Superóxido dismutase (SOD)

O ambiente aeróbico é potencialmente tóxico para a vida devido à alta reatividade do oxigênio que, quando torna-se parcialmente reduzido, freqüentemente gera espécies de oxigênio reativas (FRIDOVICH, 1978).

Superóxido dismutases são enzimas que catalisam a dismutação das espécies reativas do radical ânion superóxido (O2−) altamente reativo para peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio (O2). As SODs assim como a catalase e a glutationa

peroxidase agem evitando a formação de espécies de oxigênio deletérios para a célula (BOWLER et alii, 1990; BITTENCOURT, 1998). Esta é a primeira etapa de uma série de reações que previnem o acúmulo de radicais livres de oxigênio tóxico gerados pela redução do oxigênio molecular (FRIDOVICH, 1989 e 1995). A remoção dos radicais superóxidos bloqueia reações secundárias que podem levar a formação do radical hidroxil (•OH) altamente reativo responsável por maiores danos em todas as classes de macromoléculas biológicas (ácidos nucléicos, proteínas e lipídios) (IMLAY & LINN, 1988; WILKIS et alii, 1998). Tem sido sugerido que enzimas antioxidantes que removem O2− ou H2O2 in vitro desempenham papel importante na proteção da viabilidade da bactéria in vivo (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1984; FRIDOVICH, 1989).

As superóxido dismutases, da família das metaloproteínas, são classificadas de acordo com o metal ligante no seu sítio ativo como: cobre-zinco superóxido dismutase (CuZnSOD), manganês superóxido dismutase (MnSOD) e ferro superóxido dismutase (FeSOD). Outras duas formas de SODs, níquel superóxido dismutase (NiSOD) e ferro-zinco superóxido dismutase (FeZnSOD), foram descritas em Streptomyces coelicolor Muller (KIM et alii, 1998). CuZnSOD e provavelmente NiSOD não possuem similaridade e são estruturalmente distintas de Fe e MnSOD (MEIER et alii, 1998) que possuem alta similaridade de seqüência primária, assim como de estruturas secundária e terciária (BOWLER et alii, 1990; WU et alii, 1998). Uma outra enzima a FeZnSOD apresenta uma região C-terminal conservada com as Fe e MnSODs (KIM et alii, 1998).

As SODs são encontradas em uma grande variedade de organismos e dentro de diferentes organelas e compartimentos celulares. MnSODs são principalmente encontradas em mitocôndria de eucariotos e em procariotos. FeSODs são encontradas principalmente em procariotos e em cloroplastos das plantas. As CuZnSODs são encontradas na maioria de eucariotos e em algumas bactérias (GRACE, 1990; GILLE & SINGLER, 1995; BITTENCOURT, 1998; FRIDOVICH, 1995). Em bactérias a FeSOD e MnSOD têm localização citoplasmática e estão envolvidas na remoção dos radicais ânions superóxidos gerados durante a respiração aeróbica (FRIDOVICH, 1995). A CuZn SOD é tipicamente encontrada em células eucarióticas, onde está presente no citosol, porém atualmente existem muitos estudos relatando a sua presença no periplasma de células procarióticas (FRIDOVICH, 1995; WU et alii, 1998).

Em E.coli o gene sodA, que codifica MnSOD, têm expressão regulada pelo nível de ferro (Fe) presente no meio de cultura, enquanto que o gene sodB, que codifica FeSOD, têm expressão constitutiva (NIEDERHOFFER et alii, 1990). A expressão de CuZnSOD é induzida durante a fase exponencial de crescimento e expressada em altos níveis somente na fase estacionária (BENOV & FRIDOVICH, 1994; IMLAY & IMLAY, 1996).

A presença de CuZnSOD tem sido relatada em muitos organismos patogênicos como: Escherichia coli (HASSAN & FRIDOVICH, 1979; BENOV & FRIDOVICH, 1994), Brucella abortus (BECK et alii, 1989), Haemophilus influenzae e Haemophilus parainfluenzae (KROLL et alii, 1991), Salmonella typhimurium (DE GROOTE et alii, 1997), Neisseria meningitidis (WILKS et alii, 1998), Mycobacterium tuberculosis (WU et alii, 1998) e Haemophilus pleuropneumoniae (LANGFORD et alii, 1996; SCHEEHAN et alii, 2000).

KROLL et alii (1995) utilizaram a técnica de PCR para detectar genes sodC que codificam CuZnSOD em organismos patogênicos de humanos e de animais como os membros dos grupos Haemophilus, Actinobacillus, Pasteurella e Neisseria meningitidis. Os autores confirmaram estudos prévios que a CuZnSOD procariótica é completamente separada evolucionariamente da CuZnSOD eucariótica.

Existem evidências do papel das CuZnSOD na virulência de bactérias patogênicas pela capacidade da enzima de dismutar radicais superóxidos gerados fora da célula bacteriana. Desta forma a localização de CuZnSOD no periplasma estaria protegendo a bactéria dos efeitos tóxicos dos radicais superóxidos produzidos fora da célula (LANGFORD et alii, 1996; WILKS et alii, 1998). Mutantes de S. typhimurium, N. meningitidis, H. ducreyi que não expressam CuZnSOD são mais sensíveis à atividade bactericida dos radicais superóxidos. Também apresentam efeito letal reduzido, quando inoculados por via oral ou intraperitonial em camundongo, demonstrando que são significantemente menos virulentos do que o tipo não mutante (DE GROOTE et alii, 1997; FARRANT et alii, 1997; WILKS et alii, 1998; SAN MATEO et alii, 1998). Também foi sugerido que Bacteroides gingivalis, um patógeno de infecções periodontais, possui capacidade de sobrevivência devida a presença deste tipo de SOD (AMANO et alii, 1990). No entanto, existem relatos conflitantes como em B. abortus onde mutantes para CuZnSOD continuam virulentos em camundongos (LATIMER et alii, 1992; TATUM et alii, 1992).

Possivelmente a CuZnSOD permite que o A. pleuropneumoniae resista a ação tóxica de espécies de oxigênio ativado produzido por células inflamatórias do hospedeiro pois, o produto da dismutação do radical superóxido, o peróxido de hidrogênio (H2O2), pode interferir no mecanismo mucociliar da bactéria do trato respiratório superior, favorecendo a colonização e permitindo o estabelecimento do A. pleuropneumoniae no organismo (LANGFORD et alii, 1996). Estudos demonstram que a excessiva produção de radical oxigênio pelos macrófagos e neutrófilos pulmonares, estimulados pelas toxinas Apx, é um fator importante nas lesões pulmonares que ocorrem em animais com PPS. As toxinas Apx provocam uma explosão oxidativa nos neutrófilos, que resulta numa produção excessiva de radicais de oxigênio provocando efeitos deletérios nas células do hospedeiro (DOM et alii, 1992a e b).

LANGFORD et alii (1992) clonaram os genes sodC de H. influenzae tipo b e de H. parainfluenzae e determinaram a presença de CuZnSOD pela visualização da atividade da proteína em gel de poliacrilamida não desnaturante. A presença de CuZnSOD também foi demonstrada em outras espécies de Haemophilus tais como: H. aphrophilus, H. paraphrophilus, H. haemolyticus, H. paraphrohaemolyticus, H. haemoglobinophilus, H. influenzae não tipável e H. parasuis. Também analisaram por hibridização Southern blot do DNA de H. influenzae não tipável, H. aphrophilus, H. paraphrophilus e H. haemolyticus com uma sonda de DNA de H. influenzae tipo b, indicando a existência de uma região homóloga entre estas espécies. Os mesmos autores clonaram e caracterizaram o gene sodC que codifica CuZnSOD de A. pleuropneumoniae. Analisaram também a vantagem da presença deste gene em App quanto à sobrevivência deste microrganismo no hospedeiro por aceleração na dismutação do superóxido derivado de neutrófilos durante a resposta à infecção em suínos.

O A. pleuropneumoniae apresenta evidências de possuir duas SODs, uma contendo o íon Mn e outra contendo os íons Cu/Zn. O gene sodC de A. pleuropneumoniae não é regulado por variações das fases de crescimento da bactéria. Análises de atividade em gel não desnaturante por separação eletroforética sugere que ambas, MnSOD (sodA) e CuZnSOD (sodC), são expressadas durante as fases de crescimento exponencial e estacionário. A expressão de sodA é regulada por O2e concentrações variadas de Fe2+. Trabalhos demonstraram que a enzima MnSOD de A. pleuropneumoniae foi funcionalmente ativa em condições de

crescimento aeróbico na presença ou ausência de ferro, e em condições de crescimento anaeróbico apenas na presença de ferro. Nenhum efeito regulatório ou variação da expressão em relação à fase de crescimento pôde ser detectada para o gene sodC de A. pleuropneumoniae. Analisando a atividade de SOD de diferentes compartimentos celulares foi demonstrado que a CuZnSOD é uma enzima extracitoplasmática, mais precisamente presente no periplasma. A presença de uma banda correspondente à CuZnSOD foi detectada por hibridização Western blot com soros de suínos inoculados com o sorotipo 3 de A. pleuropneumoniae, indicando que a enzima pode ser expressada durante a infecção (LANGFORD et alii, 1996). A existência de CuZnSOD extracelular reforça a hipótese sobre o efeito de proteção da bactéria contra a mortalidade fagocítica. Somente alguns organismos intracelulares como a Brucella abortus sobrevivem à fagocitose (BECK et alii, 1989). Outro exemplo, é a identificação de CuZnSOD em H. influenzae e H. parainfluenzae, que pode estar determinando a sobrevivência do agente no hospedeiro devido à rápida eliminação dos radicais superóxidos produzidos (KROLL et alii, 1991).

A seqüência de aminoácidos deduzida a partir do gene sodC de A. pleuropneumoniae foi comparada com as seqüências de CuZnSOD presente em outras bactérias. A porção N-terminal apresenta os aminoácidos característicos de peptídeo sinal, sugerindo que a proteína é exportada (LANGFORD et alii, 1996), como outras diversas CuZnSODs (JAMES, 1994). A região C-terminal possui uma seqüência de aminoácidos com nível de homologia de 75% com CuZnSOD de H. parainfluenzae (LANGFORD et alii, 1996). Com o objetivo de avaliar se a CuZnSOD é importante na proteção da bactéria contra radicais superóxidos um experimento foi desenvolvido com Neisseria meningitidis onde, foram inoculados camundongos com amostras sodC mutantes e tipo selvagem. Os resultados demonstraram que os animais que receberam inoculações com a amostra sodC mutante apresentaram menor índice de doença quando comparados com animais que receberam inoculações com o tipo selvagem, onde a maioria deles apresentaram a doença. Desta forma os autores sugerem que CuZnSOD está associada com fatores de virulência neste modelo experimental (WILKS et alii, 1998).

Recentemente, SCHEEHAN et alii (2000) desenvolveram um mutante de sodC por troca alélica do sorotipo 1 de A. pleuropneumoniae e investigaram o papel da proteína CuZnSOD na infecção causada por A. pleuropneumoniae. Também

analisaram a possibilidade do uso deste mutante, que não expressa CuZnSOD, como vacina viva. Nenhuma diferença foi observada em animais inoculados com o mutante comparado com animais inoculados com a amostra não mutante. Ambos desenvolveram lesões pulmonares hemorrágicas e pleurisia fibrinosa típica de infecção por A. pleuropneumoniae, sendo indistinguível a patologia das lesões de ambos os grupos.