Vários estudos vêm sendo desenvolvidos com o intuito de avaliar as atividades enzimáticas e biológicas da peçonha de P. olfersii. Rocha e Furtado (2007) analisaram o teor de proteínas presente na peçonha de P. olfersii e verificou-se um teor proteico na ordem de 75% verificou-semelhante ao valor apreverificou-sentado por Lopes (2008) para a serpente do mesmo gênero P. patagoniensis, no entanto um resultado diferente do valor apresentado por Nery (2012) para a serpente também do mesmo gênero P. nattereri, com valores na ordem de 80 a 86%. Os estudos de Assakura et al. (1992) demonstraram que a peçonha apresenta atividades hemorrágicas, fibrinolíticas, edematogenicas, com atividades proteolíticas sobre a caseína, baixa atividade esterásica, ausência de enzimas pró-trombinas, atividade pró-coagulante ou atividade na agregação plaquetária, indicando que a peçonha de P. olfersii apresenta atividade proteolítica.
O envenenamento é caracterizado por um estado inflamatório generalizado. A reação normal do organismo ao envenenamento envolve a ativação de uma série de complexas cascatas imunológicas, que atua garantindo uma pronta resposta protetora ao veneno. É de notório saber a importância de uma relação equilibrada entre citocinas pró e anti-inflamatórias para uma resposta imune adequada. Embora a ativação do sistema imunológico durante o envenenamento seja geralmente uma resposta protetora, o choque séptico acaba por se desenvolver em alguns pacientes em decorrência de uma resposta imune excessiva ou mal regulada podendo levar a complicações durante o quadro de envenenamento.
Com base na análise do leucograma realizado no presente estudo, observou-se uma queda significativa (p<0,05) na contagem de leucócitos totais, caracterizando um quadro de leucopenia, onde o menor valor foi observado na dose de 30ug de peçonha de P. olfersii. Diferentemente de nossos resultados, no estudo de Yamashita (2013) foi verificado um aumento na contagem de leucócitos totais, 3 e 6 horas após a administração intravenosa da peçonha de B. jararaca. Segundo Stock e Hoffman (2000) a leucopenia é a diminuição global no número de glóbulos brancos, e é mais frequentemente causada pela redução de neutrófilos (1º tipo mais comum de leucócito) e depois pela redução de linfócitos (2º tipo mais comum de leucócito). Assim, a leucopenia, observada em nosso trabalho, com a dose de 30ug de peçonha pode ser atribuída à diminuição dos níveis séricos de linfócitos, ao invés
dos neutrófilos, uma vez que observamos uma queda no número de linfócitos e não de neutrófilos.
Em nosso estudo observou-se uma redução estatisticamente significativa (p<0,05) na contagem plaquetária em todos os grupos experimentais, inoculados com doses de 10µg, 30µg e 60µg de peçonha de P. olfersii, quando comparado ao controle, caracterizando um intenso quadro de plaquetopenia, de maneira semelhante ao observado no estudo de Yamashita (2013) onde o hemograma também mostrou uma importante redução na contagem plaquetária em ratos inoculados com peçonha de B. jararaca.
Em relação à contagem de basófilos no sangue de camundongos injetados com peçonha de P. olfersii verificou-se que houve um aumento estatisticamente significativo (p<0,05) na contagem dessas células na dose de 10µg de peçonha em relação ao grupo controle e as demais doses de 30µg e 60µg de peçonha. Esse aumento significativo na contagem de basófilos na dose de 10µg de peçonha parece ocorrer de maneira correlacionada ao aumento, também significativo, do infiltrado inflamatório presente no músculo gastrocnêmio dos camundongos inoculados com essa mesma dose de peçonha (resultado obtido através da análise histológica semiquantitativa para o parâmetro infiltrado inflamatório), uma vez que, segundo Cruvinel et al. (2010) os basófilos liberam mediadores que são capazes de promover um aumento da permeabilidade vascular e induzir a migração de células inflamatórias (neutrófilos e macrófagos). Porém a relação destes resultados, aumento da contagem de basófilos no sangue e o aumento do infiltrado inflamatório no tecido muscular ambos na dose de 10µg de peçonha, é uma questão que requer estudos futuros.
Houve um aumento significativo nos níveis séricos de monócitos (p<0,05) 6 horas após a inoculação da peçonha de P. olfersii, com o maior valor observado na dose de 30µg de peçonha. Este resultado é semelhante aos resultados obtidos por Santos et al. (2003) com peçonha de B. alternatus, onde verificou-se um aumento do número destas células.
Os valores hematológicos de contagem de eritrócitos, hemoglobina, hematócrito e dos índices hematimétricos (VCM, HCM e CHCM) 6 horas após a inoculação da peçonha de P. olfersii não apresentaram variações estatisticamente significativas (p>0,05), assim como foi verificado por Yamashita (2013) em seus estudos com peçonha de B. jararaca.
A peçonha de P. olfersii provocou uma resposta leucocitária inflamatória em camundongos, caracterizada por leucopenia por linfopenia, com aumento dos níveis séricos de neutrófilos (neutrofilia), monócitos (monocitose) e basófilos (basofilia), sem alterações estatisticamente significativas no número total de eritrócitos, concentração de hemoglobina e hematócrito, diferentemente dos resultados observados por Santos et al. (2003) para a ação da peçonha de B. alternatus em cães, onde ocorreu leucocitose por neutrofilia, redução do número total de eritrócitos, concentração de hemoglobina e hematócrito, porém assemelhando-se aos seus estudos em relação a queda de linfócitos, onde ambas as peçonhas, P.
olfersii e B. alternatus, causaram um quadro de linfopenia.
Wanderley et al. (2014) observaram um aumento progressivo de áreas de edema, hemorragia e infiltrado inflamatório, com predomínio de neutrófilos, entre 0.5 – 4.5 horas após a administração da peçonha de B. jararacussu. Os resultados aqui apresentados,6 horas após a administração da peçonha, também mostraram um predomínio de neutrófilos no infiltrado inflamatório presente no tecido muscular, músculo gastrocnêmio de camundongos injetados com diferentes doses da peçonha de P. olfersii, bem como o aumento dos níveis séricos de neutrófilos, onde seus níveis mais elevados foram observados na dose de 30µg de peçonha. Segundo Leech (1997) ocorre um significante aumento no número de neutrófilos no período de uma a seis horas após a lesão, acontecimento que condiz com os resultados aqui apresentados.
Os resultados deste estudo, com base em análises histológicas, demonstraram a presença de leucócitos no tecido muscular, músculo gastrocnêmio de camundongo, após a administração da peçonha de P. olfersii de maneira similar ao que foi descrito por Lomonte et al. (1994) em seu estudo com peçonha de Bothrops asper, bem como no estudo de Flores et al. (1993), onde descreveu-se a migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal de ratos, após a administração das peçonhas de B. erytromelas e B. alternatus e no músculo gastrocnêmio, após a administração de peçonha de B. jararaca da Argentina, segundo os estudos de Acosta de Pérez et al. (1996).
A quimiocina KC pertence à classe CXC e é seletiva para o recrutamento de leucócitos polimorfonucleares, principalmente neutrófilos, porém de acordo com Zhang et al. (2001) seu mecanismo de ação no recrutamento de neutrófilos circulantes ainda não estão completamente esclarecidos, mas sabe-se que este
mediador induz um aumento de leucócitos em fase de rolamento, de adesão e de transmigração, de modo dependente da expressão de P-selectina. Wengner et al.
(2008) demonstraram em seus estudos que a KC participa da quimiotaxia de neutrófilos, via ativação do receptor CXCR2, expresso nessas células, acarretando em um aumento do número desse tipo celular na circulação periférica, o que pode explicar o aumento dos níveis séricos de neutrófilos dos camundongos que receberam a dose de 30µg de peçonha de P. olfersii.
Outro importante quimioatraente de neutrófilos em camundongos é a proteína inflamatória de macrófagos tipo 2 (MIP-2) e assim como a quimiocina KC também apresenta potente atividade quimiotática tanto em modelos experimentais in vivo como in vitro. Os estudos de Knott et al. (2001) demonstraram a participação dessa quimiocina na modulação do recrutamento de neutrófilos após desafio antigênico.
Em nosso estudo não foi possível observar variação significativa, após um período de 6 horas, nos níveis séricos da quimiocina MIP-2 em nenhuma das doses (10µg, 30µg e 60µg) de peçonha de P. olfersii administradas nos camundongos, embora a maior quantidade tenha sido também no grupo da dose de 30µg de peçonha.
Estudos anteriores tem demonstrado a participação das citocinas no desenvolvimento do processo inflamatório induzido pela administração da peçonha de serpentes. Os resultados obtidos no presente estudo indicam que após um período de 6 horas não foi possível detectar nenhuma diferença estatisticamente significativa (p>0,05) nos níveis séricos das citocinas IL-1β, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, IFN-γ e TNF em nenhuma das três doses administradas da peçonha de P. olfersii (10µg,30µg e 60µg/peçonha). No entanto, foi possível observar que existiu uma tendência a um aumento dos níveis séricos de TNF.
Petricevich et al. (2000) observaram um aumento nos níveis séricos de várias citocinas em camundongos injetados por via intraperitonial com a dose média letal (LD50) das peçonhas de B. asper e B. jararaca, onde ambas as peçonhas induziram um proeminente aumento nos níveis séricos de TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 e IFN-γ.
De acordo com a literatura, fatores de crescimento como o IGF-1 atuam como reguladores positivos no controle e ativação das células satélites, que encontram-se presentes entre a lâmina basal e a membrana plasmática da fibra muscular, e que são indispensáveis no processo de regeneração muscular.
Takahashi et al. (2003) em seus estudos demonstraram que o IGF-1 promoveu regeneração muscular após transferência do mesmo por eletroporação em músculos
lesionados experimentalmente de camundongos. No estudo de Lopes (2008) foi observado que a partir da 6ª hora após a inoculação da peçonha de P.
patagoniensis, iniciou-se um processo de regressão das lesões mionecróticas e uma leve regeneração das fibras, mostrando em 24 horas fibras normais circundadas por infiltrado inflamatório. Os resultados obtidos no presente estudo, com o aumento no nível sérico de IGF-1 dos camundongos injetados com a dose de 60µg de peçonha de P. olfersii demonstrando assim uma variação extremamente significativa (p<0,001) em relação ao grupo controle e aos grupos que receberam as doses de 10µg e 30µg de peçonha, após um período de 6 horas da inoculação, tendem a ir de encontro com essas informações, uma vez que a dose de 60µg foi a única que induziu um aumento significativo (p<0,05) na degeneração muscular.
Após a administração de diferentes doses da peçonha de P. olfersii, foi observado através da análise semiquantitativa que o grau de edema e degeneração muscular foram maiores na dose de 60µg. O infiltrado inflamatório se mostrou mais elevado na dose de 10µg de peçonha, quando comparado ao grupo controle e as diferentes doses de 30µg e 60µg de peçonha.
Com relação à análise quantitativa do infiltrado inflamatório presente no tecido muscular (m. gastrocnêmio) 6 horas após a inoculação da peçonha de P. olfersii, verificou-se uma diferença estatisticamente significativa (p<0,05) para a densidade de leucócitos polimorfonucleares nas doses de 30µg e 60µg de peçonha em relação ao grupo controle, em contra partida, não houve diferença estatisticamente significativa (p>0,05) na densidade de leucócitos mononucleares.
No presente estudo, a análise histológica demonstrou alterações teciduais como edema, infiltrado inflamatório, desorganização fibrilar e mionecrose. Esses resultados são em parte semelhantes a Lopes (2008) com peçonha de P.
patagoniensis, porém diferentemente do que foi observado por Lopes (2008), em nosso estudo não foi possível observar a presença de hemorragia no tecido muscular após 6 horas da inoculação das doses de 10µg,30µg e 60µg de peçonha de P. olfersii. De acordo com Rocha e Furtado (2007) a peçonha produzida pela glândula de Duvernoy da serpente P. olfersii apresenta alta atividade hemorrágica, com um pico de atividade de duas a quatro horas após a inoculação, o que pode explicar a não observância de alterações hemorrágicas no tecido muscular 6 horas após a inoculação da peçonha nas doses de 30µg e 60µg, umas vez que as
mesmas são doses maiores do que a dose mínima estabelecida para sangramento de 24µg/camundongo da peçonha de P. olfersii.
Após 6 horas da inoculação da peçonha de P. olfersii foi possível observar lesões mionecroticas em todas as doses inoculadas (10µg,30µg e 60µg de peçonha) assemelhando-se ao estudo de Lopes (2008) onde verificou-se que o aparecimento de lesões mionecroticas se deu a partir da dose de 10µg de peçonha de P.
patagoniensis e que o início do processo de mionecrose ocorreu em um período de 30 minutos após a inoculação da peçonha.
Segundo Prado-Franceschi et al.(1981) a peçonha de Philodryas spp.
apresenta alta atividade proteolítica, superando até mesmo as peçonhas de Bothrops alternatus e B. jararaca, o que parece ser um fator determinante, resultando em extensas mionecroses, aumentando de intensidade ao longo do tempo. Foi proposto por Rocha e Furtado (2007) uma dose necrosante mínima para P. olfersii de 79.1µg/camundongo de peçonha, no entanto, de acordo com resultado obtido no presente estudo verificamos o desenvolvimento de processo mionecrotico a partir da dose de 10µg de peçonha de P. olfersii. Esta necrose é provavelmente causada pelas enzimas proteolíticas presentes na peçonha e que degradam a matriz extracelular dos tecidos. Isso pode ser visto de maneira mais proeminente nos arredores do músculo gastrocnêmio inoculado com peçonha, onde é possível se observar degradação das miofibrilas, danificando e inibindo as contrações musculares (PRADO-FRANCESCHI et al.,1998).