UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL CENTRO DE BIOTECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
CÁPSULA E SUPERÓXIDO DISMUTASE COMO FATORES DE VIRULÊNCIA EM Actinobacillus pleuropneumoniae
CATIA SILENE KLEIN
PORTO ALEGRE dezembro de 2000
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
CÁPSULA E SUPERÓXIDO DISMUTASE COMO FATORES DE VIRULÊNCIA EM Actinobacillus pleuropneumoniae
por
Catia Silene Klein
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular da UFRGS como um dos requisitos para obtenção do
grau de Mestre.
Profª. Irene Silveira Schrank Orientadora
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL CENTRO DE BIOTECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
Cápsula e Superóxido Dismutase como Fatores de Virulência em Actinobacillus pleuropneumoniae
por
CATIA SILENE KLEIN
Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, pela comissão formada pelos professores:
Profa.
Dra. Marisa Ribeiro de Itapema Cardoso Membro da Comissão
Prof.
Dr. Itabajara da Silva Vaz Jr Membro da Comissão
Dr. Itamar Antônio Piffer Membro da Comissão
Profa. Dra. Irene Silveira Schrank Orientadora e Presidente da Comissão
Este trabalho foi realizado nos laboratórios do Centro de Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, sendo financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio Grande do Sul (FAPERGS) e Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES).
AGRADECIMENTOS
À Dra. Irene Silveira Schrank, pela orientação, ensinamentos, sugestões, confiança em mim depositada durante a realização deste curso.
Ao Dr. Sérgio Ceroni da Silva pela atenção, auxílio, sugestões dadas e amizade durante a minha permanência no laboratório 213.
Ao Dr. Itamar Piffer pessoa que admiro muito e tornou possível a realização deste curso e também pelo apoio, atenção e sugestões dadas quando solicitei seus conhecimentos.
Aos Profs. Dra. Marilene Vainstein e Dr. Arnaldo Zaha, pelas sugestões e ensinamentos repassados através da comissão de acompanhamento.
Ao Prof. Dr. Augusto Schrank pela atenção dada sempre que solicitado. Aos secretários do PPGBCM Sílvia e Luciano pela amizade, dedicação e atenção profissional sempre que solicitados.
À todas as colegas do laboratório 213 pela convivência e amizade e em especial à Raquel e à Clarissa pelo auxílio técnico em muitos momentos.
Aos colegas da Embrapa e dos laboratórios 107, 205 e 210 pela convivência, amizade e auxílio quando necessário.
À amiga e colega Deise pela amizade, convivência, atenção e auxílio sempre que solicitei seus conhecimentos teóricos e práticos.
As amigas Jalusa, Valéria, Virgínia, Suzana e Patrícia pelo incentivo e apoio sempre em todos os momentos.
Ao Hermides pela amizade, auxílio, ensinamentos teóricos e práticos em muitos momentos.
À minha família especialmente aos meus pais pelo amor e esforços para a minha formação.
Ao meu marido Sérgio pelo incentivo, amor e compreensão na minha ausência e pelo apoio em todos os momentos de dificuldades.
À todos os professores e funcionários do Centro de Biotecnologia. À colega da Embrapa Maria Fávero pelo incentivo e ajuda laboratorial. Aos colegas do curso, pela amizade e convivência.
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas, símbolos e unidades ...viii
Lista de tabelas ... xi
Lista de figuras ... xii
Resumo... xiv
Abstract ... xvi
Capítulo 1 ...1
1 Introdução ...2
1.1 Importância da suinocultura no Brasil ...2
1.2 Doenças respiratórias dos suínos ...3
1.3 Pleuropneumonia suína (PPS) ...4 1.3.1 Agente etiológico da PPS...7 1.3.2 Caracterização bioquímica ...8 1.3.3 Isolamento do A. pleuropneumoniaae...9 1.3.4 Sorotipos de A. pleuropneumoniae ...11 1.3.5 Epidemiologia...12 1.3.6 Fatores de virulência ...13 1.3.6.1 Toxinas e LPS ...13 1.3.6.2 Cápsula. ...17
1.3.6.3 Superóxido dismutase (SOD)...23
1.3.7 Vacinas e resposta imune e celular...28
1.3.8 Técnicas utilizadas na identificação e detecção do A. pleuropneumoniae ...31
1.3.9 Reação em cadeia da polimerase (PCR) ...32
1.4 A espécie Actinobacillus suis ...36
1.5 Objetivos ...38
Detection of Actinobacillus pleuropneumoniae by PCR on field strains isolated from
healthy and diseased pigs...39
Capítulo 3 ...40
3 Materiais e métodos ...41
3.1 Origem das amostras analisadas ...41
3.2 Meios de cultura e condições de cultivo das amostras ...43
3.3 Enzimas...43
3.4 Caracterização do gene cpx de A. pleuropneumoniae...43
3.4.1 Clivagem do produto amplificado por PCRcpx ...43
3.4.2 Clivagem do DNA genômico. ...44
3.4.3 Detecção microbiológica de cápsula ...44
3.5 PCR para genes sodC de A. pleuropneumoniae...45
3.5.1 Desenvolvimento de primers específicos ...45
3.5.2 Extração de DNA total ...46
3.5.3 Aplicação da técnica de PCR para o gene sodC de A. pleuropneumoniae ...46
3.6 Otimização das condições de PCR para o gene sodC de A. pleuropneumoniae ...47
3.6.1Controles da técnica de PCR ...47
3.6.2 Clivagem do produto PPsodC ...49
3.6.3 Eletroforese dos produtos de PCR em gel de agarose ...49
3.6.4 Southern blot ...49
3.6.4.1 Transferência de DNA para membrana de nylon ...49
3.6.4.2 Preparo da sonda para hibridização...49
3.6.5 Seqüenciamento dos fragmentos de PCR ...50
3.6.5.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante...50
3.6.5.1.1 Solução estoque de acrilamida a 42% ...50
3.6.5.1.2 Montagem do gel, aplicação das amostras e corrida eletroforética...51
3.6.5.1.3 Secagem do gel, exposição e revelação em filme de radiografia...51
3.7 Detecção da atividade de superóxido dismutases (SODs)...51
3.7.1 Preparo das amostras de A. pleuropneumoniae ...51
3.7.2 Soluções utilizadas...52
3.7.2.2 Soluções para visualização de atividade das SODs ...52
3.7.2.2.1 Solução de NBT (Nitrobluetetrazolium) ...52
3.7.2.2.2 Solução de inibição KCN/H2O2...52
3.7.2.2.3 Solução reveladora...52
3.7.2.3 Solução estoque de acrilamida-bisacrilamida ...53
3.7.2.3.1 Solução separadora (Running)...53
3.7.2.3.2 Solução concentradora (Stacking)...53
3.7.2.4 Soluções aceleradoras da polimerização ...53
3.7.2.4.1 Solução aceleradora separadora (Running)...53
3.7.2.4.2 Solução aceleradora concentradora (Stacking)...53
3.7.2.5 Tampão para corrida eletroforética (10X)...53
3.7.3 Confecção dos géis nativos (não desnaturantes)...53
3.7.3.1 Gel separador (Running) ...53
3.7.3.2 Gel concentrador (Stacking)...54
3.7.4 Determinação do metal ligante...54
Capítulo 4 ...55
4 Resultados ...56
4.1 Caracterização do produto de amplificação relativo ao operon que codifica as proteínas de transporte de cápsula ...56
4.2 Padronização da técnica de PCR para amplificação do gene sodC ...60
4.3 Aplicação da técnica de PCRsodC em isolados de campo ...65
4.4 CuZnSOD em A. pleuropneumoniae...70
Capítulo 5 ...74
5. Discussão...75
Capítulo 6 ...87
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES
AP-PCR arbitrarily primed polymerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase com primers arbitrários)
α-33P fósforo radioativo Am Actinobacillus minor
App Actinobacillus pleuropneumoniae
aroA gene codificante - 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase BHI brain heart infusion
ºC grau Celsius
CAMP Christie, Atkin, Munch-Peterson reaction
CNPSA Centro Nacional de Pesquisa de Suínos e Aves CO2 dióxido de carbono
cm centímetros
CuZnSOD Cobre-Zinco superóxido dismutase
DNA ácido desoxirribonucléico
EDTA ácido etilenodiaminotetraacético; sal dissódico
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay (ensaio imunoenzimático) EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
ETB extrato total bacteriano FeSOD ferro superóxido dismutase
g força gravitacional HCl ácido clorídrico Hps Haemophilus parasuis kb kilobase KDA kilodalton LB Lúria Bertani
LPS-CL lipopolissacarídeos de cadeia longa MnSOD Manganês superóxido dismutase mg miligrama
Mg magnésio MgCl2 cloreto de magnésio ml mililitro mM milimolar
NAD nicotimamida-adenina-dinucleotídeo NBT nitrobluetetrazoliun
NT não sorotipificáveis
omlA gene codificante - outer membrane lipoprotein (lipoproteína de membrana externa)
ORF open reading frame (fase de leitura aberta) PMOL picomolar
PB par de bases
PH potencial de hidrogênio
PFGE pulsed field gel electrophoresis (PFGE) (Eletroforese em gel de campo pulsado)
PMSF fenilmetilsulfonil fluoreto
PPS pleuropneumonia suína
P/V peso por volume
PCR polymerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase) PCRcpx reação em cadeia da polimerase para genes cpx de
A. pleuropneumoniae
PCRsodC reação em cadeia da polimerase para genes sodC de A. pleuropneumoniae
PPcpx produto amplificado por PCRcpx utilizando os primers cpx PPsodC produto amplificado por PCRsodC utilizando os primers sodC PPMsod produto amplificado por PCRsodC utilizando os primers Msod RFLP restriction fragment length polymorphism (polimorfismo para
tamanho de fragmentos de restrição) rpm rotações por minuto
RTX repeat toxins (toxinas com repetições) SDS dodecilsulfato de sódio
SOD superóxido dismutase
SPF specific patogen free (livre de patógeno específico) SSC solução sódio citrato
ST sorotipificáveis
TEMED N,N,N’,N’-tetrametil etilenediametilamina TLCK Nα-p-tosil-L-lisina clorometil cetona
Tris tris (hidroximetil) aminometano U unidade
UFC unidade formadora de colônia
µg micrograma
µM micromolar
v/v volume por volume
10 X 10 vezes a concentração de uso 20 X 20 vezes a concentração de uso
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Isolados de A. pleuropneumoniae oriundos de casos clínicos no
Brasil ...42
TABELA 2. Número de amostras NAD-dependentes isoladas de tonsilas de
leitões assintomáticos ...42
TABELA 3. Seqüências dos primers sodC e Msod ...45
TABELA 4. Amostras bacterianas utilizadas na padronização dos testes de
PCRcpx e PCRsodC ...48
TABELA 5. Análise microbiológica de presença de cápsula ...60
TABELA 6. Classificação bioquímica e resultados de PCR de isolados App
de casos clínicos ...65
TABELA 7. Classificação bioquímica e resultados de PCRsodC dos isolados
de rebanhos assintomáticos...66
TABELA 8. Caracterização de isolados App originados de casos clínicos de
PPS ...67
TABELA 9. Caracterização de isolados App de rebanhos assintomáticos com
9 a 15 semanas de idade ...68
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Operon dos genes cpx com a região de 715pb amplificada pelos
primers cpx...44
FIGURA 2. Região genômica de App ressaltando o gene sodC (573 pb)...45
FIGURA 3. Clivagem do produto de PCR PPcpx do sorotipo 5a de A. pleuropneumoniae ...56
FIGURA 4. Clivagem do produto de PPcpx do isolado de A. pleuropneumoniae 6800 oriundo de campo...57
FIGURA 5. Esquema de clivagem do fragmento PPcpx com os sítios para TaqI ...57
FIGURA 6. Seqüência de nucleotídeo do produto PPcpx de App...58
FIGURA 7. Clivagem dos DNAs genômicos e hibridização com PPcpx ...59
FIGURA 8. Análise por PCR da presença do gene sodC em App ...61
FIGURA 9. Análise por PCR da presença do gene sodC ...62
FIGURA 10. Clivagem do fragmento PPsodC de App ...63
FIGURA 11. Esquema de clivagem do fragmento PPsodC com o sítio para BamHI ...63
FIGURA 12. Seqüência de nucleotídeo do produto amplificado de PPMsod...64
FIGURA 13. Detecção de CuZnSOD em App sorotipo 5a ...71
FIGURA 15. Detecção de CuZnSOD em isolado de App NT ...72
FIGURA 16. Detecção de CuZnSOD em isolado de A. minor...73
RESUMO
O Actinobacillus pleuropneumoniae causador da pleuropneumonia suína apresenta vários fatores relacionados com sua patogenicidade como presença de cápsula e de toxinas. As enzimas superóxido dismutase podem também estar envolvidas no processo de patogenicidade por permitir o App resistir a ação tóxica de espécies reativas de oxigênio produzido pelas células inflamatórias do hospedeiro. O operon composto dos genes cpxDCBA, responsável pelo transporte da cápsula, é altamente conservado nos diferentes sorotipos de App. A padronização do método de PCR para os genes cpx (PCRcpx) de App resultou na amplificação de um produto de 715pb a partir do DNA de todos os sorotipos com exceção do sorotipo 4. Como não ocorreu também hibridização do fragmento de PCR com DNA total do sorotipo 4 sugere-se que este deve apresentar um sistema alternativo de transporte de polissacarídeos capsulares diferente dos demais sorotipos. O desenvolvimento e aplicação do método de PCR para o gene sodC (PCRsodC) de App, que codifica a proteína CuZnSOD, resultaram na amplificação de um produto de 504pb em todos os sorotipos de App. Foram analisadas por PCRcpx e PCRsodC um total de 120 isolados NAD-dependentes oriundos da cavidade nasal ou de fragmento de pulmão de suínos. Entre estes isolados sessenta e três foram obtidos de casos clínicos de PPS e os outros cinqüenta e sete foram obtidos de diferentes rebanhos com aspectos clínicos e sanitário diversos.
Entre os isolados analisados para PCRsodC e PCRcpx cento e onze isolados confirmaram os resultados da classificação prévia. Somente nove isolados apresentaram resultados contraditórios sendo, todos eles, classificados como App não sorotipificávies (NT). Destes App NT isolados, três apresentaram um perfil de genes que codificam toxinas compatíveis com o sorotipo 4 e os demais isolados apresentaram perfis de toxinas correspondente aos outros sorotipos. O resultado de PCRcpx negativo pode sugerir que estes isolados devem possuir uma estrutura de genes similares aos do sorotipo 4 que não pôde ser detectada pelos primers cpx ou fazem parte de novos sorotipos que possuem estruturas diferente dos demais sorotipos padrões. Estes resultados indicam que a metodologia de PCRcpx pode ser aplicada na caracterização de isolados App diferenciando de outros isolados NAD-dependentes. Resultados do PCRsodC demonstraram que este gene é comum em todos os isolados App mesmo nos isolados de rebanhos sem sintomas de PPS.
Provavelmente a presença de superóxido dismutase não deve ser considerada como fator diretamente relacionado de virulência de App.
ABSTRACT
Actinobacillus pleuropneumoniae (App) is the etiological agent of porcine pleuropneumoniae. Several factors have been proposed to be involved in virulence as the presence of capsule and toxins. The role of superoxide dismutase as a potential virulence determinant can be suggested by the protection of the bacterial cell from the direct killing mechanisms used by the host immune system. The DNA region involved in the exportation of capsular polysaccharides (cpxDCBA) is highly conserved among the A. pleuropneumoniae serotypes. Using the specific PCR assay (PCRcpx) it was possible to amplify a 715 bp fragment from the DNA of all App serotypes with the exception of serotype 4. No hybridization product was visualized when total DNA from serotype 4 was hybridized against the 715 bp PCR product from serotype 5. We can suggest that serotype 4 has an alternative mechanism for the exportation of capsular polysaccharides. We have developed a PCRsod system that amplifies a 504 bp fragment from the sodC gene from al App serotypes. Using both PCR tests, PCRcpx and PCRsod, we have characterized 120 NAD-dependent isolates from tonsils of different herds. Among these, 63 were originated from herds with clinical symptons of swine pleuropneumoniae and 57 from animals of apparently healthy herds. The PCR assays (PCRcpx and PCRsod) have classified 111 isolates as App and are in agreement with the biochemical analysis. Only 9 App nonserotypeable (NT) showed conflicting results. Three of these isolates revealed a pattern of toxin amplification product compatible to serotype 4. The other App NT might represent a population of isolates that originally were serotypeable but lost the ability to react with serotype-specific antisera or might belong to new serotypes not yet described. The PCRcpx can be applied for detection of cpx genes from serotypeable App strains and for nonserotypeable strains isolates from acute cases of swine pleuropneumoniae. The PCRsod assay revealed that the sodC gene is present in all App isolates from different herds. Therefore, it is possible to suggest that the presence of CuZn-superoxide dismutase (sodC) is not directly related with App virulence.
CAPÍTULO 1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Importância da suinocultura no Brasil.
A suinocultura no Brasil gera cerca de 2,5 milhões de empregos diretos ou indiretos (GOMES, 1993). Com mão de obra tipicamente familiar, está presente em quase metade das propriedades agrícolas e é praticada na maioria por pequenos produtores, que participam de sistemas integrados coordenados pelas agroindústrias (BOHRER, 1993) tendo importância fundamental na fixação do homem no campo. VIOLA e BARTELS (1993) estimaram que 76% das propriedades rurais do Rio Grande do Sul possuem suínos e destas, 16% comercializam os animais como fonte de renda.
O rebanho de suínos no Brasil no ano de 1999 era de 36,5 milhões de cabeças, sendo que 66% da produção foi dirigida ao consumo interno através de produtos industrializados, 29% foi comercializada como carne congelada, salgada ou gorduras e 5% foi exportada (MARTINS, 1999). Segundo dados do censo agropecuário do IBGE no ano de 1996 o estado de Santa Catarina contava com um rebanho de 4.535.571 suínos sendo que o rebanho da região oeste do estado era de 3.431.932 suínos. O estado do Rio Grande do Sul contava com um rebanho de 3.933.845 suínos e destes, 2.799.195 localizavam-se na região noroeste do estado.
No Brasil existem 118 indústrias frigoríficas, que são responsáveis pelo abate de 22,4 milhões de suínos/ano, sendo 18,2 milhões com inspeção federal e gerando produção de 1,62 milhões de toneladas (MARTINS, 1999). A região sul do Brasil é responsável por 87% do abate inspecionado (GOMES, 1993) e detém mais de 50% da produção nacional com média de abate de 11.245.927 cabeças /ano (MARTINS, 1999).
A carne suína também é e continuará sendo a carne mais consumida mundialmente, com 38,1% a mais que a carne de aves que vem em segundo lugar (FAO/GIEWS, 2000). Na Alemanha, Holanda e Dinamarca o consumo chega a 50kg, na China consomem 19kg per capita por ano (GOMES, 1993). Quanto à produção mundial de carnes em 1998, a carne suína representou 45%, a de frango 29% e a de bovino 26%. A exportação brasileira de suínos no ano de 1997 foi de 63.827
toneladas para 81.565 toneladas no ano de 1998. Os índices de produção e produtividade foram comparáveis com os obtidos nos EUA, Canadá, Dinamarca, Holanda e Reino Unido (MARTINS, 1999).
Os números para o ano de 2000 no Brasil são de um rebanho de 38.300 milhões cabeças, com produção de 24.700 milhões de cabeças e 1.926 milhões de toneladas. A quantia de carne abatida, com inspeção federal, é de 19.900 milhões de cabeças, com um consumo interno de 1.807 milhões de toneladas e 10,9 kg/habitante. (ABIPECS/ABCS, 2000). A estimativa em milhões de toneladas para o ano de 2000, será de 90,3 para a produção e de 3,210 para exportação da carne suína (FAO/GIEWS, 2000). Até o mês de agosto deste ano, foram exportadas 72,4 mil toneladas, com receita de US$ 95,841 milhões, indicando um crescimento de 42% na quantidade e de 25% na receita obtida. No mês de agosto deste ano o volume de exportação foi de 15,5 mil toneladas, gerando receita de US$ 20,954 milhões, 126% superior ao volume verificado no mesmo mês do ano de 1999 (ABIPECS/ABCS, 2000).
1.2 Doenças respiratórias dos suínos.
Devido à criação intensiva de suínos na região sul e sudeste do Brasil, a ocorrência de doenças respiratórias está presente em quase todos os criatórios, aumentando assim o custo da produção.
A prevalência de doenças respiratórias determinada para o ano de 1987 para o estado de Santa Catarina foi de 47% para rinite atrófica e de 55,3% para pneumonias em animais oriundos de 133 rebanhos de sistema integrado de produção. A estimativa de perda foi de 3,7% para redução no ganho de peso diário causada por rinite atrófica e 2,4% por pneumonias, desde o nascimento até o abate dos animais. As principais doenças respiratórias dos suínos são: pneumonia micoplásmica (Mycoplasma hyopneumoniae), rinite atrófica (Bordetella bronchiseptica e Pasteurella multocida) e pleuropneumonia (Actinobacillus pleuropneumoniae) (SOBESTIANSKY et alii, 1987). As pneumonias são responsáveis pela perda de 2,4 suínos com peso de 95kg para cada 100 animais abatidos no sul do Brasil (PIFFER et alii, 1985b).
PIFFER et alii (1985b) analisaram um conjunto de animais com diversos graus de severidade de hepatização pulmonar e pleurisia observadas ao abate e
relacionaram com o desempenho produtivo no período de 128 e 169 dias de idade. A hepatização pulmonar associada com pleurisia pode levar a uma redução de 14,7% no desenvolvimento dos animais e a hepatização superior a 10% da área pulmonar pode reduzir em 9,3% o ganho de peso, quando comparados a animais sem comprometimento pulmonar do mesmo grupo.
No ano de 1992, foram abatidos 4.061.479 suínos terminados no estado de Santa Catarina e, do total, 6,07% foram condenados por pneumonia ou pleurisias e tiveram aproveitamento condicional da carcaça (AINCADESC, 1993).
Podem ser adotadas medidas estratégicas globais para o controle das doenças respiratórias como, despopulação do rebanho, desmame precoce medicado, produção em três sítios e sistema Zimmerman (PIFFER, 1997), porém é necessário avaliar os custos e escolher o melhor método de acordo com cada rebanho.
Em trabalho conjunto da Embrapa Suínos e Aves com o Centro de Biotecnologia/UFRGS-Porto Alegre-RS, buscamos desenvolver métodos cada vez mais precisos e seguros com a utilização de técnicas de biologia molecular para a detecção do microrganismo causador da pleuropneumonia suína, evitando maiores custos na produção.
1.3 Pleuropneumonia suína (PPS).
A PPS é uma doença infecto-contagiosa que se apresenta sob a forma superaguda, aguda, subaguda e crônica. Na forma super-aguda, os animais apresentam febre em torno de 41,5°C, apatia, anorexia e freqüentemente diarréia, tosse e vômito. Usualmente envolve inflamação do pulmão, pleura e pericárdio. A manifestação clínica da doença cursa com pneumonia fibrino-necrótica e hemorrágica aguda. A taxa de morbidade é baixa, mas a mortalidade pode chegar a 100% se os animais não forem medicados. A forma super-aguda se manifesta por um severo quadro respiratório, seguido de morte que pode ocorrer entre 24 e 36 horas após o surgimento clínico da enfermidade. Podem ser encontrados animais mortos, sem sinais clínicos anteriores, apresentando secreção sanguinolenta nas narinas e boca e na maioria das vezes, a infecção torna-se crônica. Na forma aguda, os mesmos animais apresentam febre em torno de 40.5-41oC, severo quadro respiratório com dispnéia, tosse, acompanhado de anorexia com morbidade alta e,
dependendo da virulência da amostra, a mortalidade pode variar sendo geralmente alta. As formas subaguda e crônica se desenvolvem após desaparecerem os sintomas agudos com pouca ou nenhuma febre e os sinais estão relacionados principalmente com a diminuição no desenvolvimento dos animais e tosse esporádica (NICOLET, 1992; SOBESTIANSKY et alii, 1999). Nos estágios agudos da pleuropneumonia as lesões histológicas são caracterizadas por necrose coagulativa, hemorragia, trombose vascular, edema, deposição de fibrina e infiltração do parênquima pulmonar por neutrófilos, linfócitos e macrófagos alveolares e pleurite fibrinosa (BERTRAM, 1985; LIGGET et alii, 1987; IDRIS et alii, 1993). Em lesões crônicas uma fina camada de tecido granuloso seqüestra a área de necrose pulmonar (LIGGETT et alii, 1987). O mesmo quadro morfopatológico pulmonar foi observado por MORES et alii (1984) através de experimentos com 16 suínos de 70 a 90 dias de idade inoculados com diferentes concentrações de A. pleuropneumoniae e sacrificados nos dias 1, 3, 5, 14 e 21 pós infecção (PI). Durante as primeiras 24 horas foi observada uma reação circulatória perivascular, peribronquial, interlobular e intra-alveolar caracterizada por edema, hemorragia e exudação fibrinosa. Até o quinto dia após a inoculação (PI) foi observada uma reação celular mononuclear que envolvia o tecido conjuntivo, alvéolos, brônquios, bronquíolos, vasos sangüíneos e linfáticos. Entre o quinto e vigésimo sétimo dia PI foi observada necrose do parênquima pulmonar e reação fibrótica.
Após a recuperação do quadro agudo da doença, alguns animais permanecem com lesões crônicas no pulmão, resultando numa redução no ganho de peso. Os suínos que sobrevivem à infecção tornam-se carreadores e portadores subclínicos do patógeno, podendo abrigar o App no trato respiratório, principalmente nas tonsilas ou na cavidade nasal (KUME et alii, 1984; SIDIBÉ et alii, 1993). Uma vez o rebanho tornando-se infectado, este permanece com a presença do agente (FENWICK & HENRY, 1994).
O A. pleuropneumoniae é um patógeno do trato respiratório, sendo específico de suínos (KUME et alii, 1984), entretanto, lesões de pleuropneumonia observadas em 3 grupos de camundongos inoculados experimentalmente com células de A. pleuropneumoniae intactas, lipopolissacarídeos (LPS) ou sobrenadante de cultura livre de células (CFCSF) contendo hemolisinas, foram similares àquelas encontradas em suínos (IDRIS et alii, 1993).
condenação de carcaças no abatedouro por aderência de pleura (pleurisia) (NICOLET, 1992; SOBESTIANSKY et alii, 1999). Os sintomas podem ocorrer ou se agravar quando a PPS está associada a outros problemas respiratórios. Lesões de hepatização pulmonar características de pneumonia enzoótica foram observadas em 78% dos animais inoculados com A. pleuropneumoniae (PIFFER et alii, 1986). Entretanto, o A. pleuropneumoniae é capaz de induzir sozinho, e sem a associação de vírus, uma pneumonia fulminante acompanhada de pleurite com mortalidade em torno de 50% (SHOPE, 1964).
O A. pleuropneumoniae é altamente contagioso, espalhando-se rapidamente para rebanhos não imunes e afeta suínos de todas as idades. Isso muitas vezes ocorre como resultado da introdução de animais portadores do agente em rebanhos livres da infecção (SEBUNYA & SAUNDERS, 1983; INZANA, 1991; CHATELLIER et alii, 1999). A severidade da doença depende do estado imune dos animais (NIELSEN, 1979), do número de bactérias que atingem o pulmão (SHOPE, 1964; SEBUNYA et alii, 1983b) e da presença concomitante de fatores estressantes (PIFFER et alii, 1982). Os índices de morbidade e mortalidade são muito variáveis, permanecendo entre 8,5% a 40% e 0,4% a 24%, respectivamente (SEBUNYA & SAUNDERS, 1983).
O primeiro surto de PPS ocorreu na Inglaterra e foi registrado por MATHEWS & PATTISON (1961), em seguida por ORLANDER (1963) nos EUA, por SHOPE (1964) na Argentina, por SCHIEFER & GREENFIELD (1974) no Canadá, por MYLREA et alii (1974) na Austrália, por HILBINK et alii (1992) na Nova Zelândia e em muitos outros países (SEBUNYA & SAUNDERS, 1983). LOCATELLI et alii (1981), registraram pela primeira vez no Brasil a ocorrência de um surto agudo de PPS no município de Chapecó – SC com morbidade de 70% e mortalidade entre 10 e 20%. Desde então, vários outros surtos foram observados na região sul do Brasil (PIFFER et alii, 1983) e existem relatos da ocorrência da enfermidade em todos os países onde a produção de suínos é intensiva (NICOLET, 1992; PIFFER et alii, 1987).
As perdas econômicas relacionadas à PPS recaem tanto sobre o produtor, como sobre a indústria. O produtor sofre em conseqüência das perdas de animais pela alta mortalidade, gastos com medicação, aumento do custo devido ao maior tempo para engorda e pela redução no desenvolvimento corporal dos animais. Na indústria, há muita condenação ou utilização condicional das carcaças devido a
sinais clínicos da doença (PIFFER et alii, 1982). As carcaças condenadas são destinadas para graxaria e conservas (PIFFER et alii, 1985b).
PROTAS et alii (1985) avaliaram que os custos com morte de animais e despesas com medicamentos nos três meses correspondentes à fase aguda da doença foram equivalentes a 31.681kg (21.081 kg por mortes e 10.600 kg por gastos com medicamentos) de suínos em condições de abate. ROHRBACH et alii (1993) sugeriram que 5,64 dias adicionais são necessários para suínos com infecção subclínica adquirirem peso para o abate quando comparados com suínos de rebanhos não infectados.
A PPS é transmitida por via respiratória e a doença espalha-se rapidamente de um animal doente para suínos sadios. O A. pleuropneumoniae pode ser transmitido pelo ar, por aerossóis, numa distância de poucos metros entre as baias adjacentes ou por contato direto suíno-suíno (SEBUNYA & SAUNDERS, 1983; SAVOYE et alii, 2000; JOBERT et alii, 2000). Cobaias (porquinhos-da-índia) inoculados por via intratraqueal com dose elevada de sorotipo 1 de A. pleuropneumoniae apresentaram morte em 24 horas com lesões pulmonares hemorrágicas, enquanto que animais com dose mais baixa foram sacrificados 11 dias após inoculação e apresentaram apenas hiperplasia do tecido linfóide peribronquial (PERFUMO et alii, 1999). Estes experimentos, sugerem que camundongos e cobaias podem ser usados como modelo para o desenvolvimento de experimentos de inoculação de A. pleuropneumoniae.
Alguns fatores de risco predispõem os surtos de PPS, como, a introdução e transporte de animais no rebanho, condições estressantes em decorrência do afastamento da mãe, condições climáticas adversas, alta umidade do ar e ventilação insuficiente, superlotação, mudança de regime alimentar, mistura com animais estranhos e/ou oriundos de outros lotes (PIFFER, 1997; NICOLET, 1992). Formas de manejo que causem estresse favorecem o surgimento da doença em rebanhos cronicamente infectados (SANFORD & JOSEPHSON, 1981; ROSENDAL & MITCHELL, 1983; NICOLET, 1992).
1.3.1 Agente etiológico da PPS.
A família Pasteurellaceae compreende organismos dos gêneros Haemophilus, Actinobacillus e Pasteurella. São organismos pequenos,
Gram-negativos, imóveis, pleomórficos, cocobacilos, anaeróbicos facultativos com metabolismo de forma respiratória ou fermentativa, com baixa taxa de G + C (38-44%) e genoma relativamente pequeno (MACINNES & SMART, 1993). No trato respiratório superior de suínos são encontrados sete membros fator V (Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo - NAD) dependentes da família Pasteurellaceae: Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Haemophilus taxon minor group, Haemophilus taxon C, D, E e F (PIFFER et alii, 1997). Através de análise de hibridização DNA-DNA e comparação das seqüências dos genes que codificam rDNA 16S, três novas espécies da família Pasteurellaceae foram propostas como pertencentes a diferentes grupos filogenéticos. O Haemophilus taxon minor group foi reclassificado para Actinobacillus minor, os taxa D e E foram classificados como Actinobacillus porcinus e o taxon F classificado como Actinobacillus indolicus (MØLLER et alii, 1996).
O A. pleuropneumoniae é capsulado, anaeróbico facultativo sendo o agente etiológico causador da pleuropneumonia suína. Suas colônias produzem zona β-hemolítica e as hemolisinas atuam sinérgicamente com a β-toxina de Staphylococcus aureus em células sangüíneas produzindo o efeito CAMP (SEBUNYA & SAUNDERS, 1983). O A. pleuropneumoniae foi classificado primeiramente como Haemophilus parahaemolyticus (PITTMAN, 1953). KILLIAN et alii (1978) recomendaram o uso do nome Haemophilus pleuropneumoniae para substituir Haemophilus parahaemolyticus, conforme SHOPE (1964) havia proposto para diferenciar do agente que causa doença em humanos. POHL et alii (1983) com o uso da técnica de hibridização do DNA reclassificou o agente como pertencente ao gênero Actinobacillus e denominou-o como Actinobacillus pleuropneumoniae. O A. pleuropneumoniae é diferenciado em 2 biotipos: biotipo 1, (β-NAD-dependente) requer fator de crescimento e biotipo 2 (β-NAD-independente) (POHL et alii, 1983). O biotipo 1 é distribuído em 12 sorotipos e é considerado mais virulento que o biotipo 2 (NICOLET, 1992; DOM & HAESEBROUCK, 1992; JACOBSEN et alii, 1996).
1.3.2 Caracterização bioquímica.
O A. pleuropneumoniae é identificado através dos seguintes testes: produção de hemólise, reação de CAMP, dependência do fator V, degradação da
uréia (BIBERSTEIN et alii, 1977), fermentação de manitol, D-galactose e ribose, incapacidade de fermentar arabinose, inositol, melibiose, rafinose, sorbitol, trealose e ausência de hidrólise pela α-fucosidase (GUTIERREZ et alii, 1993; MØLLER & KILIAN, 1990). Diferencia-se dos outros grupos basicamente por três reações: falta de produção de ácido da melibiose, hidrólise de leucina aminopeptidase e a falta de hidrólise pela α-galactosidase (GUTIERREZ et alii,1993), esta última também foi relatada por O`REILLY et alii (1984).
SIROIS & HIGGINS (1991) caracterizaram 67 amostras de A. pleuropneumoniae como pertencentes a seis grupos fenotípicos. No Brasil, PIFFER et alii (1997) caracterizaram 55 amostras de A. pleuropneumoniae isoladas de casos clínicos de PPS e descreveram sete grupos fenotípicos pela variação bioquímica. SIROIS & HIGGINS (1991) sugerem que as variações fenotípicas das amostras podem representar sub-biovares de amostras dependentes do fator V.
As diferenças nos testes bioquímicos, resultados conflitantes e problemas na sorotipificação das amostras de A. pleuropneumoniae com o surgimento de muitas amostras não sorotipificáveis, levaram a aplicação de outras metodologias objetivando a solução dos problemas de identificação e diferenciação das bactérias. As metodologias de PCR (Técnica de Reação em Cadeia da Polimerase) e Fingerprinting de DNA foram utilizadas como técnicas alternativas mais precisas na tentativa de facilitar o diagnóstico e a diferenciação dos sorotipos (HENNESSY et alii, 1993; RYCHLÍK et alii, 1994).
1.3.3 Isolamento do A. pleuropneumoniae.
O diagnóstico definitivo da pleuropneumonia é baseado nos sintomas clínicos e nas lesões observadas no momento da necrópsia com isolamento posterior do agente (MA et alii, 1990). O protocolo ideal sugerido para detecção do A. pleuropneumoniae tem sido a cultura da bactéria a partir de amostras de animais portadores assintomáticos (KUME et alii, 1984 e 1986; MITTAL et alii, 1983), pois constituem a forma mais importante de manutenção da infecção no rebanho e de transmissão da doença (ROSENDAL & MITTCHELL, 1983). Em torno de 30 a 60% dos suínos de rebanhos convencionais carregam o App na cavidade nasal ou nas tonsilas (KUME et alii, 1984, 1986; WILSON et alii, 1987; SIDIBÉ et alii, 1993; JACOBSEN & NIELSEN, 1995; GRAM et alii, 1996; KICH et alii (2000).
O A. pleuropneumoniae pode ser isolado dos pulmões, tonsilas e de secreções nasais dos leitões e de animais doentes com PPS de todas as idades, assim como da cavidade nasal e tonsilas de suínos portadores assintomáticos (KUME et alii, 1984; SIDIBÉ, 1993; MACHADO, 1996; KICH et alii, 2000). O isolamento a partir de secreção pode ocorrer nos casos super-agudos, devido ao grande número de bactéria, mas não de lesões crônicas, sendo necessário o diagnóstico sorológico (FENWICK, 1990). O isolamento de App das tonsilas e cavidade nasal é dificultado por inúmeras outras espécies de bactérias presentes, necessitando, portanto, de meios seletivos (SIDIBÉ et alii, 1993; JACOBSEN & NIELSEN, 1995). MØLLER et alii (1984) e SIDIBÉ et alii (1993) demonstraram que o App foi preferencialmente isolado das tonsilas comparativamente ao isolamento da cavidade nasal dos suínos. KICH et alii (2000) compararam três locais de coleta de material em leitões portadores assintomáticos para isolamento sendo estes: swab nasal; swab da superfície tonsilar e fragmento de tonsila. Estes materiais coletados foram submetidos a cultivo em três diferentes meios: 1) semeadura direta em meio sólido seletivo; 2) diluição em caldo BHI enriquecido e seletivo e 3) mesmas diluições anteriores com semeadura em ágar sangue com estria de Staphylococcus aureus. Este trabalho determinou que o melhor local de coleta é o fragmento de tonsila cultivado em meio sólido seletivo. Amostras isoladas das tonsilas são geneticamente mais divergentes do que as amostras isoladas de pulmão (CHATELLIER et alii, 1999). A aderência do App às células do epitélio tonsilar, constitui-se a primeira etapa no estabelecimento da bactéria no hospedeiro. Entretanto, os mecanismos pelos quais o App adere às células do epitélio tonsilar não estão totalmente claros. É possível que o App eventualmente sobreviva nas criptas tonsilares tornando o animal um portador (CHIERS et alii, 1999).
O A. pleuropneumoniae juntamente com P. multocida, foi isolado de otite média e interna em suínos desmamados, provavelmente, causada por uma infecção mista (DUFF et alii, 1996). Em suínos com osteomielite necrotizante e artrite fibrinopurulenta foi registrado o isolamento de A. pleuropneumoniae sorotipo 2, através da aplicação de hibridização in situ para RNA ribossomal 16S de A. pleuropneumoniae (JENSEN et alii, 1999). A amostra K17 pertencente ao sorotipo 5a, isolada de artrite em cordeiro, quando inoculada em suínos, produz lesões pneumônicas idênticas àquelas produzidas por isolados de suínos (BIBERSTEIN et alii, 1977). Estes dados indicam uma nova patogenia para o A. pleuropneumoniae.
GUTIERREZ et alii (1992) estudaram a viabilidade do A. pleuropneumoniae em amostras de pulmão, congeladas ou frescas, com diferentes métodos de diagnósticos e verificaram que o isolamento de A. pleuropneumoniae de amostras de pulmão fresco foi de 15,3% e de pulmão congelado foi de 0,9%. Esta diferença demonstra que o A. pleuropneumoniae é sensível ao congelamento e que quando pretende-se isolar o agente, amostras frescas devem ser enviadas ao laboratório. O organismo sobrevive por curto período de tempo no ambiente e quando protegido com muco ou matéria orgânica pode sobreviver por poucos dias (NICOLET, 1992).
1.3.4 Sorotipos de A. pleuropneumoniae.
O A. pleuropneumoniae é classificado em no mínimo 12 sorotipos baseado na estrutura dos seus antígenos capsulares (NIELSEN, 1986; NICOLET, 1988; INZANA et alii, 1988).
Os sorotipos 1, 2 e 3 foram descritos por NICOLET (1971), os sorotipos 4, 5 e 6 por GUNNARSON et alii (1977), o sorotipo 7 por ROSENDAL & BOYD (1982), o sorotipo 8 por NIELSEN & O’CONNOR (1983), os sorotipos 9 e 10 por NIELSEN (1985a e b), e o sorotipo 12 por NIELSEN (1986a). O sorotipo 1 e o sorotipo 5 foram divididos em dois subtipos a e b devido a diferenças antigênicas nos LPS e polissacarídeos capsulares, respectivamente (JOLIE et alii, 1994; NIELSEN, 1986b). Foram descritos sete antígenos somáticos (lipopolissacarídeos de cadeia longa- LPS-CL), sendo que estes possuem reações cruzadas entre os diferentes sorotipos. Os sorotipos capsulares 1, 9 e 11 apresentam o mesmo antígeno somático 1, os sorotipos 3, 6 e 8 o antígeno somático 3 e os sorotipos 4 e 7 o antígeno somático 4. Os demais sorotipos capsulares 2, 5, 10 e 12 apresentam um único antígeno somático 2, 5, 6 e 7 respectivamente (NAKAI et alii, 1992). Devido à similaridade de antígenos LPS, reações cruzadas podem ocorrer entre os sorotipos 1, 9 e 12; entre os sorotipos 4 e 7; entre os sorotipos 3, 6 e 8 (NICOLET, 1988).
Diferenças significativas na virulência dos 12 sorotipos têm sido observadas, sendo considerados os sorotipos 1, 5, 9 e 11 como os mais virulentos, estando envolvidos em surtos graves da doença, com alta taxa de mortalidade e graves lesões pulmonares. Os sorotipos 2, 3, 4, 6, 7, 8 e 12 se apresentam como os menos virulentos, causando menores níveis de mortalidade (RAPP et alii, 1985;
INZANA, 1991; NICOLET, 1992). Entretanto, existem relatos de diferenças na patogenicidade entre amostras do mesmo sorotipo, tendo sido isoladas amostras pouco virulentas do sorotipo 5 e muito virulentas do sorotipo 3 e 7 (INZANA, 1991; PIFFER & MORES, 1995).
Diferenças na seqüência de nucleotídeos na região média do gene omlA do A. pleuropneumoniae, dividiu os sorotipos em 4 grupos com similaridades variáveis. Um grupo contém os sorotipos 1, 9, 11 e 12 com 99-100% de similaridade, outro grupo apresenta os sorotipos 3, 4, 6, 7 e 8 com 97 e 100% de similaridade e um terceiro grupo com os sorotipos 5a, 5b e 10 com similaridade próxima de 100%. Somente o sorotipo 2 constituiu um grupo separado (GRAM & AHRENS, 1998).
1.3.5 Epidemiologia.
O padrão de distribuição dos sorotipos no mundo varia de um país para outro, sendo que poucos sorotipos predominam numa determinada região geográfica e um mesmo rebanho pode ser contaminado por diferentes amostras do mesmo sorotipo ou diversos sorotipos (SEBUNYA & SAUNDERS, 1983; INZANA, 1991; CHATELLIER et alii, 1999).
A determinação do sorotipo é importante para o controle epidemiológico, manutenção de rebanhos e monitoramento da dispersão ou introdução de novas cepas (LO et alii, 1998). O conhecimento da distribuição dos sorotipos é importante na aplicação de vacinas, pois as vacinas inativadas protegem apenas contra os sorotipos que a constituem (NIELSEN et alii, 1976; NIELSEN, 1984).
Entre 1981 e 1984 foram identificados no Brasil os sorotipos 3 e 5 (PIFFER et alii, 1987). Posteriormente, os sorotipos 1, 3, 4 e 5 foram identificados no período de 1986 e 1987 (SAITO et alii, 1988). No primeiro período, o sorotipo 5 foi o mais prevalente e no segundo período o sorotipo 1 (PIFFER et alii, 1997). Durante o desenvolvimento deste trabalho apenas os soros hiperimunes contra os sorotipos de 1 a 5 estavam disponíveis, portanto PIFFER et alii (1987) sorotipificaram apenas 19/33 (66%) das amostras estudadas.
Em outro estudo, PIFFER et alii (1997) utilizando as técnicas de imunodifusão (GUNNARSON, 1979) e hemaglutinação passiva (NIELSEN & O`CONNOR, 1983), classificaram sorologicamente 55 isolados oriundos de pulmão e da cavidade nasal de suínos com casos clínicos de PPS no sul e sudeste do Brasil
no período entre 1981 e 1993. Destes isolados, 54,5% pertenciam ao sorotipo 5, 27,3% ao sorotipo 3 e 13% ao sorotipo 7, dois isolados pertenceram ao sorotipo 1 e um ao sorotipo 9. No estado do Rio Grande do Sul, foram isolados os sorotipos 3 (BOROWSKI et alii, 1995), 5 e 7, em Santa Catarina 3, 5 e 7, no Paraná e São Paulo, o sorotipo 5 e em Minas Gerais os sorotipos 1, 3, 5, 7 e 9 (PIFFER, 1997).
Em um estudo da prevalência dos sorotipos na Austrália no período de 1988 à 1992 foi possível determinar que de 296 isolados de App, apenas 156 (52,7%) puderam ser sorotipificados como pertencente a apenas um dos 12 sorotipos como segue: sorotipo 1 (85 isolados), sorotipo 2 (4 isolados), sorotipo 3 (2 isolados), sorotipo 5 (10 isolados), sorotipo 7 (51 isolados), sorotipo 11 (2 isolados) e o sorotipo 12 (2 isolados). Dos 140 isolados restantes, 91 tiveram reações cruzadas com os sorotipos 3 e 6, 1 com os sorotipos 9 e 10, 1 com os sorotipos 9 e 11 e outros 47 permaneceram não sorotipificáveis (BLACKALL & PAHOFF, 1995). Em outro estudo no período de 1993 à 1996, 91% (346/378) dos isolados foram sorotipificados como pertencentes aos sorotipos 1 (104 isolados), 7 (83 isolados) e 12 (104 isolados), restaram ainda 3,4% dos isolados como não sorotipificáveis e 5,1% como autoaglutinantes (BLACKALL et alii, 1999).
1.3.6 Fatores de virulência. 1.3.6.1 Toxinas e LPS.
Os padrões de virulência entre os sorotipos são bastante variáveis, podendo existir diferenças entre amostras do mesmo sorotipo o que estaria relacionado com a composição, estrutura e quantidade de cápsula (INZANA, 1991). Quando suínos saudáveis são expostos a sorotipos pouco virulentos ou um baixo número de bactérias de sorotipos virulentos, apresentam títulos de anticorpos séricos aumentados, embora não apresentem sinais clínicos característicos da PPS (FENWICK & HENRY, 1994). MACHADO (1997) realizou um experimento inoculando três grupos de animais com os sorotipos 3, 5 e 7 de A. pleuropneumoniae, mantendo outros não inoculados em contato. Os animais inoculados com o sorotipo 5 apresentaram sinais de pleuropneumonia aguda com lesões características observadas na necrópsia. Os animais inoculados com os sorotipos 3 e 7 apresentaram alguma tosse, quando movimentados, sem sinais clínicos de pleuropneumonia e na necrópsia não apresentaram lesões
macroscópicas. Este experimento demonstrou que a diferença na virulência entre os sorotipos pode influenciar no desenvolvimento da doença.
Em relação aos outros sorotipos, alguns autores descrevem que nenhuma diferença na virulência foi observada quando foram analisados os sorotipos 2, 3 e 9 de A. pleuropneumoniae NAD-dependente (DOM & HAESEBROUCK, 1992). No entanto, outros autores descrevem o sorotipo 9 como mais virulento que o sorotipo 2 e muito mais virulento que o sorotipo 3 (DESROSTERS et alii, 1984). Similaridade de virulência também foi encontrada entre os sorotipos 2, 5b e 6 do biotipo 1 (JACOBSEN et alii, 1996).
DOM & HAESEBROUCK (1992) inocularam leitões sem imunidade ativa e passiva para comparar a virulência de uma amostra de A. pleuropneumoniae sorotipo 2 NAD-dependente e uma amostra sorotipo 2 NAD-independente. Três de seis animais inoculados com 500 UFC da amostra NAD-independente morreram 36 horas após a inoculação e outros 3 animais não apresentaram sintomas e foram necropsiados 2 dias após a inoculação, apresentando poucas lesões com quantidade de bactéria de 105-106 UFC por grama de tecido pulmonar. Entretanto, os outros três suínos sem imunidade ativa e passiva inoculados com 50 UFC de amostra NAD-independente desenvolveram doença super-aguda e morte em 36 horas. Outros 7 animais inoculados com a amostra NAD-dependente apresentaram um perfil mais virulento em apenas 12 horas após a inoculação e exceto um, todos os demais morreram 36 horas após a inoculação, apresentando pleuropneumonia severa e uma quantidade de bactéria de 108-109 UFC por grama de tecido pulmonar (DOM & HAESEBROUCK, 1992). Este experimento indicou que amostras NAD-dependentes são mais virulentas que amostras NAD-inNAD-dependentes, porém amostras NAD-independentes podem causar lesões similares tanto patológicas quanto histologicamente, conforme já havia sido observado por FODOR et alii (1989).
Alguns componentes celulares do A. pleuropneumoniae têm sido relacionados com sua virulência e patogenicidade entre os quais: moléculas receptoras de membrana responsáveis pela captação de ferro, um elemento essencial para crescimento bacteriano (NIVEN et alii, 1989; GONZÁLES et alii, 1990); proteínas de membrana (GONZÁLEZ et alii, 1990); fímbrias que possibilitam a adesão da bactéria nos tecidos (UTRERA & PIJOAN, 1991); cápsula que impede a fagocitose da bactéria pelos macrófagos (INZANA et alii, 1988); proteases que
degradam IgA e hemoglobina suína mas não degradam IgG suína (NEGRETE-ABASCAL et alii, 1994); lipopolissacarídeo (LPS) responsável pela inflamação pulmonar aguda (UDEZE et alii, 1987; BÉLANGER et alii, 1995); citotoxinas que inativam macrófagos, neutrófilos e outras células do sistema imune (DOM et alii, 1992b); hemolisinas que causam lise celular e necrose dos tecidos (BHATIA et alii, 1991; KAMP et alii, 1997) e a urease que catalisa a hidrólise da uréia para produzir amônia e dióxido de carbono (BOSSÉ & MACINNES, 1997). No entanto, uma amostra mutante que não produz urease mostrou-se virulenta e desenvolveu PPS aguda indistingüível da produzida pela amostra tipo selvagem, indicando que o A. pleuropneumoniae não necessita da atividade da urease para desenvolver doença aguda (TASCÓN-CABRERO et alii, 1997).
Estudos de revisão sobre os fatores de virulência têm sido realizados por INZANA (1991), TASCÓN et alii (1996) e HAESEBROUCK et alii (1997), onde ressaltam como os principais fatores responsáveis pela virulência as toxinas Apx, a cápsula, o LPS e as proteínas de membrana.
Os mecanismos pelos quais o A. pleuropneumoniae danifica os tecidos e as células não são totalmente conhecidos (BHATIA et alii, 1991; IDRIS et alii, 1992; UDEZE & KADIS, 1992) e a variação na virulência entre os sorotipos é devida à presença de diversos fatores (INZANA, 1991), podendo ser considerada multifatorial.
Os diferentes graus de virulência dos sorotipos de A. pleuropneumoniae podem estar correlacionados com os padrões heterogêneos na produção de toxinas Apx, sendo ApxI e ApxII relacionadas com as amostras mais virulentas (TASCÓN et alii, 1994). O A. pleuropneumoniae produz quatro diferentes toxinas da família RTX (Repeat ToXins), denominadas toxinas ApxI, ApxII, ApxIII (FREY et alii, 1993; FREY, 1995) e ApxIV (SCHALLER et alii, 1999). Em cultivo a maioria dos sorotipos produz duas toxinas assim, os sorotipos 1, 5a, 5b, 9 e 11 produzem ApxI e ApxII, os sorotipos 2, 3, 4, 6 e 8 produzem ApxII e ApxIII. Os demais sorotipos produzem apenas uma toxina: ApxI pelo sorotipo 10 e ApxII pelos sorotipos 7 e 12 (FREY & NICOLET, 1990; KAMP et alii, 1991).
A ApxIA é uma proteína de 105 kDa fortemente hemolítica e citotóxica e os sorotipos que a expressam são considerados os mais virulentos (KAMP et alii, 1991; BECK et alii, 1994). A biossíntese desta toxina é induzida por íons Ca+, havendo indícios da necessidade de Ca+ para a sua atividade (FREY & NICOLET, 1988; FREY et alii, 1991a). A ApxIIA, é uma proteína de 103-105 kDa fracamente
hemolítica e moderadamente citotóxica (KAMP et alii, 1991, FREY et alii, 1992). A sua biossíntese não é induzida por Ca+, mas este íon é um cofator para a atividade hemolítica (FREY & NICOLET, 1990). A ApxIIIA é uma proteína de 120 kDa, diferindo das outras por não possuir atividade hemolítica, mas é fortemente citotóxica (KAMP et alii, 1991). A toxina Apx IV, recentemente clonada, seqüenciada, expressada e caracterizada como uma proteína de 202 kDa, não é hemolítica sendo expressada apenas in vivo por todos os sorotipos (SCHALLER et alii, 1999). As toxinas RTX possuem atividades hemolíticas e citotóxicas independentes uma da outra (TU et alii, 1994).
As toxinas Apx contém unidades repetidas de nanopeptídeos ricos em glicina na região C-terminal onde liga Ca+ (cálcio) (SCHALLER et alii, 1999), que são responsáveis pela fenótipo β-hemolítico do A. pleuropneumoniae (INZANA, 1991) e pela reação de CAMP (CHRISTIE et alii, 1944) do A. pleuropneumoniae (FREY et alii, 1994), teste muito importante para a caracterização da espécie (KRIEG & HOLT, 1984).
A virulência do A. pleuropneumoniae é fortemente relacionada com as toxinas Apx (BECK et alii, 1994) responsáveis pela necrose observada nos casos agudos de pleuropneumonia em camundongos e suínos (UDEZE, 1987). O mecanismo de ação destas toxinas é a formação de poro na membrana da célula-alvo (hemácias) e na membrana fosfolipídica (INZANA, 1991; BURROWS & LO, 1992). ApxI e ApxII estimulam em pequenas doses neutrófilos e macrófagos alveolares sendo, em grandes doses, citotóxicas para eritrócitos, neutrófilos e linfócitos pulmonares de suínos, células endoteliais e macrófagos (ROSENDAL et alii, 1988; KAMP & VAN LEENGOED, 1989; FREY & NICOLET, 1990; IDRIS et alii, 1993; FENWICK & HENRY, 1994, CRUIJSEN et alii, 1996). O A. pleuropneumoniae não produz sideróforos, mas é capaz de captar ferro do hospedeiro através da lise celular causada pelas toxinas Apx, que faz a liberação da hemoglobina, de onde retira ferro para seu crescimento (BÉLANGER et alii, 1995).
As toxinas são os fatores bacterianos responsáveis pelo desenvolvimento dos sintomas clínicos e das lesões nos pulmões típicas de PPS (KAMP et alii, 1997). Estas lesões são em parte causadas pelos efeitos citotóxicos das toxinas Apx nas células epiteliais alveolares. Células de A. pleuropneumoniae viáveis são capazes de destruir as células epiteliais, entretanto, bactéria inativada e mutantes que não secretam toxinas Apx não causam morte nestas mesmas células (VAN DE
KERKHOF et alii, 1996). Entretanto o biotipo 2 de A. pleuropneumoniae produz a toxina ApxIIA tanto in vitro como in vivo e não produz as toxinas ApxIA e ApxIIIA (DOM et alii, 1994). Esta diferença na expressão das toxinas entre os 2 biotipos de App pode explicar a diferença no potencial de virulência entre os dois biotipos (FREY, 1995).
Entre as outras espécies de Actinobacillus encontrados no trato respiratório de suínos somente foi detectada a presença de toxinas homólogas a ApxIA e ApxIIA de A. pleuropneumoniae em Actinobacillus suis (KAMP et alii, 1994; BURROWS & LO, 1992; OSTAAIJEN et alii, 1997). No entanto, o A. suis não expressa a toxina ApxIV indicando ser esta uma toxina espécie-específica (SCHALLER et alii, 1999).
A atividade biológica do LPS de A. pleuropneumoniae induz pneumonia multifocal ou intersticial em camundongos e suínos como infiltração de células inflamatórias. É provável que o LPS atue em conjunto para intensificar as lesões causadas pelas toxinas (UDEZE et alii, 1987). A estrutura das cadeias O do LPS são específicas para alguns sorotipos, mas todas são compostas de derivados de glicose, galactose, ramnose, N-acetilglucosamina e N-acetilgalactosamina (INZANA, 1991). BÉLANGER et alii (1990) descreveram que 83% dos sorotipos que possuem cadeias lisas de LPS aderem fortemente aos anéis da traquéia, enquanto que 80% dos sorotipos de cadeia parcialmente lisa aderem fracamente. Isto indica que o LPS está associado com a aderência e pode ser um fator específico da colonização do trato respiratório atuando como a principal adesina do A. pleuropneumoniae. Os mesmos autores relataram que a aderência do A. pleuropneumoniae na cavidade nasal do suíno está associada com a ligação do lipídio A do LPS às cadeias α e β da hemoglobina.
1.3.6.2 Cápsula.
Os polissacarídeos capsulares (ou cápsula) são reconhecidos como importantes fatores de virulência. Estes são responsáveis, na ausência de anticorpos específicos, pelo aumento da resistência e da invasividade da bactéria pela capacidade de evadir da fagocitose (INZANA & MATHISON, 1987; BEYNON et alii, 1991). Também inibem a atividade bactericida do soro protegendo a bactéria das defesas do hospedeiro. A cápsula confere hidrofilicidade à superfície da bactéria
sendo uma característica importante para que não ocorra a fagocitose (BOROWSKI, 1991). A resistência à fagocitose nas bactérias Gram-negativas, mediada pela cápsula, atua como uma barreira protetiva podendo ocorrer através da inibição da ativação do complemento e sendo influenciada pela composição e massa molecular capsular (INZANA et alii, 1988; WARD & INZANA, 1997).
Estudos analisando a toxicidade da cápsula purificada demonstraram que esta não é capaz de ativar a cascata do complemento, que não demonstra atividade tóxica para a reação dermal de Shwartzman, atividade pirogênica em cobaios, mortalidade de embrião de galinha ou blatogênese dos linfócitos periféricos do sangue dos suínos (INZANA, 1991).
O A. pleuropneumoniae é resistente à lise pelo complemento na presença de anticorpos para antígenos capsulares ou somáticos. A resistência do A. pleuropneumoniae para anticorpos somáticos ocorre pela inacessibilidade dos antígenos somáticos devida à interferência esteárica da cápsula, enquanto que a resistência para anticorpos capsulares pode ser pelo fato que a cápsula impede a fixação do complemento na membrana da bactéria (INZANA et alii, 1988). Os sorotipos 1, 2, 3, 5 e 7 capsulados são resistentes à lise por anticorpo e complemento, quando utilizado soro hiperimune de coelho ou de suíno. Entretanto já existem relatos de amostras do sorotipo 2 e 3 lisadas quando utilizado soro normal de humano. Mutantes acapsulados do sorotipo 5 são efetivamente lisados em presença de soro normal de suíno, humano, coelho ou cobaia (INZANA, 1991). INZANA (1991) sugere que a presença e o tipo da cápsula são importantes na resistência à lise mediada por complemento na presença ou ausência de anticorpo específico. No soro normal o A. pleuropneumoniae é resistente à fagocitose por leucócitos polimorfonucleares, entretanto é opsonizado em presença de anticorpos para cápsula. A fagocitose de amostras mutantes acapsuladas também necessita de opsonização com anticorpos (INZANA, 1991). Também no soro normal, na ausência de anticorpos específicos, a cápsula limita a quantidade de anticorpos e deposição do componente C9 do complemento na superfície bacteriana, mas não previne a ativação do complemento ou a ligação do componente C3 do complemento na superfície da bactéria. No entanto, não estão totalmente esclarecidos todos os mecanismos responsáveis pela resistência do A. pleuropneumoniae à lise ou fagocitose. Provavelmente, o LPS e o polissacarídeo capsular atuam em conjunto ou
em diferentes estágios da infecção para limitar a habilidade do complemento na eliminação do A. pleuropneumoniae (WARD & INZANA, 1994).
BERTRAM (1985) determinou experimentalmente que uma dose de 5 X 106 UFC/ml da amostra isolada de A. pleuropneumoniae sorotipo 5, denominada I200, é capaz de desenvolver severa pneumonia necro-hemorrágica três horas após a infecção, enquanto que a mesma dose da amostra isolada de A. pleuropneumoniae sorotipo 5, denominada B8, foi incapaz de causar lesões no mesmo período. Estes resultados demonstram que isolados do mesmo sorotipo podem apresentar diferença na virulência. JENSEN & BERTRAM (1986) compararam estas amostras, a de alta virulência (I200) e a de baixa virulência (B8), quanto às características morfológicas e bioquímicas. A amostra virulenta tem uma cápsula diferente, maior e aderente, enquanto que a amostra avirulenta, tem uma cápsula menor, frágil e facilmente removível. Os autores demonstraram diferenças na estrutura capsular, composição bioquímica e LPS, sugerindo que a maior quantidade e aderência da cápsula da amostra de alta virulência, somada à maior quantidade de LPS, acentuam as lesões causadas pelo A. pleuropneumoniae.
O polissacarídeo capsular é um importante componente sendo utilizado como alvo para estudos patogênicos, epidemiológicos e diagnóstico. Amostras de A. pleuropneumoniae mutantes acapsulados sorotipo 1 e 5a (acapsuladas por deleções dos genes cpsABC envolvidos na biossíntese dos polissacarídeos capsulares) foram isolados após mutagênese por ácido ethil-ester-metano-sulfônico e mostraram-se avirulentas. Estes mutantes não causaram sinais clínicos ou lesões em suínos após inoculação intratraqueal com uma dose 10 vezes maior que a DL50 da amostra não mutante. Amostras acapsuladas que produzem toxinas induzem resposta imune e podem ser usadas como vacinas vivas (INZANA et alii, 1993).
Outra amostra de A. pleuropneumoniae mutante acapsular foi obtida por RIOUX et alii (2000) usando o sistema de mutagênese por inserção com o transposon Tn10. Este mutante não reagiu com o anticorpo monoclonal contra o antígeno capsular do sorotipo 1, nem apresentou vestígios de cápsula por microscopia eletrônica e citometria de fluxo, confirmando a incapacidade de transportar os polissacarídeos capsulares para a membrana externa da bactéria. O sítio de inserção do mini-Tn10 foi determinado e sendo posicionado no gene cpxC de transporte dos polissacarídeos capsulares. Este mutante foi inoculado em suínos SPF e apresentou um padrão menos virulento sem mortalidade, comparado com a
amostra bacteriana original que apresentou-se mais virulenta com 100% de mortalidade.
PIJOAN et alii (1983) relataram que a proteção de suínos vacinados com cultura de seis horas de A. pleuropneumoniae é devida a anticorpos capsulares, pois essas culturas contém grande quantidade de material capsular, mas pouca toxina no sobrenadante. Formularam a hipótese de que o material capsular pode proteger os suínos contra uma inoculação homóloga, mas não heteróloga. Sugeriram também que anticorpos protetores não são somente induzidos pelas toxinas. Devido a isso, a imunidade celular anticapsular é descrita como sendo muito importante nessa doença. NIELSEN et alii (1976) haviam determinado que antígeno capsular de culturas mais velhas (24 horas), extraído pelo calor, não conferem proteção aos suínos. Enquanto que NIELSEN & O´CONNOR (1984) determinaram que antígenos de culturas jovens (6 horas) sorotipo específicos extraídos da mesma maneira podem proteger os suínos, demonstrando que a cápsula é componente importante e confere proteção.
INZANA et alii (1988) estudaram as propriedades de virulência do polissacarídeo capsular do A. pleuropneumoniae sorotipo 5 e sua capacidade de proteger suínos e camundongos da agressão experimental. A bactéria viva capsulada foi resistente à morte por complemento e anticorpos para antígenos somáticos, enquanto que a amostra acapsulada foi sensível à morte pela via alternativa do complemento. Camundongos foram protegidos da morte devido à inoculação intranasal com sorotipos homólogos ou heterólogos, após imunização com bactéria viva capsulada ou acapsulada. Entretanto, os animais não foram protegidos quando imunizados tanto com a bactéria morta, ou com lipopolissacarídeos ou mesmo com a vacina conjugada de proteína e cápsula. Imunização passiva com soro de suíno monoespecífico para cápsula protegeu os suínos contra infecção letal, mas não impediu o desenvolvimento de lesões hemorrágicas nos pulmões. Já os suínos imunizados passivamente com anti-soro para bactéria viva ou quando a bactéria foi pré-opsonizada por anticorpos anti-cápsula produzidos em coelhos, antes da agressão em suínos, não desenvolveram lesões respiratórias severas.
JACQUES et alii (1992) estudaram a correlação entre a quantidade de material capsular dos isolados de A. pleuropneumoniae e a afinidade pelo muco do trato respiratório do suíno. Estes pesquisadores observaram que isolados com uma
camada capsular maior ou igual a 100 nm apresenta baixa afinidade pelo muco, enquanto isolados com uma fina camada de material capsular mostram vários graus de afinidade pelo muco do trato respiratório suíno. Por outro lado, RIOUX et alii (2000) avaliaram a capacidade de aderência de uma amostra de A. pleuropneumoniae sorotipo 1 mutante acapsular e determinaram que esta apresentou 20 vezes maior quantidade de células aderidas em cortes congelados de traquéia de leitões do que a amostra original. Estes estudos confirmam que a cápsula não é responsável pela aderência, ao contrário, impede a aderência do A. pleuropneumoniae ao tecido do hospedeiro.
Amostras de A. pleuropneumoniae, pertencentes aos sorotipos de 1 a 10, foram examinadas por microscopia eletrônica para analisar a camada de material capsular. Foi verificado que todas apresentaram uma camada variável dependendo do sorotipo. A quantidade de cápsula também variou de acordo com o tempo de crescimento e o meio de cultura. Quando crescidos em meio líquido, por 6 horas, apresentaram entre 210-230 nm de camada de cápsula, enquanto que com 18 horas de crescimento a camada foi de 130-140 nm. Entretanto, quando o A. pleuropneumoniae foi crescido em meio sólido a camada visualizada foi muito menor e variou de 70-100 nm. Utilizando esta metodologia, estes pesquisadores ainda visualizaram A. pleuropneumoniae em pulmões de animais infectados e estimaram a quantidade de material capsular. Os resultados indicam que existem diferenças na estrutura capsular entre os diferentes sorotipos de A. pleuropneumoniae e isso pode explicar a diferença na virulência entre os sorotipos, já que os sorotipos mais virulentos apresentaram maior quantidade de cápsula (JACQUES et alii, 1988).
A estrutura capsular de todos os sorotipos de A. pleuropneumoniae já foi identificada por métodos de ressonância magnética nuclear e química (PERRY et alii, 1990). A cápsula bacteriana é carregada negativamente por polímeros de carboidratos altamente hidratados (INZANA, 1987) que são responsáveis pela especificidade dos sorotipos (INZANA & MATHISON, 1987). A estrutura capsular dos diferentes sorotipos pode ser classificada como segue: uma seqüência normal de unidades de açúcar ligadas glicosidicamente, que constituem as cápsulas dos sorotipos 5a, 5b e 10; polímeros tipo ácido teicóico, onde unidades de glicosil-glicitol são ligadas através de ligações fosfato- diéster, como as cápsulas dos sorotipos 2, 3, 6, 7, 8, 9, e 11 e polímeros repetidos de oligossacarídeos, também ligadas através
de fosfato, como encontrado na cápsula dos sorotipos 1, 4 e 12. As últimas são relativamente instáveis, pois ligações fosfato sofrem hidrólise levando a um produto de baixo peso molecular com subseqüente degradação (PERRY et alii, 1990). INZANA (1987), após a purificação da cápsula do A. pleuropneumoniae sorotipo 5, analisou a composição química do polímero capsular por radioimunoensaio e observou que a quantidade máxima de cápsula é obtida na fase estacionária (48 horas) de cultura em meio líquido e não de meio sólido. A composição química da cápsula foi de 85% de hexosamina, 12% de hexose, 3% de fosfato, 0,17% de proteína, 0,20% de ácido nucléico e 0,01% de endotoxina.
Para um melhor entendimento do papel da cápsula como fator de virulência em A. pleuropneumoniae, WARD & INZANA (1997) identificaram, clonaram e seqüenciaram uma região do DNA envolvida na exportação dos polímeros capsulares de A. pleuropneumoniae sorotipo 5a. Esta região é constituída de um operon, designado cpxDCBA, que codifica quatro proteínas envolvidas na exportação dos polissacarídeos através da membrana citoplasmática. CpxD é uma lipoproteína da membrana externa de 42.1 kDa envolvida no transporte do polissacarídeo capsular através da membrana. CpxC é uma proteína de 43.4 kDa, relativamente hidrofílica, periplasmática, com domínio hidrofóbico próximo ao N e C-terminal que serve como âncora e está envolvida no transporte dos polissacarídeos capsulares através da membrana citoplasmática. CpxB é uma proteína de 29.9 kDa, muito hidrofóbica com no mínimo 6 domínios α-hélice, sugerindo que pode ser uma proteína de membrana integral. CpxA é uma proteína hidrofílica de 24.6 kDa, contendo uma seqüência consenso característica de ligação de ATP. Um fragmento de 1.5 kb, correspondente a parte dos genes cpxCB, foi utilizado como sonda contra DNA total de A. pleuropneumoniae clivado com BglII. Esta sonda hibridizou com DNA dos sorotipos 1, 2, 5, 7 e 9 de A. pleuropneumoniae indicando que esta região do DNA é bastante conservada.
WARD et alii (1998) identificaram, clonaram e seqüenciaram os genes envolvidos na biossíntese da cápsula (cps) do sorotipo 5. Quatro open reading frame (ORFs) constituem os genes cps denominados cpsD, cpsC, cpsB e cpsA. Este operon apresenta a característica de ser sorotipo-específico e está localizado adjacente (upstream) ao gene cpxD do operon cpxDCBA que codifica as proteínas responsáveis pelo transporte dos polissacarídeos capsulares. Entretanto, a função de cada gene não foi determinada. Um mutante incapaz de produzir polissacarídeo
