Reação em cadeia da polimerase (PCR)

A PCR é um método que consiste na síntese enzimática in vitro de seqüências de DNA através de primers que hibridizam na fita complementar do DNA do gene alvo. Uma série de ciclos repetidos que consistem de desnaturação da fita template, anelamento de primer e extensão dos primers anelados pela DNA

polimerase termoestável, resulta em acúmulo exponencial do fragmento de interesse. A amplificação da reação de PCR não é infinita. Após certo número de ciclos, a amplificação do fragmento desejado acumulando exponencialmente termina, entrando na fase linear ou estacionária. Este segundo estágio da reação é denominado plateau. O ponto no qual a PCR atinge o plateau depende do número de cópias da fita original de DNA presente na amostra e da quantidade total de DNA sintetizado (ERLICH, 1989).

Atualmente tem sido muito usada a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), tanto em medicina humana como veterinária, para detectar isolados clínicos de vírus e outros microrganismos (EHRLICH & GREENBERG, 1994). A PCR possui uma capacidade de amplificar seqüências específicas de DNA de um microrganismo em até 1012 vezes (LI et alii, 1988) com um limite de detecção na maioria das vezes de 102 UFC por tubo. Esta metodologia aplicada à detecção do agente da pleuropneumonia apresenta vantagens com relação a outras técnicas, por ser capaz de identificar a infecção antes que a doença esteja presente no plantel. Desta forma pode-se evitar maiores perdas e também a disseminação da doença pela venda de animais a plantéis livres de PPS.

Teoricamente, gêneros ou espécies de organismos infecciosos podem apresentar uma seqüência única de DNA, possibilitando a escolha judiciosa de oligonucleotídeos que servem como primers para a síntese de DNA (EHRLICH & GREENBERG, 1994). Estes primers específicos para genes de cada microrganismo, permite alta especificidade da PCR para detectar seqüências alvos de DNA elevando a probabilidade de detectar seqüências raras. Alguns fatores podem afetar a especificidade da reação de amplificação como: temperatura de anelamento, tempo de incubação durante o anelamento, concentração de primers e de enzima e a concentração de íons de magnésio, necessário para a atividade enzimática da polimerase (ERLICH, 1989). A PCR detecta a presença do material genético do microrganismo, ao contrário da resposta imune do hospedeiro, sendo a medida direta da infecção. Entretanto, esta característica pode levar à detecção de organismos não viáveis, podendo conduzir a resultado positivo clinicamente irrelevante, como no caso de DNA de bactéria morta após tratamento com antibiótico (EHRLICH & GREENBERG, 1994).

Uma outra grande vantagem do sistema de PCR é a capacidade de detectar um único microrganismo, produzindo um fragmento de DNA específico, a

partir de uma mistura de microrganismos sem o isolamento individual da bactéria (HANCE et alii, 1989; OLIVE, 1989). Quantidades muito grande de células bacterianas (maior que 106 /ml) podem inibir a reação de PCR devido à presença de inibidores; tendo este cuidado, resultados falsos-negativos encontrados em amplificações de DNA de extrato cru podem ser evitados (SIROIS et alii, 1991). Substâncias inibidoras presentes em amostras clínicas constituem-se no principal obstáculo para a utilização de PCR na detecção e identificação destes organismos (STONE et alii, 1994).

A PCR possui muitas vantagens como especificidade, sensibilidade e rapidez. No entanto, a presença ou ausência de um produto de amplificação de um tamanho esperado, não necessariamente reflete a presença ou ausência de um agente patogênico, sendo que para o projeto de primers, é importante escolher uma região codificante, pois isto minimizaria o risco de mutações pontuais que podem impedir a amplificação (GRAM & AHRENS, 1998).

A capacidade da PCR para detectar seqüências genéticas de quantidades muito pequena de DNA é uma vantagem comparada com outras formas sorológicas de detecção por duas razões principais: reações cruzadas entre antígeno e anticorpo são evitadas e amostras que tenham sido classificadas anteriormente como não tipificáveis, devido à autoaglutinação, poderiam ser tipificáveis por PCR. A amplificação de DNA por PCR é extremamente sensível, podendo ser aplicado diretamente na amostra sem a espera do cultivo da bactéria (LO et alii, 1998).

A técnica de PCR, pode ser uma alternativa para o diagnóstico etiológico da PPS, principalmente em animais cronicamente infectados e sem sinais clínicos aparentes pois, o isolamento do agente é dificultado pelo pouco número de células de A. pleuropneumoniae presentes e pela interferência da flora normal do trato respiratório (SIROIS et alii, 1991). Também o App é raramente isolado de animais saudáveis ou subclinicamente infectados (FENWICK & HENRY, 1994). A detecção do A. pleuropneumoniae de animais vivos por um método sensível, diferenciando-o dos outros microrganismos da flora do trato respiratório superior pode ser feita através de swab nasal ou de tonsila (SIROIS et alii, 1991).

Quando comparado com métodos convencionais de isolamento de App, o método de PCR aplicado direto na amostra clínica mostrou ser três vezes mais sensível para detecção de App, pois uma das dificuldades encontradas no isolamento da bactéria deve-se à dificuldade na identificação visual do

A. pleuropneumoniae da flora microbiana abundante da tonsila durante o subcultivo (GRAM et alii, 1996; GRAM & AHRENS, 1998).

SIROIS et alii (1991) iniciaram o desenvolvimento de testes baseados em PCR para detectar amostras de A. pleuropneumoniae e projetaram três primers a partir de um fragmento comum a todos os sorotipos isolado de um banco do DNA genômico de App. Estes primers foram capazes de reconhecer os 12 sorotipos de App pertencentes ao biotipo 1 e também amostras do biotipo 2. Outras amostras de H. influenzae, A. equlii, E. coli, A. suis, A. rossii e P. haemolytica não apresentaram produtos de amplificação.

PCR baseado na seqüência do gene omlA, que codifica uma proteína de membrana externa de A. pleuropneumoniae, revelou que este gene está presente em quatro diferentes grupos de sorotipos denominados grupo específicos, semelhantes aos grupos sorotipo-específico das toxinas Apx presentes em App: grupo 1: sorotipos 1, 9, 11 e 12; grupo 2: sorotipos 2 e 8; grupo 3: sorotipos 3, 4, 6 e 7 e grupo 4: sorotipos 5a, 5b e 10 (GRAM & AHRENS, 1998). Mais tarde, foi verificado que uma diferença na região média do gene omlA possibilitou diferenciar os sorotipos como pertencentes a cinco grupos: grupo 1 (omlAI) sorotipos 1, 9, 11 e 12; grupo 2 (omlAII) sorotipos 2 e 8; grupo 3 (omlAIII), sorotipos 3, 6 e 7; grupo 4 (omlAIV) sorotipo 4 e grupo 5 (omlAV) sorotipos 5a, 5b e 10. Quando comparados as reações de PCR para genes das toxinas apx e omlA foi possível identificar o mesmo padrão de sorotipo específico encontrado na maioria das amostras, possibilitando ainda a tipificação de amostras não classificadas por sorotipificação (GRAM et alii, 2000).

HENNESSY et alii (1993) utilizaram Arbitralily Primed Polimerase Chain Reaction (AP-PCR) e identificaram um padrão de bandas para cada um dos 12 sorotipos de A. pleuropneumoniae, possibilitando a tipificação de amostras que não puderam ser tipificadas por outros métodos como a soroaglutinação rápida (SAR). AP-PCR amplifica segmentos do DNA genômico que podem ou não codificar determinantes antigênicos ou relacionados com a virulência. Os demais organismos relacionados às doenças de suínos, puderam ser diferenciados do A. pleuropneumoniae pelo padrão de amplificação das bandas. Entretanto, este método requer cuidado especial, pois necessita de cultura pura da bactéria e é altamente suscetível a contaminações.

Outros trabalhos aplicaram a técnica de PCR com primers baseados na seqüência do gene aroA combinando com Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) e permitiram a divisão dos sorotipos de App em três grupos: grupo 1: sorotipos 1, 4, 5, 9, 11 e 12; grupo 2: sorotipos 2, 3, 6, 7 e 8 e grupo 3: sorotipo 10 (HERNANZ MORAL et alii, 1999).

Com a finalidade de avaliar a diversidade genética, CHATELLIER et alii (1999) caracterizaram quarenta e quatro isolados de A. pleuropneumoniae pertencentes aos sorotipos 1 (19 isolados) e 5 (23 isolados), oriundos de animais saudáveis e com sintomas de PPS de 35 rebanhos da região de Quebec (Canadá), através da utilização das técnicas de Random Amplified Polimorphic DNA Analisis (RAPD), Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) e tipagem por Polimerase Chain Reaction (PCR) para genes de toxinas. Diferentes perfis foram encontrados entre os suínos doentes e os portadores sadios, indicando que a diversidade entre as amostras isoladas de suínos saudáveis deve ser maior que a de animais portadores doentes e que existem diferenças que discriminam os sorotipos 1 do 5. Entretanto, foi observado que as amostras do sorotipo 1 isoladas de tonsilas de suínos portadores sadios apresentaram tipo de RAPD diferentes das amostras isoladas de pulmão de animais doentes. Desta forma a técnica de RAPD pode ser usada para identificar os diferentes isolados pertencentes ao sorotipo 1, enquanto que para o sorotipo 5, não foram observadas diferenças dos isolados, sendo necessário uma combinação de técnicas para a tipagem deste sorotipo. A metodologia de PFGE apresentou resultados compatíveis aos das técnicas de RAPD e PCR para genes de toxinas, permitindo a identificação do padrão de toxinas de trinta e nove isolados de acordo com a sorotipificação.