Foram padronizadas a temperatura e concentração de íons de Mg para otimizar a reação de PCR. As temperaturas testadas variaram de 50oC e 55oC sendo utilizado para amplificação o DNA do sorotipo 9 de App. Para a padronização da concentração de MgCl2 foram testadas as concentrações de 1,5 mM, 2 mM e 2,5 mM.
A reação para um volume final de 25 µl foi padronizada para conter: 5 µl do DNA total de App; 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3); 2,5 mM MgCl2; 50 mM KCl; 200 µM de cada desoxinucleotídeo trifosfatado (dNTP's); 30 pmol de cada primer e 1 U de Taq DNA polimerase.
As reações de PCR foram realizadas em termociclador (MJ Research, Inc.) sendo o DNA desnaturado com uma etapa a 94°C por 5 minutos e amplificado por 35 ciclos consistindo de desnaturação a 94oC por 45 segundos; anelamento dos primers a 50oC por 45 segundos; polimerização a 72oC por 45 segundos. Após completados os 35 ciclos uma etapa adicional consistia de anelamento a 50oC por 2 minutos com uma etapa de polimerização a 72 oC por 5 minutos.
3.6.1 Controles da técnica de PCR.
Como controles positivos foram utilizadas amostras de referência dos doze sorotipos padrões de A. pleuropneumoniae, um isolado altamente virulento oriundo de pulmão de caso clínico agudo de PPS (6796), um isolado não sorotipificável oriundo de pulmão com sinais clínicos de PPS (7260), uma amostra padrão sorotipo 5a de App mutante não hemolítica (mIT4-H) e uma amostra padrão sorotipo 5a de App mutante não capsulada (K17-C) (Tabela 4).
Como controles negativos foram utilizadas amostras de referência de A. suis e S. aureus, isolados de campo com características bioquímicas de amostras padrões de H. parasuis, P. multocida, A. minor, B. anthracis, B. bronchiseptica e S. suis (Tabela 4). Com exceção de S. aureus e de B. anthracis as demais são freqüentemente encontradas no trato respiratório dos suínos.
TABELA 4. Amostras bacterianas utilizadas na padronização dos testes de PCRcpx e PCRsodC.
Espécie Sorotipo Amostra Referência
Actinobacillus pleuropneumoniae 1 Shope 4074 ATCC 27088 – Dr. R. Ross 2 1536 Dr. R. Ross 3 1421 Dr. R. Ross 4 M62 ATCC 33378 5a K17 ATCC 33377 5b L20 Dr. R. Ross
6 Femø SCI-A Dra. R. Petersen 7 WF83 SCI-A Dra. R. Petersen
8 F384 Dra. R. Petersen 9 F60 Dra. R. Petersen 10 13039 Dr. R. Ross 11 56153 Dr. R. Ross 12 1096 Dr. R. Ross 5a mIT4-H Dr. T. Inzana 5a K17-C Dr. T. Inzana 5b 6796 CNPSA-EMBRAPA NT 7260 CNPSA-EMBRAPA
Actinobacillus suis 110UK Dr. David Barcellos Pasteurella multocida Isolado de
campo
CNPSA-EMBRAPA Haemophilus parasuis Isolado de
campo CNPSA-EMBRAPA
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Actinobacillus minor Isolado de campo
CNPSA-EMBRAPA Streptococcus suis Isolado de
campo CNPSA-EMBRAPA
Bacillus anthracis Isolado de campo
CNPSA-EMBRAPA
ATCC: American Type Culture Collection Dr. Richard Ross, Iowa University, USA Dra. Ruth Petersen, Intervet, Denmark
Dr. Thomas Inzana, Virginiae University, USA Dr. David Barcellos, UFRGS, Brasil
3.6.2 Clivagem do produto PPsodC.
A reação de clivagem total do produto de PCR amplificado a partir de DNA da amostra padrão sorotipo 5a de A. pleuropneumoniae, foi realizada utilizando 2 U da enzima de restrição BamHI (GibcoBRL-Life Tecnology, Inc.) para cada micrograma de DNA. Foi utilizado o tampão para enzima REactTM Buffer Chart 3 (GibcoBRL- Life Tecnology, Inc.) e a reação foi incubada em banho-maria por 1 hora a 37ºC.
3.6.3 Eletroforese dos produtos de PCR em gel de agarose.
Na verificação do resultado de PCR, cerca de 25% (10 µl) do volume da reação foi separado por eletroforese em gel de agarose na concentração de 1,5%, com 0,5 µg de brometo de etídio/ml (TAYLOR, 1993) e visualizadas em um transiluminador de luz ultravioleta. O tampão utilizado para a corrida eletroforética foi TEB 1X (SAMBROOK et alii, 1989).
3.6.4 Southern blot.
3.6.4.1 Transferência de DNA para membrana de nylon.
Após separação por eletroforese em gel de agarose os produtos de PCR foram transferidos para uma membrana de nylon positivamente carregada (HibondTM-N+, Amershan Pharmacia Biotech) com a utilização do sistema de transferência VacuGeneTM XL Pump (Amersham Pharmacia Biotech). O protocolo utilizado seguiu a orientação do fabricante do sistema. As soluções de desnaturação, neutralização e SSC, foram preparadas segundo SAMBROOK et alii (1989).
3.6.4.2 Preparo da sonda para hibridização.
Foi utilizado como sonda o produto amplificado por PCR a partir de DNA do sorotipo 5a de A. pleuropneumoniae. Para purificação do fragmento de DNA amplificado foi utilizado o GFXTM PCR DNA and Gel band purification Kit (Amershan Pharmacia Biotech). O produto de 504pb foi separado por eletroforese em gel de
agarose na concentração de 1,5% e a etapa de purificação seguiu o protocolo fornecido pelo fabricante do kit.
O produto de PCR do sorotipo 5a de App utilizado como sonda foi marcado de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante do kit ECLTM Direct Nucleic Acid Labelling and Detection Systems (Amershan Pharmacia Biotech). Para a hibridização e revelação dos produtos de PCR foi utilizado o kit ECLTM Direct Nucleic Acid Labelling and Detection Systems (Amershan Pharmacia Biotech). Após esta etapa, a membrana foi exposta em um filme de radiografia (XK-1 - Kodak) por períodos de 10 a 30 segundos para visualização.
3.6.5 Seqüenciamento dos fragmentos de PCR
Para o seqüenciamento de parte do gene que codifica para a proteína CuZnSOD de A. suis e do sorotipo 5a de A. pleuropneumoniae pela técnica de Sanger (SANGER et alii, 1977) foi utilizado o Thermosequenase radiolabeled terminator cycle sequencing kit (Amersham Pharmacia Biotech). Foram realizadas duas reações de seqüenciamento, uma utilizando o primer Msod-UP e a outra reação utilizando o primer Msod-DO.
Os fragmentos amplificados relativos aos genes cpx foram seqüenciados também utilizando os dois primers cpx-UP e cpx-DO com as amostras do sorotipo 5a padrão de A. pleuropneumoniae e dos isolados 7047 e 7011 oriundos de rebanhos.
3.6.5.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante. 3.6.5.1.1 Solução estoque de acrilamida a 42%.
Acrilamida 42% (p/v) e N’, N’-metilenebisacrilamida 1,8% (p/v) dissolvidos em água destilada sob agitação com 5% (p/v) de resina monobeb Amberlite (Sigma Chemical Co.) por 1 hora. A solução foi filtrada e armazenada a 4°C protegida da luz até o momento do uso.
3.6.5.1.2 Montagem do gel, aplicação das amostras e corrida eletroforética.
Foram aplicados 5 µl de cada amostra contendo dideoxinucleotídeos marcados com α-33P. O DNA foi separado por eletroforese em gel de poliacrilamida (3.5.5.1.1) com a concentração de 8% contendo 8 M de uréia. A eletroforese foi realizada em uma cuba de eletroforese vertical com tampão TEB 1X por 2:30 horas com uma corrida eletroforética de 80 W constante com temperatura de 55°C.
3.6.5.1.3 Secagem do gel, exposição e revelação em filme de radiografia.
Após a corrida, o gel foi colocado em um secador de gel (Bio Rad gel Dryer model 583) por aproximadamente 2 horas e exposto a um filme de radiografia (Kodak) por 2 ou 3 dias, revelado por 30 segundos e fixado por 10 minutos (Kodak).