não apresentam lesões características de PPS. Estas amostras necessitam uma caracterização mais precisa tendo um potencial de utilização como vacinas vivas. O App apresenta similaridades antigênicas entre os 12 sorotipos, que apesar da desvantagem por apresentar reações cruzadas, auxilia no desenvolvimento de testes espécie-específicos para triagem de rebanhos. No entanto, após esta análise inicial dos rebanhos, havendo resultados positivos, existe a necessidade da aplicação de um teste sorotipo-específico que auxilie na identificação do sorotipo presente no rebanho em questão.
No Brasil os testes sorológicos são os mais utilizados na determinação da presença de infecção. No entanto, estes testes possuem algumas desvantagens devido a presença de reações cruzadas existente entre os sorotipos, o que dificulta a identificação do sorotipo presente num rebanho. Outra desvantagem é que os testes sorológicos não diferenciam animais infectados de animais vacinados, uma vez que é detectada a resposta imunológica que tanto pode ser por via vacinação ou por infecção. Segundo BLACKALL et alii (1999) nenhuma técnica sorológica é capaz de reconhecer os 12 sorotipos, porém a utilização conjunta das técnicas de hemaglutinação indireta (IHA) e gel de difusão quantitativa (QGD) permite diferenciar no mínimo 10 dos 12 sorotipos. Estes mesmos autores registraram ainda problemas de sorotipificação errônea de amostras ao utilizar anti-soros homólogos com títulos baixos, consistindo um erro laboratorial, o que levou à caracterização de isolados
como não sorotipificáveis. Estes resultados demonstram os problemas que a utilização de técnicas sorológicas podem causar na caracterização dos sorotipos, principalmente porque os animais utilizados para a produção de anti-soros apresentam variações quanto a produção de anticorpo e a técnica precisa estar bem validada.
O teste de ELISA é o método de diagnóstico sorológico mais utilizado atualmente, pois permite que um grande número de amostras possa ser analisado. Apesar da aparente facilidade da utilização deste teste, que normalmente apresenta boa sensibilidade, sua especificidade é menor quando comparada às técnicas de biologia molecular.
De acordo com levantamentos epidemiológicos é possível identificar e monitorar a prevalência dos sorotipos de uma região e assim desenvolver um teste específico para estes sorotipos. Desta forma, os rebanhos utilizados neste estudo foram classificados utilizando o teste de ELISA baseado nos antígenos LPS-CL dos sorotipos 3, 5 e 7 desenvolvido por MACHADO (1997). Este teste, por apresentar reações cruzadas, possibilita a detecção dos sorotipos 3, 4, 5, 6, 7 e 8, não diferenciando o sorotipo infectante. JENSEN & BERTRAN (1986) relataram que as reações cruzadas entre sorotipos são devidas à similaridade de antígenos dentro dos componentes do lipopolissacarídeo (LPS). Foi desenvolvido por DUTRA et alii (2000) outro teste de ELISA baseado na especificidade dos antígenos capsulares dos sorotipos 3, 5 e 7, que são os mais prevalentes no Brasil, para a utilização na caracterização dos sorotipos em amostras positivas ao ELISA LPS-CL.
O App apresenta diversos fatores de virulência como LPS, cápsula, toxinas e proteínas da membrana externa (INZANA, 1991; HAESEBROUCK et alii, 1997). O conhecimento destes fatores pode auxiliar no controle da PPS, podendo ser utilizados como alvo para o desenvolvimento de vacinas ou mesmo testes para diagnóstico (KAMP et alii, 1994).
Um problema encontrado no diagnóstico da PPS é a dificuldade de isolamento do App, que depende de meios enriquecidos ou seletivos. A classificação de App por testes microbiológicos e bioquímicos também pode apresentar resultados de difícil interpretação durante a caracterização dos isolados. Segundo GRAM et alii (1996) e SAVOYE et alii (2000) o teste de PCR aplicado diretamente em amostras de biópsia de tonsila e de fluido de lavado broncoalveolar de suínos apresenta 2,5 a 3 vezes mais sensibilidade comparado ao isolamento convencional de App.
Para o diagnóstico preciso da PPS se faz necessário o conhecimento dos fatores de virulência envolvidos, uma vez que os testes podem ser dirigidos a estes fatores ao invés de enfocar somente a identificação do sorotipo. Também é necessário o desenvolvimento de métodos de diagnóstico rápidos, de fácil manuseio apresentando alta sensibilidade e especificidade para a detecção do agente em trabalhos de rotina no laboratório que visam monitoramento do rebanho.
Neste trabalho foram padronizados dois testes de PCR, um para genes cpx (PCRcpx) e outro para genes sodC (PCRsodC) de A. pleuropneumoniae. Os testes de PCRcpx e PCRsodC foram padronizados, utilizando amostras dos sorotipos padrões de App assim como bactérias isoladas normalmente de suínos para avaliar a especificidade dos primers. Os resultados de padronização apresentados para PCRcpx foram similares aos descritos por LO et alii (1998) sendo somente observado um produto de amplificação nas amostras classificadas como App. Com exceção do sorotipo 4, todos os demais amplificaram um fragmento de 715 pb demonstrando assim a conservação desta região em A. pleuropneumoniae com os primers utilizados. Foi observado que o DNA total de A. suis clivado com HindIII e hibridização com a sonda PPcpx apresenta três bandas de hibridização (Figura 7), indicando que existe similaridade entre os genes cpx de App com regiões genômicas de A. suis. No entanto, nenhum produto de amplificação foi observado por PCRcpx na amostra de A. suis utilizada na padronização do teste. Podemos, portanto concluir que o A.suis apresenta genes similares aos genes cpx de App com diferenças significantes nas regiões utilizadas para sintetizar os primers. Nossos resultados indicaram que, mesmo em presença de outras bactérias encontradas no trato respiratório dos suínos, o App pode ser identificado devida a alta especificidade do teste. Resultado similar foi obtido por SAVOYE et alii (2000) com a utilização de PCR para genes omlA de App.
A padronização da técnica de PCRsodC revelou amplificações para todos os sorotipos de App (Figura 8A) além de outras espécies da família Pasteurellaceae como A. suis e P. multocida (Figura 9A). Entretanto este PCR não foi padronizado com o objetivo de ser utilizado na diferenciação da espécie App de outras bactérias e sim para determinar a presença de genes sodC e avaliar o grau de importância das SODs como fator de virulência. A amplificação de um fragmento a partir do DNA de A.suis utilizando os primers para sodC confirma resultados anteriores que demonstraram alta similaridade entre seqüências de DNA desta bactéria com
seqüências de DNA de App. Os genes para toxinas de A. suis apresentam alta similaridade com os genes de toxinas de A. pleuropneumoniae (BURROWS & LO, 1992; KAMP et alii, 1994; OSTAAIJEN et alii, 1997 e SCHALLER et alii, 1999). Entretanto, até o momento não existem registros sobre o isolamento ou caracterização de genes para superóxido dismutase em A. suis. Entretanto o gene que codifica CuZnSOD de P. multocida já foi caracterizado (no de acesso X83124) existindo similaridade dos genes sodC com App (dados não publicados).
O seqüenciamento dos fragmentos PPcpx (Figura 6) e PPMsod (Figura 12) indicaram que os fragmentos amplificados correspondem à seqüência de genes cpxCB e sodC de A. pleuropneumoniae depositadas no GenBank. O seqüenciamento do fragmento de PPMsod de A. suis apresentou 96% de similaridade com a seqüência de App depositada no GenBank, indicando que o A. suis deve possuir gene para superóxido dismutase e que este tem alta similaridade com o gene sodC de A. pleuropneumoniae. A presença de genes para superóxido dismutase em A. suis ainda não havia sido relatada. Os fragmentos PPcpx e PPMsod foram também analisados frente à clivagem com enzimas de restrição. Existem, em cada um dos fragmentos, sítios para enzimas de restrição que caracterizam o produto amplificado (Figuras 3, 4 e 10). A clivagem dos produtos amplificados demonstrou que estes correspondem à região dos genes cpx e sodC do genoma.
A partir destes resultados podemos concluir que a técnica de PCR, utilizada para os genes cpx, apresenta alta especificidade podendo ser aplicada na caracterização da espécie em isolados de casos clínicos de PPS considerando que, quando negativo, deve ser utilizado outro teste capaz de identificar o sorotipo 4. Com o objetivo de caracterizar a região dos genes que codificam as proteínas envolvidas no transporte de cápsula do sorotipo 4 realizamos hibridização do DNA total com a sonda heteróloga PPcpx do sorotipo 5a. No entanto, não se observou região de homologia demonstrando que o sorotipo 4 apresenta diferenças na seqüência de nucleotídeos desta região gênica que não está localizada somente nas regiões dos primers. Podemos, portanto, sugerir que o sorotipo 4 apresenta um sistema alternativo de transporte de cápsula diferente dos outros sorotipos. No entanto, não existem evidências mais conclusivas, até o momento, da presença de outro sistema de transporte dos polissacarídeos capsulares para o sorotipo 4 ou para a espécie App. A ausência de um produto de amplificação a partir do sorotipo 4
deve ser considerada uma limitação do teste PCRcpx devendo ser buscada uma solução através do projeto de primers que sejam capazes de identificar amostras pertencentes a este sorotipo.
Os genes cpx utilizados como alvos de amplificação pelo PCRcpx são espécie-específicos e responsáveis pelo transporte dos polissacarídeos capsulares, os quais são codificados pelos genes cps que possivelmente determinam a especificidade dos sorotipos de App (WARD & INZANA, 1997). Sendo assim, era esperado que com exceção do sorotipo 4, todas as amostras sorotipificadas apresentassem resultados de amplificação de acordo com os resultados de LO et alii (1998). Neste estudo buscamos utilizar a técnica de PCR com primers cpx espécie- específicos para validar o teste com amostras isoladas de lesões pulmonares de animais com sintomas agudos de pleuropneumonia, podendo assim identificar amostras patogênicas e para caracterizar amostras NAD-dependentes isoladas de tonsilas de leitões assintomáticos oriundos de rebanhos com diferentes aspectos clínicos.
Os resultados de validação do teste obtidos na caracterização dos isolados de casos clínicos agudos de PPS, portanto isolados patogênicos, apresentaram produto de amplificação em todos as amostras bacterianas, mesmo naqueles onde a sorotipificação não foi possível. Assim sendo podemos concluir que com excessão do sorotipo 4 o teste é 100% sensível em amostras capazes de induzir a doença. Entretanto, quando o teste de PCRcpx foi aplicado em amostras de A. pleuropneumoniae não sorotipificáveis caracterizadas por testes bioquímicos e isoladas de tonsilas de animais oriundos de leitões com infecção subclínica pertencentes aos grupos A, B e C, estas amostras foram de difícil caracterização pelo teste. Todas as amostras de App sorotipificadas apresentaram fragmento de amplificação correspondente aos genes cpx, porém os resultados dos isolados de App não sorotipificáveis (NT) apresentaram variações significativas relativas à amplificação do produto. Do total de 11 isolados NT dos grupos A, B e C apenas 02 isolados apresentaram resultados positivos para PCRcpx. Quando o teste foi aplicado em isolados NAD-dependentes não App pertencentes aos mesmos grupos, todas apresentaram resultados negativos, sendo possível diferenciar 100% das amostras de A. pleuropneumoniae das amostras de A. minor, H. parasuis e outras NAD-dependentes não App. Estes resultados indicam que a caracterização de amostras patogênicas pode ser realizada de forma mais precisa, tanto através de
técnicas bioquímicas ou pelo método de PCR, do que as amostras não patogênicas. A caracterização prévia considerava que dos 57 isolados, obtidos de 8 rebanhos assintomáticos, 42 isolados eram NAD-dependentes não App, sendo que a maioria (27 isolados) eram A. minor (KICH et alii, 2000) (Tabela 2). De acordo com resultados obtidos por NICOLET (1986) e RAPP et alii (1985) o A. minor representa 20% da flora residente do trato respiratório dos suínos. BLACKALL et alii (1991) descrevem o isolamento de A. minor de pulmão de suínos com e sem lesões ou sintomas de PPS.
O papel do A. minor como patógeno não está muito claro, pois existem poucos estudos até o momento, sendo importante à utilização de testes que facilitem a sua diferenciação e caracterização. De acordo com BIBERSTEIN et alii (1977) e M∅LLER & KILLIAN (1990) o A. minor apresenta semelhanças bioquímicas com o App sendo porém negativo para o teste CAMP e não hemolítico. Os resultados indicam que há uma diversidade muito grande de amostras NAD-dependentes residentes na cavidade nasal e nas tonsilas dos suínos sem causar problemas ao portador. Esta diversidade pode prejudicar o isolamento de App por cultivo bacteriológico e as variações observadas nos testes bioquímicos têm dificultado a caracterização do agente da PPS.
Ao analisarmos os resultados da caracterização bioquímica dos diferentes isolados foi observado que App NT isolados de tonsilas dos rebanhos dos grupos A, B e C, apresentaram variabilidade quanto a presença de hemólise observada em hemácia de carneiro (Tabela 9). A ausência da atividade hemolítica em conjunto com as variações nos testes bioquímicos podem ocasionar uma caracterização errônea da espécie. Segundo NICOLET (1970) e KILLIAN (1976) a atividade hemolítica é uma característica da espécie A. pleuropneumoniae e a intensidade varia de acordo com a hemácia utilizada e o sorotipo da amostra. Ainda foram observadas nos testes bioquímicos dos isolados das tonsilas de animais de rebanhos assintomáticos, variações na reação de CAMP, ausência de hidrólise de α-galactosidase, lactose, D- xilose e rafinose que dificultaram a caracterização (dados não mostrados). Resultados similares já foram relatados por KILLIAN et alii (1978); O`REILLY et alii (1984); M∅LLER & KILLIAN (1990); GUTIERREZ et alii (1993); BLANCHARD et alii (1993); PIFFER et alii (1997).
Uma amostra isolada do rebanho 20 (isolado 6983) caracterizada como App NT também não apresentou produção de urease (Tabela 9). No Brasil foram
isoladas amostras urease negativas do sorotipo 1 e 5 por PIFFER et alii (1997) sendo também relatado por BLANCHARD et alii (1993).
O rebanho 20, pertencente ao grupo C (Tabela 9) classificado como negativo para ELISA LPS-CL, foi o único que apresentou isolados App NT que após análise dos resultados do PCRcpx podem ser consideradas pertencentes ao sorotipo 4. O sorotipo 4 apresenta o mesmo LPS do sorotipo 7 (NAKAI et alii, 1992) presente no antígeno do ELISA utilizado para triagem do rebanho. No entanto, o teste de ELISA não foi capaz de detectar a presença deste sorotipo. Portanto estes isolados App NT devem apresentar diferenças na estrutura de LPS relativas ao sorotipo 4 padrão. Ainda segundo KUME et alii (1984 e 1986) e SIDIBÉ et alii (1993) o App pode colonizar o trato respiratório sem induzir uma soroconversão, explicando assim o resultado negativo de sorologia. SAITO et alii (1988) registraram o isolamento de App sorotipo 4 da cavidade nasal de animais pertencentes a rebanhos com diferentes aspectos clínicos no estado de São Paulo e Minas Gerais. No entanto, não houve isolamento de amostras de App sorotipo 4 sorotipificáveis nos rebanhos analisados (KICH et alii, 2000).
Todos os demais rebanhos apresentaram sorologia positiva (Tabela 2), e isolamento de amostras de A. pleuropneumoniae não sorotipificáveis, sugerindo que estes isolados podem apresentar epítopos comuns com o LPS-CL dos sorotipos detectados pelo ELISA (1, 9 e 11; 3, 6 e 8; 4 e 7 segundo NAKAI et alii, 1992). Esta hipótese precisa ser averiguada. Ainda, segundo LEVONEN et alii (1996), as reações cruzadas no teste de ELISA podem ser devido à infecção por mais de um sorotipo presente no rebanho.
No experimento com PCRcpx, a comparação dos resultados, obtidos dos isolados App de rebanhos de animais assintomáticos com os isolados de animais portadores de PPS, revelou grande diversidade. As bactérias isoladas de rebanhos assintomáticos classificadas bioquimicamente como App eram NT e apresentaram resultados negativos para genes cpx. Estes isolados de App NT devem apresentar diferenças na estrutura capsular tornando-os menos virulentos do que os isolados de casos clínicos, uma vez que a cápsula é determinante a virulência (Inzana et alii, 1988).
Com o objetivo de caracterizar a presença de cápsula nos isolados analisados por PCRcpx e relacionar com a virulência dos mesmos, várias tentativas de coloração para a visualização microscópica de cápsula foram realizadas, porém
nenhuma foi conclusiva. Resultado similar foi observado por BOROWSKI (1992). Segundo INZANA (1990) a presença de cápsula pode ser visualizada pela iridiscência da colônia em meio claro. Assim, optamos para a realização desta análise visual, ressaltando que não é um teste conclusivo, pois depende do treinamento visual do observador, além de a cápsula não poder ser visualizada quando presente em pequena quantidade. Do total de quarenta e dois isolados de App analisados, entre eles 27 isolados de casos clínicos e 15 isolados dos rebanhos A, B e C, todos apresentaram cápsula determinada pela observação da iridiscência das colônias, inclusive os nove isolados que apresentaram teste de PCR negativo para os genes cpx. Podemos supor que estes isolados devem possuir um sistema de transporte diferente do operon cpxDCBA já caracterizado.
Todas as amostras de App, sorotipificáveis e não sorotipificáveis, isoladas de casos clínicos apresentaram por PCRsodC amplificação correspondente (Tabela 8). No entanto, entre as quinze amostras de App isoladas de leitões assintomáticos dos grupos A, B e C esta homogeneidade não ocorreu, apenas dois isolados App NT (6986 e 6951) apresentaram resultados negativos para PCRsodC (Tabela 9). Porém, ambos isolados apresentaram hemólise e presença de genes apxII (Collares, 2000) e o isolado 6985 foi positivo ao teste CAMP enquanto que o 6951 foi negativo. Até o momento, não há registro de amostra NAD-dependente, além de App, que apresente hemólise e CAMP teste positivo em isolados de suínos. Entre as outras quarenta e duas amostras NAD-dependentes não App isoladas de leitões assintomáticos, sete apresentaram amplificação de um fragmento correspondente ao gene sodC de App (Tabela 9), indicando que este PCR não é específico o suficiente para ser utilizado na caracterização da espécie A. pleuropneumoniae. De acordo com os resultados obtidos ocorreu isolamento de App (ST e NT) com resultado positivo para PCRsodC em todos os grupos de animais, independente do isolado ser de casos clínicos de PPS ou de rebanhos negativos. Estes resultados sugerem que a presença de sodC pode não ser um forte determinante de virulência, não se descartando a hipótese de que a CuZnSOD possa junto com outros fatores de virulência como cápsula e toxinas Apx ser um fator agravante de patogenicidade.
Das cinco amostras (03 de App, 01 de A. minor e 01 de A.suis) que foram analisadas quanto à presença de CuZnSOD todas apresentaram banda de atividade em gel nativo (Figuras 13, 14, 15, 16 e 17). O isolado NT (6951) analisado para presença de genes homólogos a cpx por hibridização apresentou PCRsodC
negativo. No entanto demonstrou uma banda de atividade correspondente a CuZnSOD, mas com perfil de migração diferente do perfil encontrado em App (Figura 15). Nossos resultados indicam que CuZnSOD pode auxiliar no processo de patogenicidade de App , mas não deve ser um fator essencial de virulência. Estudos realizados por SCHEEHAN et alii (2000) comparando experimentalmente amostras de App mutante e não mutante para sodC demonstraram que a amostra mutante desenvolveu sinais clínicos de PPS e foi igualmente virulenta quando inoculada em suínos.
Observamos ainda que as amostras de A. minor e de A. suis também apresentam a presença de CuZnSOD (Figuras 16 e 17). Até o momento não há registro da presença de SOD nestes organismos. A CuZnSOD de A. suis além de apresentar alta similaridade quanto à região do DNA amplificada e seqüenciada, também apresenta um perfil de migração em gel nativo similar a CuZnSOD de App.
A presença de MnSOD não foi observada em nenhuma das amostras analisadas (Figuras 13, 14, 15, 16 e 17). Estes dados são contraditórios aos de LANGFORD et alii (1996) e SCHEEHAN et alii (2000). Nosso cultivo foi aeróbico e segundo HASSAN & FRIDOVICH (1977b e 1979) MnSOD, codificada pelo gene sodA de E.coli, não é sintetizada anaerobicamente e é induzida por exposição ao O2 ou por O2−. Entretanto, NIEDERHOFFER et alii (1990) concluíram que nem O2 e nem O2− estão envolvidos na regulação de sodA em E. coli e que a sua expressão depende da natureza da fonte de carbono e o modo de crescimento, fermentativo ou respiratório. MOODY & HASSAN (1984) demonstraram que a atividade de MnSOD em E. coli foi aumentada quando foi fortemente diminuída a concentração de Fe no meio de cultura. Com base nos resultados apresentados podemos concluir que a superóxido dismutase ou a presença do gene sodC não deve ser considerada como um fator relevante de virulência para App.
Todos os isolados de App NT de casos clínicos e de rebanhos assintomáticos foram analisados por PCR (COLLARES, 2000) para verificar o perfil de genes que codificam as toxinas e relacionar com um provável grupo de sorotipos. Os isolados de casos clínicos apresentaram um perfil dos genes apxI, apxII ou apxIII, que codificam as diferentes toxinas, similares aos sorotipos conhecidos de App (Tabela 10). Portanto a impossibilidade de sorotipificar estes isolados sugere que estes podem ter perdido a habilidade de reagir com o anti-soro ou fazem parte de novos sorotipos que possuem o mesmo perfil de genes apx que alguns sorotipos