JULIANA SANTOS OLIVEIRA
EFEITOS LOCAIS E HEMATOLÓGICOS INDUZIDOS PELA PEÇONHA DE Philodryas olfersii (LICHTENSTEIN,1823) (SERPENTES, DIPSADIDAE) EM
CAMUNDONGOS
São José dos Campos, SP 2016
Efeitos locais e hematológicos induzidos pela peçonha de Philodryas olfersii (Lichtenstein,1823) (serpentes, dipsadidae) em camundongos
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade do Vale do Paraíba, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.
Orientador: Profª. Dra. Luciana Barros Sant’Anna
São José dos Campos, SP 2016
EFEITOS LOCAIS E HEMATOLÓGICOS INDUZIDOS PELA PEÇONHA DE Philodryas olfersii (LICHTENSTEIN,1823) (SERPENTES, DIPSADIDAE) EM
CAMUNDONGOS
Dissertação aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas, do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte banca examinadora:
Profa. Dra. Luciana Barros Sant’Anna (Univap)__________________________
Profa. Dra. Nádia M.R de Campos Velho(Univap) _______________________
Prof. Dr. Elbio Leiguez Junior (Instituto Butantan) _______________________
São José dos Campos, SP 2016
Por fim, mais uma etapa vivida!
Agradeço a Deus por ter me dado saúde e força para superar as dificuldades.
É difícil agradecer todas as pessoas que de algum modo, nos momentos serenos e ou apreensivos, fizeram ou fazem parte da minha vida, por isso primeiramente agradeço à todos de coração.
Aos meus pais e minha irmã, pelo amor, incentivo, paciência e apoio incondicional.
A minha orientadora Profa. Dra. Luciana Barros Sant’Anna, pelo suporte no pouco tempo que lhe coube, pelas suas correções e incentivos.
A todos os professores do curso, que foram tão importantes na minha vida acadêmica, em especial ao Dr. José Carlos Cogo (Unicastelo), Dr. Wellington Ribeiro (Univap) e Stephen Hyslop (Unicamp), responsáveis pela realização deste trabalho.
Ao Dr. Rodolfo de Paula Vieira, Dra. Pamella Ramona Moraes Souza, Me.
Manoel Carneiro de Oliveira Junior e Me. Adilson Santos Andrade Sousa, da Universidade Nove de Julho, por todo o tempo que dedicaram a me ajudar durante o desenvolvimento deste trabalho, tornando possível a sua realização.
Aos amigos e colegas de pesquisa, pelo incentivo e apoio constante.
E a todos que direta ou indiretamente fizeram parte da minha formação, o meu muito obrigado.
“O que eu faço, é uma gota no meio de um oceano. Mas sem ela, o oceano será menor.” (Madre Teresa de Calcutá)
RESUMO
Apesar da maioria dos registros existentes não declararem sérias consequências nos acidentes causados por serpentes opistóglifas, muitos relatos ressaltam a importância das toxinas presentes nessas peçonhas. Acidentes ocasionados por serpentes da espécie Philodryas olfersii podem resultar em manifestações locais como dor, eritema, edema, inflamação e equimoses, podendo ou não apresentar sintomas de ordem sistêmica. Este trabalho tem como objetivo examinar o potencial inflamatório de diferentes doses (10µg, 30µg e 60µg) da peçonha de P. olfersii, analisando os efeitos locais, em músculo gastrocnêmio de camundongos, por meio da quantificação do infiltrado inflamatório presente no tecido muscular, e os efeitos hematológicos, por meio da determinação dos diferentes tipos celulares (leucócitos totais, plaquetas, neutrófilos, monócitos, linfócitos e basófilos), e das citocinas envolvidas no desenvolvimento do processo inflamatório (IL-1β, IL-6, IL-10, IL-13, IL- 17, TNF-α, IFN-γ, MIP 2, KC e IGF-1). Observaram-se quadros significativos de leucopenia, plaquetopenia, neutrofilia e monocitose na dose de 30µg de peçonha.
Com relação à quantificação de linfócitos, observou-se um quadro de linfopenia nos grupos experimentais que receberam as doses de 30µg e 60µg de peçonha, sendo o menor valor encontrado na dose de 30µg. Quanto a dosagem de basófilos houve um aumento significativo de seus valores (basofilia) no grupo experimental que recebeu a dose de 10µg de peçonha, quando comparado aos grupos controle (PBS), e aqueles que receberam as doses de 30µg e 60µg de peçonha. Houve um aumento significativo na liberação de IGF-1, sendo o maior valor observado na dose de 60µg de peçonha. Com relação às interleucinas IL-1β, IL-6, IL-10, IL-13 e IL-17 não foram observadas diferenças significativas, assim como nas dosagens de proteína inflamatória de macrófagos tipo 2 (MIP 2), interferon gama (IFN-γ) e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α).
Palavras-chave: Philodryas olfersii; Inflamação Aguda; Citocinas; Edema;
Mionecrose; Infiltrado Inflamatório.
Abstract
In spite of most existing records not declared serious consequences in accidents caused by opisthoglyphous snakes, many reports emphasize the importance of the toxins present in these venoms. Accidents caused by snakes of Philodryas olfersii species can result in local events such as pain, erythema, swelling, inflammation and bruising, and may or may not show symptoms of systemic order. This work aims to examine the inflammatory potential of different doses (10µg, 30µg and 60µg) of the venom of P. olfersii, analyzing the local effects in gastrocnemius muscle, by means of semiquantitative parameters histological analysis, such as: inflammatory infiltrate, edema and muscle degeneration; quantification of polymorphonuclear and mononuclear inflammatory cells of the inflammatory infiltrate present in muscle tissue; hematological effects by means of different cell types (dosing total leukocytes , platelets, neutrophils, monocytes, lymphocytes and basophils) and cytokines involved in the inflammatory process development (IL-1 β, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, TNF-α, IFN-γ, MIP 2, KC and IGF-1). It was observed significant (p<0.05) leukopenia, thrombocytopenia, neutrophilia, lymphopenia, and basophilia monocytosis.
Semiquantitative histological analysis demonstrated significant differences (p<0.05) in edema, inflammatory infiltrate and muscle degeneration, and quantitative analysis showed significant variation (p<0.05) in inflammatory polymorphonuclear cell density.
There was a significant increase in the release of IGF-1, being the highest value observed in the dose of 60μg of venom. Regarding the interleukins IL-1 β, IL-6, IL-10, IL-13 and IL-17 were not possible to observe significant differences (p>0.05) in their serum levels, as well as the dosages of macrophage inflammatory protein 2 type (MIP 2), interferon gamma (IFN-γ) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α).
Keywords: Philodryas olfersii; Acute Inflammation; Cytokines; Edema; Myonecrosis;
Infiltrate Inflamatory.
Figura 1- Quadro com as características biológicas das principais serpentes brasileiras com importância médica ... 18 Figura 2- Esquema ilustrativo mostrando a glândula supralabial (GSL) e a glândula de Durvenoy (GD) de um colubrídeo opistóglifo ... 19 Figura 3- Esquema ilustrativo mostrando os quatro tipos de dentição encontrados nas serpentes ... 20 Figura 4- Serpente pertencente a espécie Philodryas olfersii (cobra-verde). ... 22 Figura 5- Philodryas olfersii predando um passeriforme em Caçapava-SP. .... 23 Figura 6- Quadro ilustrativo mostrando os principais componentes da peçonha de serpentes ... 25 Figura 7- Envenenamento causado por uma serpente da espécie Philodryas ofersii, atendido no Hospital da Restauração do Recife, Pernambuco ... 27 Figura 8- Esquema simplificado dos eventos que ocorrem durante o processo inflamatório ... 37 Figura 9- Esquema simplificado sobre a origem e função das citocinas IL-1, IL- 6, IL-10, IL-13, IL-17, TNF, KC, MIP 2, IFN-γ e IGF-1...46 Figura 10- Armazenamento dos grupos experimentais ... 48 Figura 11: Esquema simplificado dos testes enzimáticos ELISA para dosagem das citocinas plasmáticas IL-1β, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, TNF-α, IFN-γ, MIP 2, KC e IGF-1...50 Figura 12: Identificação e preparação das amostras para criotomia utilizando Criostato Leica DM1250...52 Figura 13: Análise dos parâmetros hematológicos: contagem de células vermelhas do sangue, hemoglobina, hematócrito, volume corpuscular médio, hemoglobina corpuscular média e concentração de hemoglobina corpuscular média, no sangue de camundongos C57BL/6, machos, pesando entre 18 e 22g, injetados via i.m (músc.gastrocnêmio esquerdo) com solução PBS (grupo controle) e diferentes doses da peçonha de serpente P. olfersii (grupos experimentais), 6 horas após a administração da peçonha. Dados expressos como média e desvio padrão (n=10 animais/grupo). *Os níveis de significância foram ajustados para 5% (p<0.05). ... 54 Figura 14: Contagem de leucócitos e plaquetas no sangue de camundongos C57BL/6, machos, pesando entre 18 e 22g, injetados via i.m (músc.gastrocnêmio esquerdo) com solução PBS (grupo controle) e diferentes doses da peçonha de serpente P. olfersii (grupos experimentais), 6 horas após a administração da peçonha. Dados expressos como média e desvio padrão (n=10 animais/grupo). *Os níveis de significância foram ajustados para 5%
(p<0.05). ... 54
doses da peçonha de serpente P. olfersii (grupos experimentais), 6 horas após a administração da peçonha. Dados expressos como média e desvio padrão (n=10 animais/grupo). *Os níveis de significância foram ajustados para 5%
(p<0.05). ... 55 Figura 16: Dosagem de linfócitos no sangue de camundongos C57BL/6, machos, pesando entre 18 e 22g, injetados via i.m (músc.gastrocnêmio esquerdo) com solução PBS (grupo controle) e diferentes doses da peçonha de serpente P. olfersii (grupos experimentais), 6 horas após a administração da peçonha. Dados expressos como média e desvio padrão (n=10 animais/grupo). *Os níveis de significância foram ajustados para 5% (p<0.05). ...56 Figura 17: Níveis de IGF-1 e KC no soro de camundongos C57BL/6, machos, pesando entre 18 e 22g, injetados via i.m (músc.gastrocnêmio esquerdo) com solução PBS (grupo controle) e diferentes doses da peçonha de serpente P.
olfersii (grupos experimentais), 6 horas após a administração da peçonha.
Dados expressos como média e desvio padrão (n=10 animais/grupo). *Os níveis de significância foram ajustados para 5% (p<0.05). ... 56 Figura 18: Níveis de MIP-2 e IFN-γ no soro de camundongos C57BL/6, machos, pesando entre 18 e 22g, injetados via i.m (músc.gastrocnêmio esquerdo) com solução PBS (grupo controle) e diferentes doses da peçonha de serpente P. olfersii (grupos experimentais), 6 horas após a administração da peçonha. Dados expressos como média e desvio padrão (n=10 animais/grupo). *Os níveis de significância foram ajustados para 5% (p<0.05). ...57 Figura 19: Níveis de TNF, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-13 e IL-17 no soro de camundongos C57BL/6, machos, pesando entre 18 e 22g, injetados via i.m (músc.gastrocnêmio esquerdo) com solução PBS (grupo controle) e diferentes doses da peçonha de serpente P. olfersii (grupos experimentais), 6 horas após a administração da peçonha. Dados expressos como média e desvio padrão (n=10 animais/grupo). *Os níveis de significância foram ajustados para 5%
(p<0.05). ... 58 Figura 20 - Análise histológica do músculo gastrocnêmio de camundongos nos grupos experimentais controle (A, E, I), 10ug de peçonha (B, F, J), 30ug de peçonha (C, G, L), e 60ug de peçonha (D, H, M). (asterisco) área de edema;
(triângulo) área de infiltrado inflamatório; (seta) regiões com degeneração das fibras musculares, 6 horas após a administração da peçonha. H/E, 400x. ... 60 Figura 21: Análise semiquantitativa do edema, infiltrado inflamatório e degeneração muscular, no tecido muscular do m. gastrocnêmio esquerdo após a injeção solução PBS (grupo controle) e diferentes doses da peçonha de serpente P. olfersii (grupos experimentais), 6 horas após a administração da peçonha, mediante a aplicação do sistema de score, da seguinte forma: score 0 - ausência; score 1 – leve; escore 2-moderado; escore 3 -intenso; score 4 – muito intenso. Dados expressos como mediana e interquartis (n=5 animais/grupo). *Os níveis de significância foram ajustados para 5% (p<0.05) ...61
serpente P. olfersii (grupos experimentais), 6 horas após a administração da peçonha. Dados expressos como média e desvio padrão (n=10 animais/grupo). *Os níveis de significância foram ajustados para 5% (p<0.05) ...62
ACTH- Hormônio Adrenocorticotrófico ANOVA- Análise de Variância
CEN - Centro de Estudos da Natureza
CEUA- Comissão de Ética no Uso de Animais CFs's- Fator Estimulador de Colônias
CD4 - Grupamento de Diferenciação 4 CD8a-Grupamento de Diferenciação 8 alfa
CHMC- Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média CINC-1 - Quimioatraente-1 de Neutrófilos Indutor de Citocina CK- Creatinoquinase
CRH- Hormônio Liberador de Corticotrofina
CXC- Subfamília das quimiocinas, onde X= aminoácido e C= cisteína
CXC-ELR+ - Subfamília das quimiocinas com primeira cisteína precedida pelo tripéptido Glu-Leu-Arg (ELR)
ELISA- Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay TGFβ-Fator Transformador de Crescimento β GH - Hormônio de Crescimento
GD - Glândula de Durvenoy
GM-CSF - Fator Estimulador de Monócitos e Granulócitos GSL- Glândula Supralabial
GRO- Regulador de Crescimento Oncogênico HCM-Hemoglobina Corpuscular Média
HRP- Enzima Horseradish Peroxidase IFN-α - Interferon Alfa
IFN-γ - Interferon Gama IgE- Imunoglobina E
IGFBP- Proteína Ligadora dos Fatores de Crescimento Insulin-like IGF-1 - Fator de Crescimento Insulin-like 1
IgG1- Imunoglobina G1 IgG4 - Imunoglobina G4 IL- Interleucina
IL-1- Interleucina 1 IL-1α- Interleucina 1 Alfa IL-1β - Interleucina 1 Beta IL-4 - Interleucina 4
IL-5 - Interleucina 5 IL-6- Interleucina 6 IL-8- Interleucina 8 Il-10- Interleucina 10
IL-17- Interleucina 17 IL-18 - Interleucina 18 i.m- Intramuscular i.p- Intraperitonial
IRA- Insuficiência Renal Aguda KC - Quimiocina para Neutrófilos LPS- Lipopolissacarídeo
MCV- Volume Corpuscular Médio
MHC- Complexo Maior de Histocompatibilidade NK- Células natural killer
PAF - Fator de Agregação Plaquetária PBS- Tampão Fosfato-Salino
PGF2α- Prostaglandina 2a PLA2- Fosfolipase 2
P. olfersii - Philodryas olfersii
P. patagoniensis- Philodryas patagoniensis
RBC - Contagem de Células Vermelhas do Sangue sFNTRs-Receptores Solúveis de TNF
SMA- Secretaria do Meio Ambiente sp. - Abreviatura ientifica para espécie Th0- Células T helper 0
Th1-Células T helper 1 Th2- Células T helper 2
TMB- Solução de Tetrametilbenzidina TNF- Fator de Necrose Tumoral
TNF-α - Fator de Necrose Tumoral Alfa TNF-β - Fator de Necrose Tumoral Beta Univap- Universidade do Vale do Paraíba WBC-Contagem de Células Brancas do Sangue α- Alfa
β- Beta γ- Gama
1 INTRODUÇÃO ... 16
2 OBJETIVOS ... 16
2.1 Objetivo geral ... 17
2.2 Objetivos específicos ... 17
3 REVISÃO DE LITERATURA ... 17
3.1 As serpentes brasileiras ... 18
3.2 Philodryas olfersii ... 20
3.3 Efeitos biológicos da peçonha de Philodryas olfersii ... 24
3.4 Epidemiologia ... 29
3.5 Atividades das peçonhas de serpentes ... 30
3.5.1 Atividade proteolítica ... 30
3.5.2 Atividade miotóxica ... 30
3.5.3 Atividade hemorrágica ... 31
3.5.4 Atividade inflamatória ... 31
3.6.5 Atividade sobre plaquetas e coagulação ... 32
3.5.6 Atividade cardiovascular ... 32
3.6 Importância dos estudos sobre a peçonha e toxinas de serpentes ... 24
3.7 O sistema muscular ... 33
3.7.1 Regeneração muscular ... 34
3.8 Reação inflamatória ... 35
3.8.1 Migração leucocitária ... 37
3.9 Citocinas... 38
3.9.1 Interleucina- 1 (IL-1) ... 39
3.9.2 Interleucina-6 (IL-6) ... 40
3.9.3 Interleucina-10 (IL-10) ... 41
3.9.4 Interleucina-13 (IL-13) ... 41
3.9.5 Interleucina-17 (IL-17) ... 42
3.9.6 Fator de necrose tumoral (TNF) ... 42
3.9.7 Interferon gama (IFN-γ) ... 43
3.9.8 Proteína inflamatória de macrófagos tipo 2 (MIP 2) e Quimiocina para neutrófilo (KC) ... 43
4.1 Local de realização dos experimentos ... 46
4.2 Animais ... 46
4.3 Extração e administração da peçonha ... 47
4.4 Eutanásia e coleta das amostras biológicas ... 47
4.5 Análises hematológicas ... 48
4.6 Dosagens de citocinas ... 48
4.7 Análises histológicas e densidade de células inflamatórias polimorfonucleares e mononucleares no tecido muscular ... 49
4.8 Análises Estatísticas ... 51
5 Resultados ... 51
5.1 Análise hematológica ... 52
5.2 Dosagem de citocinas ... 55
5.3 Análises Histológicas ... 58
5.4 Análise quantitativa das células polimorfonucleares e mononucleares no tecido muscular ... 60
6 Discussão ... 62
7 Conclusões ... 68 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... Erro! Indicador não definido.
1 INTRODUÇÃO
Entende-se por acidentes ofídicos todo acidente ocasionado por picadas de serpentes, sejam elas peçonhentas ou não, apresentando-se como um importante problema de saúde pública no Brasil e integrada ao grupo de doenças negligenciadas segundo a lista da Organização Mundial da Saúde (OMS).
Dentre os dados epidemiológicos analisados pel ocasionados por serpentes, representando uma taxa de incidência de 13,4 casos para cada 100.000 habitantes), com evolução do quadro clínico para 120 óbitos (taxa de letalidade de 0,44%). Adicionalmente, Nery et al. (2012) relatam que a intensidade dos sintomas após o envenenamento está diretamente relacionada com a quantidade de peçonha que foi inoculada, que por sua vez está relacionada com o tamanho, idade e tempo de alimentação da serpente. Entretanto o número de acidentes pode ser ainda maior uma vez que algumas serpentes peçonhentas não são reconhecidas como tal devido à localização anatômica de suas presas inoculadoras, como ocorre no caso das serpentes opistóglifas pertencentes ao gênero Philodryas.
Ainda que uma parcela dos acidentes ofídicos ocasionados por serpentes opistóglifas não evolua para um quadro clinico patológico de maior gravidade, como ocorre nos acidentes causados por viperídeos e elapídeos, diversas pesquisas destacam a importância das toxinas presentes em suas peçonhas, e a necessidade do maior conhecimento da ação destas toxinas, para novas técnicas de diagnóstico e tratamentos alternativos ao envenenamento
A presente pesquisa dissertará acerca dos efeitos locais e hematológicos promovidos pela peçonha da serpente Philodryas olfersii, visando caracterizar sua atividade biológica em vista dos diversos acidentes reportados ocasionados por esta espécie, inclusive a ocorrência de óbito em criança no estado do Rio Grande do Sul, após ser mordida por um espécime de P. olfersii.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar os efeitos locais, em músculo esquelético (gastrocnêmio), e hematológicos promovidos por diferentes doses da peçonha de Philodryas olfersii em camundongos.
2.2 Objetivos específicos
- Avaliar as alterações hematológicas com base na análise dos seguintes parâmetros: células vermelhas do sangue (RBC), hemoglobina (HGB), hematócrito (HCT), volume corpuscular médio (MCV), hemoglobina corpuscular média (HCM), concentração de hemoglobina corpuscular média (CHMC), contagem de células brancas do sangue (WBC), neutrófilos, linfócitos, monócitos, basófilos e plaquetas (PLT);
- Analisar o perfil das citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6, IL-17, TNF, IFN-γ, MIP 2, KC e IGF-1) e anti-inflamatórias (IL-10, IL-13);
- Avaliar histologicamente as alterações no tecido muscular por meio da análise semiquantitativa do edema, infiltrado inflamatório e degeneração das fibras musculares;
- Avaliar quantitativamente os diferentes tipos celulares (polimorfonucleares e mononucleares) no tecido muscular.
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 As serpentes brasileiras
O Brasil apresenta uma das mais ricas faunas de serpentes do Planeta e catalogadas 386 espécies, segundo a Sociedade Brasileira de Herpetologia, pertencentes atualmente a dez famílias: Aniliidae, Anomalepididae, Boidae, Colubridae, Dipsadidae, Elapidae, Leptotyphlopidae, Tropidophiidae, Typhlopidae e Viperidae (BÉRNILS; COSTA, 2012). Na figura 1 podemos ver as principais características biológicas e representantes de serpentes brasileiras consideradas de importância médica:
Fonte: Modificado de Araújo (2003).
As serpentes da família Colubridae compreendem cerca de 65% de todas as serpentes existentes no mundo, adquirindo o status de maior grupo de serpentes viventes, com mais de 1700 espécies escritas e habitando todos os continentes
Figura 1: Quadro com as características biológicas das principais serpentes brasileiras com importância médica.
Phil
exceto o Antártico (ROCHA; FURTADO, 2007; XAVIER; QUINTELA, 2007). Os colubrídeos ocorrem em todos os ambientes e substratos, com exceção do ambiente marinho (XAVIER; QUINTELA, 2007). No Brasil são registradas 304 espécies, correspondendo a 78,8% das espécies de serpentes ocorrentes no país (BÉRNILS;
COSTA, 2012). Estudos filogenéticos recentes dividiram os colubrídeos em duas famílias distintas: Colubridae e Dipsadidae (ZAER et al,2009).
De 30 a 40% dos colubrídeos apresentam glândula de Duvernoy (Figura 2), estrutura homóloga as verdadeiras glândulas de peçonhas das serpentes proteróglifas e solenóglifas (KOCHVA, 1963; OVADIA, 1984), responsáveis por produzir secreções que consistem de enzimas, várias toxinas e outros compostos (MACKESSY, 2002; FRY et al., 2003).
Fonte: Serapicos e Merusse (2006).
McDowell (1986) considera que a glândula de peçonha é homóloga a glândula rictal, que estaria relacionada indiretamente com a glândula de Duvernoy, apresentando ligamentos musculares semelhantes ao músculo compressor presente na glândula de peçonha dos elapídeos. Além disso, Atractaspis sp .apresenta glândula de peçonha e glândula de Duvernoy, fato que inviabiliza a hipótese de serem glândulas homólogas (SERAPICOS; MERUSSE, 2006). Ambas as glândulas, tanto a glândula de peçonha como a glândula de Duvernoy, fazem parte do sistema alimentar das serpentes, envolvidas primariamente com o seu comportamento predatório (KARDONG, 2002).
Das dez famílias de serpentes existentes no Brasil apenas duas famílias se destacaram ao longo dos anos por conterem serpentes peçonhentas causadoras dos maiores números de acidentes registrados, são elas: a família Viperidae,
Figura 2: Esquema ilustrativo mostrando a glândula supralabial (GSL) e a glândula de Durvenoy (GD) de um colubrídeo opistóglifo.
possuindo dentição (Figura 3) do tipo solenóglifa (grego soleno, móvel, e glifos, canal), destacando-se os gêneros Crotalus (cascavéis sul americanas), as Bothrops (jararacas) e as Lachesis (surucucus) e a família Elapidae, possuindo dentição do tipo proteróglifa (do grego protero, anterior, e glifos, canal), sendo que no Brasil o gênero responsável pelos acidentes é o gênero Micrurus (corais verdadeiras) (BARBOSA, 2003, BARRAVIEIRA et al., 1995, BUCARETCHI et al., 2002, JORGE;
RIBEIRO, 1992,MORAIS, 2011).
Fonte: http://www.vivendociencias.com.br/2016/01/serie-denticao-5-repteis.html [acesso em 25/08/2016 às 21h 34]
3.2 Philodryas olfersii
O gênero Philodryas é composto por aproximadamente 20 espécies (ARREDONDO,2011) restritas a América do Sul e apresentando ampla distribuição geográfica, sendo que 10 dessas ocorrem no Brasil:
P. aestivus (Duméril, Bibron et Duméril, 1854);
P. arnaldoi (Amaral, 1932);
Figura 3: Esquema ilustrativo mostrando os quatro tipos de dentição encontrados nas serpentes, sendo (a) dentição do tipo áglifa, (b) dentição do tipo opistóglifa, (c) dentição do tipo proteróglifa e (d) dentição do tipo solenóglifa.
P. mattogrossensis (Koslowisky, 1898);
P. nattereri (Steindachner, 1870);
P. viridissimus (Linnaeus, 1758);
P. olfersii (Lichtenstein, 1823);
P. patagoniensis (Girard, 1857);
P. livida (Amaral, 1923);
P. oligolepis (Gomes in Amaral, 1921);
P. psammophidea (Günther, 1872).
Suas características principais são corpo alongado, pupilas redondas e dentição opistóglifa (BÉRNILS; COSTA, 2012; ARREDONDO,2011). No Brasil podem ser encontradas em algumas áreas na região Nordeste e Centro-Oeste e em toda a região Sudeste e Sul, estendendo-se até a Patagônia (HARTMANN;
MARQUES,2005).
A espécie Philodryas olfersii (Figura 4), família Dipsadidae, subfamília Xenodontinae, conhecida popularmente como Cobra-cipó, Cobra de São João ou mais frequentemente Cobra-verde, devido a sua coloração, é a serpente opistóglifa responsável pela maior parte dos acidentes causados por dipsadídeos no Brasil (COLLAÇO et al., 2012; CORREIA et al., 2010).
Fonte:http://www.ufrgs.br/herpetologia/R%C3%A9pteis/Philodryas%20olfersii.htm [acesso em 25/08/2016 às 21h 49]
Figura 4: Serpente pertencente a espécie Philodryas olfersii (cobra-verde).
É um dipsadídeo de porte médio, encontrado em vários ecossistemas, que apresenta hábitos terrestres e semi-arborícolas, vivendo em florestas e áreas adjacentes (LEITE et al., 2009). P. olfersii é descrita como sendo semi-arbórea uma vez que é comumente encontrada no solo e em florestas, no entanto, quando na floresta, é mais frequentemente encontrada na vegetação (HARTMANN; MARQUES, 2005; MESQUITA et al., 2012; MESQUITA et al., 2013).
Nos meses chuvosos é comum perceber um aumento na quantidade de serpentes ativas, possivelmente devido a maior disponibilidade de presas e também para fins de reprodução. A serpente P. olfersii apresenta hábito exclusivamente diurno, onde suas atividades diárias estão mais concentradas nos períodos mais quentes do dia (HARTMANN; MARQUES, 2005; PONTES, 2007; MESQUITA et al., 2011; MESQUITA et al., 2013).
Sendo um predador generalista, a serpente P. olfersii pode predar uma ampla variedade de pequenos vertebrados (LEITE et al., 2009). Sua dieta consiste em:
lagartos, sapos, mamíferos, pássaros, peixes e ovos de répteis, apresentando grande interesse por sapos, mas também sendo comum predarem passeriformes (Figura 5) (HARTMANN AND MARQUES, 2005; FRANÇA et al., 2008; MESQUITA et al., 2013).
Figura 5:Philodryas olfersii predando um passeriforme em Caçapava SP
Foto: Autora, 2016.
No entanto, Balestrin (2008) em um estudo conduzido em uma serra na região sudeste do Rio Grande do Sul, constatou que a dieta dessa serpente era exclusivamente composta por pássaros. É possível observar uma variação ontogenética tanto quantitativa (número de diferentes itens consumidos) quanto qualitativa (tipos de itens consumidos) em serpentes do gênero Philodryas (VASCONCELOS-FILHO et al., 2015).
Esta variação ontogenética sofre influência do tamanho da serpente, uma vez que as serpentes juvenis apresentam uma dificuldade para subjugar presas grandes bem como a disponibilidade associada com o uso de micro hábitat, o que explica a maior incidência de aves na dieta de P. olfersii (PONTES, 2007).
O ciclo reprodutivo de P. olfersii é longo e ocorre entre os meses de outubro a abril (BALESTRIN, 2008) ou entre junho a dezembro (MESQUITA et al., 2011).
Mesquita et al. (2013) reportou a presença de folículos vitelogênicos ao longo do ano. Apesar das fêmeas apresentarem folículos vitelogênicos ao longo do ano, o seu ciclo reprodutivo não é continuo já que a ovulação é claramente sazonal e restrita aos meses de novembro a janeiro. Além disso, os machos aparentam ter um período de dormência reprodutiva durante os meses mais frios, de junho a setembro (MESQUITA et al., 2011).
Todas as espécies apresentam um dimorfismo sexual similar, onde as fêmeas apresentam um comprimento rostro-cloacal maior do que os machos, porém os machos apresentam caudas relativamente mais longas. Essa diferença, no entanto,
não ocorre em P. olfersii (FOWLER; SALOMÃO, 1994; MESQUITA et al., 2013). A ausência de dimorfismo entre machos e fêmeas relativo ao tamanho da cabeça está relacionado ao nicho alimentar, já que cada sexo pode predar diferentes tipos e tamanhos de presas. Portanto, essa ausência de dimorfismo sugere que ambos os sexos de P. olfersii se alimentam de presas similares (MESQUITA et al., 2011).
3.3 Importância dos estudos sobre a peçonha e toxinas de serpentes
As serpentes peçonhentas são animais que, durante sua evolução, se especializaram em afetar as funções vitais de suas presas por meio de suas peçonhas. As toxinas presentes nas peçonhas de serpentes são cada vez mais estudadas, possibilitando a elucidação de vários processos bioquímicos e fisiológicos manifestados durante o envenenamento, e são cada vez mais utilizadas como ferramentas farmacológicas e também como protótipos para o desenvolvimento de novos princípios ativos de drogas para os mais variados fins.
(NERY, 2012; LOPES,2008).
As serpentes produzem sua peçonha em glândulas especializadas, que são capazes de sintetizar e secretar uma quantidade e variedade de substâncias biologicamente ativas, sendo capazes de paralisar e matar outro organismos e ajudar na defesa contra predadores ou agressores (NERY, 2012).
As peçonhas de serpentes, em geral, são misturas complexas de várias substâncias, onde a proporção e características variam entre famílias, gêneros e entre as mesmas espécies. Sua composição também pode variar em função da idade e do sexo do animal, assim como pelos seus hábitos alimentares, distribuição geográfica, caráter individual entre as serpentes e também pela sazonalidade (NERY,2012; LOPES,2008,). Cerca de 90%, do peso seco das peçonhas de serpentes, referem-se a proteínas e enzimas, hialuronidases, L-amino-oxidases, metaloproteases e serinoproteases, sendo os demais componentes constituídos por peptídeos, compostos orgânicos de baixa massa molecular e compostos inorgânicos como cálcio, potássio e zinco, como mostra a Figura 7 (NERY, 2012).
Fonte: Ramos; Araújo, (2006).
A intensidade dos sintomas após o envenenamento está diretamente
A intensidade dos sintomas após o envenenamento está diretamente relacionada com a quantidade de peçonha que foi inoculada, que por sua vez, está relacionada com o tamanho, idade e tempo de alimentação da serpente (NERY, 2012).
Figura 6: Quadro ilustrativo mostrando os principais componentes da peçonha de serpentes.
As toxinas da peçonha de serpentes, normalmente, estão envolvidas em mecanismos de defesa, além de possuírem características de letalidade, já que são utilizadas para captura, abate e digestão de suas presas e de possíveis inimigos.
Para isso, é necessário que essas toxinas sejam biologicamente ativas, havendo possíveis aplicabilidades terapêuticas para elas (LEWIS; GARCIA, 2003).
Cada vez mais se faz necessário o conhecimento sobre os mecanismos de ação das toxinas e antitoxinas animais e vegetais para a busca de técnicas de diagnósticos, tratamentos alternativos ao envenenamento e/ou para o desenvolvimento de novos fármacos. Como um exemplo clássico na literatura cientifica, da aplicação dessas toxinas na terapêutica, temos a utilização do peptídeo oriundo da peçonha de Bothrops jararaca, utilizada como um protótipo para o tratamento de doenças cardiovasculares, sendo o agente terapêutico o captopril, um inibidor da enzima conversora de angiotensina (LEWIS; GARCIA, 2003).
3.4 Efeitos biológicos da peçonha de Philodryas olfersii
A peçonha das serpentes são misturas complexas de componentes proteicos e não-proteicos e que apresentam uma ampla gama de atividades biológicas (ZELANIS et al., 2010). Os principais componentes, presentes na peçonha dos dipsadídeos, são os polipeptídeos que podem ou não apresentar atividade enzimática. As toxinas enzimáticas presentes na peçonha podem ser hidrolases como as proteinases, fosfodiesterases e fosfolipases que auxiliam na digestão de suas presas (NERY, 2012). As proteínas podem atuar em substratos inespecíficos ou em substratos altamente especializados, como no caso das serinoproteinases e metaloproteinases (BJARNASON; FOX, 1994; GUTIÉRREZ; RUCAVADO,2000).
A pesar da maioria dos registros existentes não declararem sérias consequências nos acidentes causados por serpentes opistóglifas, muitos relatos ressaltam a importância das toxinas presentes nessas peçonhas, sendo que os registros causados por colubrídeos Sul-americanos datam do início do século XIX (LOPES, 2008).
A família Dipsadidae é uma das maiores famílias dentre a superfamília Colubroidea, consistindo em mais de 700 espécies (UETZ; FREED; HOŠEK, 2013).
Embora essas serpentes sejam consideradas não peçonhentas, estudos mostram que a glândula de Duvernoy, localizada na região posterior da maxila, presente
nessas serpentes produzem substancias tóxicas que podem causar efeitos locais e sistêmicos (CORREIA et al., 2010; VASCONCELOS-FILHO et al., 2015).
Os acidentes causados pela família Dipsadidae, mais especificamente, pelo gênero Philodryas, apresentam manifestações clinicas semelhantes aos acidentes botrópicos (jararacas), onde se destaca hemorragia local, desenvolvimento do processo inflamatório e/ou necrose, podendo ou não apresentar sintomas de ordem sistêmica (NERY, 2012; PUORTO; FRANÇA, 2003).Grande parte dos sinais e sintomas observados nesses acidentes é resultante tanto do trauma mecânico da mordida como também da ação de toxinas presentes em sua peçonha (ACOSTA DE PÉREZ et al., 2003).
Após a inoculação da peçonha de uma espécie pertencente à família Dipsadidae, é possível observar os seguintes sinais na vítima (Figura 6): dor, inchaço, hematomas, sangramento transiente, necrose muscular e efeitos sistêmicos, tais como tonturas e vômitos (VASCONCELOS-FILHO et al., 2015).
Nota: A) lesão após a mordida da serpente P. olfersii. A seta indica o local de inoculação pela dentição do tipo opistóglifa, na mão direita. B) a mão direita do paciente apresentando edema e equimoses após o envenenamento. C) regressão dos sintomas após a soroterapia. D) O espécime capturado de P. olfersii.
Fonte: Foto de Correia et al., 2010.
Araújo e Santos (1997) relataram que tanto a mordida de P. olfersii quanto de P. patagoniensis não causam dor ou sangramento imediato, porém 15 minutos após o acidente foi observado a formação de um edema que mais tarde progrediu para toda a região do antebraço e braço, impedindo os movimentos do membro afetado e
Figura 7: Envenenamento causado por uma serpente da espécie Philodryas olfersii, atendido no Hospital da Restauração do Recife, Pernambuco.
formando duas áreas de hematomas. Este edema durou 15 dias e não foram identificados efeitos sistêmicos na vítima.
Além disso Peichoto, Céspedez e Pascual (2007) observaram a presença de uma dor ardente após a picada de P. olfersii, assim como tonturas, náuseas e vômitos, que persistiram durante duas semanas, mesmo após intervenção medicamentosa. A presença de hemorragia transitória, eritema, bem como os sinais clínicos já mencionados acima, tem sido relatos, porém não observados em todos os casos de picadas por P. olfersii. Como demonstrado por Rocha e Furtado (2007) a formação de edema após picada de P. olfersii e P. patagoniensis foi muito rápida, ocorrendo entre 5 e 10 minutos após a inoculação da peçonha, atingindo seu efeito máximo após 30 minutos e manteve-se estável até a quarta hora após o envenenamento.
De acordo com alguns estudos a peçonha produzida pela glândula de Duvernoy da serpente P. olfersii apresenta alta atividade hemorrágica, com um pico de atividade de duas a quatro horas e doses mínimas para sangramento de 24ug/camundongo de peçonha (ROCHA; FURTADO, 2007). Em outros estudos foram encontrados uma dose mínima para sangramento de 0.5ug/camundongo de peçonha (ASSAKURA et al.,1992). A atividade hemorrágica da peçonha é provavelmente causada pela ação de metaloproteinases que degradam a membrana basal da parede dos vasos sanguíneos, resultando numa perda da integridade capilar levando a um sangramento local. Além disso, as enzimas fibrinogenolíticas reduzem a quantidade de fibrinogênio do plasma por hidrólise, dificultando a coagulação (VASCONCELOS-FILHO et al., 2015).
A peçonha de Philodryas spp. apresenta alta atividade proteolítica, superando até mesmo as peçonhas de Bothrops alternatus e B. jararaca, o que parece ser um fator determinante, resultando em extensas mionecroses, caracterizada pela presença de núcleos picnóticos (PRADO-FRANCESCHI et al.,1998), aumentando de intensidade ao longo do tempo (VASCONCELOS-FILHO et al., 2015). Foi proposto por Rocha e Furtado (2007) uma dose necrosante mínima, para P. olfersii, de 79.1ug/camundongo de peçonha. Está necrose é provavelmente causada pelas enzimas proteolíticas presentes na peçonha e que degradam a matriz extracelular dos tecidos. Isso pode ser visto de maneira mais proeminente nos arredores do músculo gastrocnêmio inoculado com peçonha, onde é possível se observar degradação das miofibrilas, danificando e inibindo as contrações musculares
(PRADO-FRANCESCHI et al.,1998). Outro fator no diagnóstico de mionecroses é o aumento dos níveis de creatina quinase (CK) no plasma, o qual é um marcador especifico para dano muscular (PRADO-FRANCESCHI et al.,1998; PEICHOTO et al., 2004).
Segundo Assakura et al. (1992) a peçonha de P. olfersii apresenta atividades hemorrágica, edematogênica e fibrinogenolíticas, sendo este desprovido de enzimas do tipo-trombina, procoagulantes, fosfolipase A2 e de agregação plaquetária. Após este estudo, Assakura et al. (1994) conseguiram isolar cinco diferentes proteinases fibrin(ogen)olíticas desta mesma peçonha, sendo elas: PofibC1, C2, C3 H e S.
Ao estudar os efeitos “in vivo” da peçonha de P. olfersii, Prado-Franceschi et al. (1996) demonstraram ação miotóxica, com aumento dos níveis séricos de creatino quinase (CK), e lise das células musculares em camundongos. Também foram observados paralisia e bloqueio irreversível em preparações da junção neuromuscular de pintainhos. Posteriormente, Prado-Franceschi et al. (1998) conseguiram isolar e caracterizar uma fração miotóxica com peso molecular de 20.0 kDa, sem ação fosfolipásica.
3.5 Epidemiologia
Os casos de envenenamentos representam um sério problema de saúde pública, sendo as serpentes as responsáveis mais frequentes por esses acidentes.
No Brasil foram registrados 27.261 casos de acidentes ofídicos com 120 óbitos no ano de 2014. Os três estados que apresentaram os maiores números de acidentes foram Pará (19,3%), Minas Gerais (10,3%) e Bahia (8,2%). A região onde ocorreu a maioria dos acidentes por serpentes foi a Norte (35,5%), seguida das regiões Nordeste (22,7%), Sudeste (22,2%), Centro-Oeste (10,5%) e Sul (9%) (DOURADO;
RECKZIEGEL; MOURA, 2014). Entretanto esse número parece não condizer com a realidade, uma vez que algumas serpentes peçonhentas não são consideradas como sendo peçonhentas devido à localização anatômica de suas presas inoculadoras (LEMOS et al., 2009). Isso é devido as características morfológicas das presas, já que serpentes opistóglifas apresentam dificuldade em inocular sua peçonha em razão da localização de suas pesas na parte de trás da mandíbula superior, como no casos de espécies pertencentes a família Dipsadidae (MEDEIROS et al., 2010; MENEZES et al., 2013).
O perfil epidemiológico dos acidentes ofídicos causados por serpentes consideradas não peçonhentas foi traçado a partir de estudos onde foi possível verificar que o número de relatos de picadas causadas por estas serpentes vem aumentando consideravelmente, tornando-se assim um problema de saúde pública (BIGELLI et al, 2012). No Brasil cerca de 40% entre todos os acidentes registrados no país são causados por serpentes consideradas não peçonhentas (SINAN, 2011).
Os estudos epidemiológicos tem demonstrado um elevado número de acidentes causados por serpentes com dentição opistóglifa (do grego ópisthen, atrás; posteriormente) pertencentes a família Dipsadidae, subfamília Xenodontinae, como vem ocorrendo com as serpentes do gênero Philodryas (ARAUJO; SANTOS, 1997, RODRÍGUEZ-ACOSTA et al., 2006).
3.6 Atividades das peçonhas de serpentes
3.6.1 Atividade proteolítica
A atividade proteolítica é atribuída a complexa mistura de enzimas proteolíticas que são responsáveis pelos efeitos locais da peçonha, onde os fatores responsáveis por esta atividade incluem as fosfolipases, proteases e toxinas polipeptídicas que agem destruindo membranas e células. Seu mecanismo de ação pode ser direto, por destruição celular, ou secundário, pela indução da síntese de mediadores inflamatórios, como leucotrienos, prostaglandinas e outras substâncias (VARGAFTIG et al., 1974). Além de importantes efeitos locais, como edema e necrose, peçonhas com atividade proteolítica podem acarretar em efeitos sistêmicos importantes, como choque, alterações na cascata de coagulação sanguínea, agregação plaquetária e liberação de autacoídes endógenos como histamina, serotonina e bradicinina (BRAZIL, 1982).
3.6.2 Atividade miotóxica
Durante o processo da mionecrose as modificações morfológicas que ocorrem no tecido estão associadas ao aumento nos níveis plasmáticos de creatinoquinase (CK), que é uma enzima intramuscular frequentemente utilizada como marcador de lesões musculares (GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1989).
Experimentalmente, muitas espécies de serpentes induzem miotoxicidade (GUTIÉRREZ et al., 1992) no entanto a correlação destes achados com o aspecto clinico dos envenenamentos ainda não está totalmente clara. O envenenamento causado pelas serpentes do gênero Crotalus causam uma necrose muscular atribuída a crotoxina, composta por crotapotina, que não apresenta atividade enzimática, e fosfolipase A2(AZEVEDO-MARQUES et al., 1985). Tem sido observados modificações por necrose degenerativa e sinais de regeneração em fibras dos tipos I e IIa de músculo estriado (CUPO et al., 1992).
3.6.3 Atividade hemorrágica
A atividade hemorrágica está atribuída principalmente a componentes específicos denominados de hemorraginas, que são metaloproteinases que contem zinco, e que podem romper a integridade do endotélio vascular. São responsáveis pela degradação de vários componentes da matriz extracelular, como o colágeno tipo IV, fibronectina e laminina, sendo também potentes inibidores da agregação plaquetária (LOMONTE, 1994). Apresentam como possíveis mecanismos de ação a digestão enzimática da lâmina basal da microvasculatura e a ruptura completa das células endoteliais ou a formação de “gaps”. As clivagens específicas em pontos chaves desencadeariam mecanismos endógenos amplificadores, sendo que atualmente há clara evidencia de ataque proteolítico a lâmina basal vascular (GOULD et al.,1990; BJARNASON; FOX, 1994; KAMIGUTI et al., 1992; 1994).
3.6.4 Atividade inflamatória
A atividade inflamatória é resultante de um conjunto de frações heterogêneas e com especificidades diversas presentes na peçonha e que são responsáveis pelos fenômenos locais, sendo estas aminas biogênicas pré-formadas do tipo histamina, pequenos peptídeos ou proteínas como fosfolipases A2, esterases, proteases, enzimas liberadoras de cininas (calicreínas, cininogenases) e lectinas. As frações da peçonha frequentemente apresentam uma atividade direta, induzindo ou liberando potentes substâncias autacóides, como por exemplo, a bradicinina, prostaglandinas, leucotrienos, prostaciclinas, que irão atuar de maneira complexa e inter-relacionada,
sendo que muitas vezes, uma única fração da peçonha pode liberar várias substâncias com atividade inflamatória. (LOPES,2008).
3.6.5 Atividade sobre plaquetas e coagulação
A peçonha produzida pelas serpentes do gênero Bothrops apresentam a capacidade de ativar fatores de coagulação sanguínea, acarretando em um consumo de fibrinogênio e formação de fibrina intravascular, podendo induzir frequentemente uma incoagulabilidade sanguínea e podendo levar a fibrinogenemia (KAMIGUTI; CARDOSO, 1989; KAMIGUTI; SANO-MARTINS, 1995).Grande parte dessas peçonhas possui isolada ou simultaneamente substancias capazes de ativar fibrinogênio, protrombina e fator X, sendo também descritos fatores com atividade dobre a agregação e aglutinação plaquetária. Os fatores ativadores da cascata de coagulação presentes nas víboras sul americanas agem em três diferentes pontos:
Fator I (atividade thrombin-like), protrombina e Fator X (atividade pró-coagulante) (NAHAS et al.,1979).
3.6.6 Atividade cardiovascular
A atividade cardiovascular das peçonhas é causada pela liberação de substâncias farmacologicamente ativas (bradicinina, histamina, 5-hidroxitriptamina e prostaglandinas) dos tecidos e estas podem contribuir para o choque circulatório produzido por peçonhas de viperídeos e elapídeos. É importante lembrar que algumas peçonhas contem enzimas coagulantes ou pró-coagulantes, podendo produzir coagulação intravascular e contribuir para as modificações cardiovasculares observadas (LEE; LEE,1979). O efeito hemodinâmico mais visível produzido pela peçonha que detém essa atividade, em geral, é uma imediata e profunda queda da pressão sanguínea sistêmica, seguida pelo choque secundário. Sendo já descritos esses efeitos hipotensivos para algumas peçonhas de Micrurus (RAMSEY et al., 1972; FRANCIS et al., 1993).
3.6.7 Atividade neurotóxica
A atividade neurotóxica é causada por neurotoxinas pré-sinápticas que atuam em terminações nervosas motoras, inibindo dessa maneira a liberação de acetilcolina pelos impulsos nervosos, sendo essa inibição a principal responsável pelo bloqueio neuromuscular e consequentemente pelas paralisias respiratórias e motoras observadas nos animais.
As neurotoxinas pós-sinápticas acarretam no bloqueio do impulso nervoso devido a ligação da peçonha aos receptores colinérgicos presentes na membrana pós-juncional da placa mioneural, causando uma síndrome semelhante a myasthenia gravis. Essas neurotoxinas pós-sinápticas são encontradas em venenos de Micrurus frontalis e Micrurus leminiscatus (BRAZIL, 1987).
3.6.8 Atividade nefrotóxica
A insuficiência renal aguda (IRA) e diversas alterações renais são descritas após o envenenamento ofídico, sendo elas a glomerulonefrite, glomerulite, nefrite intersticial, artrite, necrose tubular, necrose cortical e insuficiência renal. Vários fatores são implicados na patogênese da IRA induzida pelo envenenamento botrópico, como vasoconstrição renal e consequentemente isquemia renal, hemólise, deposição de fibrina glomerular, lesão vascular, liberação de substâncias vasoativas, deposição de complexos imunes e ação nefrotóxica direta pela atividade proteolítica da peçonha (SITPRIJA, 2006).Histaminas, cininas, eicosanoides, fator de ativação plaquetária (PAF), catecolaminas e endotelina, são alguns dos mediadores envolvidos dentre as alterações cardiovasculares e renais (MORAIS, 2011). O envenenamento por serpentes do gênero Bothrops induziram elevações significativas de TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10, IFN-γ e NO (SITPRIJA, 2006). A atividade fosfolipásica pode produzir diversas prostaglandinas, vasodilatadoras renais responsáveis pelo aumento do fluxo sanguíneo e consequentemente diurese, natriurese e caliurese ou por outro lado liberação de PGF2α, que apresenta ação vasoconstritora. Através da cicloxigenase e PLA2 pode ativar o tromboxano A2 que também tem ação vasoconstritora, promovendo assim a redução do fluxo sanguíneo renal e da taxa de filtração glomerular (BARBOSA et al., 2002).
3.7 O sistema muscular
O sistema muscular é um sistema de células contráteis que envolvem um elevado grau de interação entra as proteínas de actina e miosina. Nos mamíferos é composto por quatro células especializadas, sendo elas: células do músculo esquelético, células do músculo cardíaco, células do músculo liso e células mioepiteliais, diferenciadas entre si em estrutura e função (ALVES, 2010).
Os músculos estriados esqueléticos, de uma maneira genérica, podem ser classificados em músculos de contração rápida e músculos de contração lenta. Os músculos estriados são compostos por fibras, que se desenvolvem durante a embriogênese por fusão de mioblastos mononucleados, formando dessa forma células multinucleadas. As células do músculo estriado esquelético geram forças contráteis por meio de sistemas de filamentos organizados, actina e miosina, e no ser humano apresentam tamanho aproximado de 2 e 3 cm de comprimento e 100mm de diâmetro, sendo dessa forma frequentemente referidas como fibras musculares, devido a sua forma alongada (ALVES, 2010).
De acordo com Carlson (1986) a capacidade de regeneração do músculo esquelético é limitada e se a lesão sofrida for grande a regeneração pode não ocorrer e o músculo perdido será substituído por tecido conjuntivo. A lesão no músculo esquelético pode ter regeneração após lesão parcial ou total da fibra muscular e está regeneração está associada a três fatores: população de células satélites, reinervação e revascularização.
3.7.1 Regeneração muscular
Acreditou-se por muitos anos que a regeneração muscular não era possível, no entanto, Mauro (1961) relatou em seus estudos a existência da célula satélite na periferia das miofibrilas de sapos e desde então se sabe que a fibra muscular certamente se regenera. Dessa forma, a fibra muscular pode responder a uma lesão tanto com a regeneração, quanto com a formação de fibrose na área lesada, porém a fibrose pode levar a inibição completa da regeneração (FERRARI et al., 2005).
O sucesso da regeneração muscular é um processo que irá depender da extensão e da natureza da lesão, mas que em todas as situações envolve as etapas de revascularização, infiltração celular, fagocitose das células ou fragmentos danificados, proliferação e fusão das células precursoras do músculo, que
representam as células satélites e finalmente a reinervação. Embora a literatura existente mostre uma determinada semelhança no processo de regeneração muscular, independente da causa da lesão, o tempo e a eficácia desse processo podem variar de acordo com determinados fatores, como por exemplo: a) vascularização tecidual: havendo comprometimento vascular local, observa-se um retardo no processo de regeneração; b) idade: uma vez que animais idosos tem um processo de regeneração mais lento que os jovens; c) sexo: em machos a fagocitose celular ocorre de maneira mais lenta do que em fêmeas, devido à presença do hormônio testosterona; d) espécie: em algumas espécies animais a regeneração ocorre deforma mais rápida; e) tipo de músculo submetido ao trauma:
foi observado nos estudos de Bassaglia e Gautron (1995) que um músculo glicolítico é mais resistente a lesão mecânica que um músculo oxidativo; f) reincidência da lesão: onde músculos submetidos a contusões periódicas possuem processo regenerativo mais lento que músculos lesados uma única vez (FERRARI et al., 2005).
Uma população de células indispensáveis para a regeneração muscular são as células quiescentes miogênicas, ativadas após a lesão muscular ou nervosa e também após o estímulo de hipertrofia. Essas células são conhecidas como células satélites e estão presentes entre a lâmina basal e a membrana plasmática da fibra muscular. Essas células são moduladas por fatores de crescimento especifico e hormônios, sendo que alguns componentes importantes da matriz extracelular, como a laminina, a fibronectina e o próprio colágeno, desempenham papel importante na manutenção dessas células satélites no estado quiescente, na regulação da proliferação e fusão dessas células (FERRARI et al., 2005).
Logo após a ruptura do sarcolema e consequente necrose da fibra muscular, as células satélites são ativadas, ocorrendo dessa forma à proliferação e transformação delas em mioblastos, fusão em miotubos, produção de proteínas musculares especifica e finalmente diferenciação da fibra muscular, com seus núcleos localizados na periferia. Com isso, a regeneração do músculo esquelético é comparada estrutural e funcionalmente com o seu desenvolvimento embriônico ou miogênese (FERRARI et al., 2005).
3.8 Reação inflamatória
O processo de reação inflamatória é tido como uma reposta protetora dos organismos vivos em decorrência a uma agressão, que pode ter sua origem tanto exógena (origem externa) como endógena (origem interna). Caracteriza-se como sendo a primeira linha de defesa do organismo, buscando restabelecer a hemostasia e a integridade do tecido, e inicialmente apresentando-se essencialmente benéfico, no entanto tornando-se muitas vezes prejudicial ao organismo quando não ocorre de maneira adequada (BARBOSA, 2003; SOUTO, 2009; FERNANDES, 2012).
São observados vários eventos no decorrer do processo inflamatório (Figura 8), sendo eles a vasodilatação local, aumentando o fluxo sanguíneo, aumento da permeabilidade dos capilares provocando o extravasamento e coagulação de liquido nos espaços intersticiais, a migração de células de defesa para o local lesionado, intumescência das células, liberação de mediadores, sensibilização e também a ativação de receptores, entre outros eventos (GUYTON; HALL, 2006, BARBOSA, 2003).
Fonte:
A resposta inflamatória manifesta-se obedecendo a um padrão, onde é possível observar sinais clássicos desse processo já na primeira fase da inflamação, denominada de fase aguda, e essa fase é evidenciada por rubor, calor, edema e dor.
Figura 8: Esquema simplificado dos eventos que ocorrem durante o processo inflamatório.
Esses sinais originam-se da ação de produtos biologicamente ativos, denominados de mediadores químicos, liberados no local da agressão (SOUTO, 2009). Grande parte dos eventos inflamatórios decorrem da atuação de mediadores inflamatórios pré-formados, que estão armazenados, ou recém sintetizados, que são liberados no transcorrer da reposta inflamatória (GARCIA-LEME; FARSKY, 1993).
Os mediadores inflamatórios, produzidos durante o processo inflamatório, são variados e podem apresentar origem plasmática, como as cininas e fatores do sistema complemento, ou origem celular como as histaminas, serotonina, óxido nítrico, fator ativados de plaquetas, citocinas e derivados do ácido araquidônico (CRUVINEL et al., 2010).
3.8.1 Migração leucocitária
O recrutamento de leucócitos para os locais de infecção é um processo que apresenta várias etapas envolvendo a ligação dos leucócitos circulantes as células endoteliais e também sua migração através do endotélio. Esse processo é regulado pela ligação de moléculas de adesão complementares no leucócitos e na superfície das células endoteliais e também pelos mediadores químicos, denominados quimiocinas (BRAIN, 1994).
Os eventos iniciais englobam a indução de moléculas de adesão nas células endoteliais por meio de vários mecanismos. O endotélio responde aos agentes nocivos através da secreção das citocinas TNF, IL-1 e quimiocinas. O TNF e a IL-1 irão atuar nas células endoteliais de vênulas pós-capilares adjacentes ao local da infecção induzindo-as a expressarem várias moléculas de adesão. Após um ou duas horas o endotélio então passa a expessar E-selectina e os leucócitos, devido à redução da velocidade do fluxo sanguíneo, começam a marginar a superfície endotelial e a expressar carboidratos que irão se ligar a essas selectinas endoteliais, no entanto com uma baixa afinidade, sendo esta ligação facilmente interrompida pelo fluxo sanguíneo. Em decorrência disso, os leucócitos ligados ao endotélio se soltam e se ligam novamente, rolando sobre uma superfície endotelial, movimento denominado de rolling (BRAIN, 1994; EBNET; VESTWEBBER,1999; ABBAS &
LICHTMAN, 2005).
O TNF e a IL-1 também são responsáveis por induzirem a expressão endotelial de ligantes para integrinas e os leucócitos, normalmente, expressam
essas integrinas num estado de baixa afinidade. No entanto, as quimiocinas que são produzidas no local da lesão adentram no vaso sanguíneo, ligando-se as células endoteliais e agindo nos leucócitos, fazendo com que sejam ativados e convertam suas integrinas para um estado de alta afinidade, resultando assim numa firme ligação dos leucócitos ao endotélio. Esse processo conhecido como a adesão (BRAIN, 1994; EBNET & VESTWEBBER,1999; ABBAS; LICHTMAN, 2005).
Subsequentemente a adesão, o próximo passo no processo de migração de leucócitos no endotélio é a transmigração ou diapedese. As quimiocinas atuam agindo nos leucócitos aderidos e estimulam as células a migrar através dos espaços endoteliais na direção do gradiente quimiotático, ou seja, a migrarem na direção do local da lesão ou infecção. Uma vez no tecido extravascular, os leucócitos se aderem à matriz extracelular e são retidos nos locais onde são necessários (BRAIN, 1994; EBNET; VESTWEBBER,1999).
3.9 Citocinas
As citocinas são polipeptídeos ou glicoproteínas extracelulares, hidrossolúveis e que são produzidas por diversos tipos de células no local da lesão e também por células do sistema imunológico (Figura 9), por meio da ativação de proteinoquinases ativadas por mitógenos. As citocinas não são armazenadas como moléculas pré- formadas e sua atuação vai ocorrer especialmente por mecanismo parácrino (em células vizinhas) e autócrino (nas próprias células produtoras) (LIN; CALVANO;
LOWRY, 2000; SOMMER; WHITE, 2010).
Diferentes tipos de células podem secretar a mesma citocina e uma única citocina pode agir em diversos tipos celulares, um fenômeno denominado pleiotropia. As citocinas apresentam uma redundância em suas atividades, uma vez que ações semelhantes podem ser desencadeadas por diferentes citocinas. São frequentemente formadas em cascata, onde uma citocina irá estimular sua célula- alvo a produzir mais citocinas (ZHANG; AN, 2007). Ao sei ligar a receptores específicos, as citocinas ativam mensageiros intercelulares que regulam a transcrição gênica, influenciando dessa maneira a atividade, a diferenciação, a proliferação e também a sobrevida da célula imunológica, bem como a produção e a atividade de outras citocinas, que poderão aumentar (pró-inflamatória) ou atenuar (anti-inflamatória) a resposta inflamatória. De acordo com o microambiente em que
algumas citocinas estão localizadas elas podem exercer ações pró (Th1) ou anti- inflamatórias (Th2), dentre as consideradas pró-inflamatórias temos as interleucinas (IL) 1, 2, 6, 7 e TNF (fator de necrose tumoral) e dentre as anti-inflamatórias estão a IL-4, IL-10, IL-13 e FTCβ (fator transformador de crescimento β) (SOMMER; WHITE, 2010; OLIVEIRA et al.,2011).
As citocinas são de extrema importância durante o processo inflamatório, uma vez que são mediadores necessários para conduzir a resposta inflamatória aos locais de infecção e lesão, favorecendo dessa forma a cicatrização apropriada da ferida em questão. Todavia a produção exacerbada de citocinas consideradas pró- inflamatórias a partir da lesão pode vir a manifestar-se sistemicamente com instabilidade hemodinâmica ou mesmo com distúrbios metabólicos, uma vez que uma resposta exacerbada e persistente de citocinas Th1, após lesões e infecções graves, pode contribuir para lesões em órgãos alvo, resultando em insuficiência de múltiplos órgãos e a morte. As citocinas Th2, consideradas anti-inflamatórias, podem minimizar alguns desses efeitos indesejáveis (LIN; CALVANO; LOWRY, 2000;
SOMMER; WHITE, 2010; OLIVEIRA et al.,2011).
Uma vez que as citocinas não podem ser classificadas quanto a célula de origem ou quanto a sua função biológicas, elas foram agrupadas em interleucinas (IL, numerada sequencialmente de IL-1 a IL-35), fatores de necrose tumoral (TNF), quimiocinas (citocinas quimiotáticas), interferons (IFN) e fatores de crescimento mesenquimal (SOMMER; WHITE, 2010; OLIVEIRA et al.,2011).
3.9.1 Interleucina- 1 (IL-1)
Os monócitos e macrófagos são a principal fonte de IL-1, produzindo principalmente IL-1β, já os queratinócitos produzem IL-1α. Células endoteliais, fibroblastos, miócitos, células de Langerhans e linfócitos B e T, também podem produzir IL-1. A síntese de IL-1 pode ser induzida por TNF-α, IFN-α, β e γ, LPS, vírus e antígenos (VARELLA; FORTE, 2001).
As formas αe β da IL-1 apresentam atividades semelhantes, porém, uma terceira forma descrita, a IL-1γ, também chamada antagonista de receptor de IL-1, é um inibidor competitivo, que bloqueia os efeitos da IL-1. Uso de IL-1γ pode prevenir efeitos maléficos da IL-1. As ações da IL-1 (αe β) podem ocorrer de forma direta ou através de mediadores, como PGE2, CSF’s, IL-6 e IL-8 (VARELLA; FORTE, 2001).
As principais atividades biológicas da IL-1 incluem a estimulação de células CD4+ que secretam IL-2 e produzem receptores para a IL-2; proliferação e ativação de linfócitos B, neutrófilos, monócitos/macrófagos, aumentando assim as atividades quimiotáticas e fagocitárias. Também estimula a adesão de leucócitos, aumenta a expressão das moléculas de adesão pelas células endoteliais, inibe a proliferação das células endoteliais, aumenta a atividade de coagulação, participando na gênese da coagulação intravascular disseminada. A IL-1 também age estimulando hepatócitos a produzirem proteínas de fase aguda de inflamação. Ainda estimula a hematopoese, atuando na própria célula primordial e também a liberação de CSF’s, tendo ação sinérgica a estes (VARELLA; FORTE, 2001).
A IL-1β atua no hipotálamo, exercendo função de pirógeno endógeno;
originando ainda uma alça de inibição da sua própria produção, uma vez que estimula a liberação de CRH pela hipófise posterior. CRH atua na hipófise anterior fazendo com que aconteça a liberação de ACTH, o qual estimula a região fasciculada do córtex da adrenal, aumentando a produção de corticosteróides, que irão inibir a síntese primária de IL-1 e são responsáveis pela hiperglicemia em pacientes diabéticos com processo infeccioso. Também atua aumentando a atividade de osteoclastos e adipócitos, sendo grande responsável pelo emagrecimento e tendência a fraturas de pacientes com processos infecciosos crônicos (VARELLA; FORTE, 2001).
3.9.2 Interleucina-6 (IL-6)
A IL-6 é uma glicoproteína, variando de 22 a 27 kDa, é secretada por vários tipos de células, como macrófagos, monócitos, eosinófilos, hepatócitos e da glia. O TNF-α e IL-1 são potentes indutores dessa interleucina. Utilizando os receptores α (IL-6Rα) e a subunidade gp130 (glicoproteína 130, membros da superfamília de receptor de citocina de classe I), essa interleucina causa febre e ativa o eixo hipotálamo-hipofisário-adrenal (SOMMER; WHITE, 2010; OLIVEIRA et al.,2011). É uma citocina pró-inflamatória que promove a maturação e também a ativação de neutrófilos, a maturação de macrófagos e a diferenciação/manutenção de linfócitos- T citotóxicos e células matadoras naturais. Também ativa os astrócitos e micróglia, regula a expressão de neuropeptídios após uma lesão neuronal, contribuindo assim
com a sua regeneração. Todavia a IL-6 também exerce propriedades anti- inflamatórias durante a lesão, uma vez que libera receptores solúveis de TNF (sFNTRs) e IL-1AR) (LIN; CALVANO; LOWRY, 2000; OLIVEIRA et al.,2011).
Após uma lesão, as concentrações de plasmáticas de IL-6 são detectáveis em 60 minutos, com pico entre 4 e 6 horas, podendo persistir por 10 dias, sendo considerada um dos mais precoces e importantes mediadores de indução e controle da síntese e liberação de proteínas de fase aguda pelos hepatócitos durante estímulos dolorosos (OLIVEIRA et al.,2011).
3.9.3 Interleucina-10 (IL-10)
A IL-10 é um polipeptídeo não glicosilado, com cerca de 18 kDa, e sintetizado em células imunológicas, tecidos neuroendócrinos e neural, onde seu receptor (IL- 10R) pertence à família de receptores de citocina de classe I (semelhante aos receptores para interferons). A sua produção é prejudicada por muitas citocinas, como IL-4, IL-13 e IFN-γ, e também pela sua própria autorregulação (LIN;
CALVANO; LOWRY, 2000; SOMMER; WHITE, 2010; OLIVEIRA et al.,2011).
Essa interleucina também inibe as citocinas pró-inflamatória, principalmente TNF, IL-1 e IL-6, que são produzidas por macrófagos e monócitos ativados, estimulando a produção endógena de citocinas anti-inflamatórias. Aumenta também a proliferação de mastócitos e impede a produção de IFN-γ pelas células matadoras naturais (ZHANG; AN, 2007; OLIVEIRA et al.,2011).
3.9.4 Interleucina-13 (IL-13)
A IL-13 é uma citocina anti-inflamatória, produzida principalmente por células T-CD4, atuando em linfócitos-B e monócitos, inibindo dessa maneira a produção de oxido nítrico e de várias outras citocinas, como IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, proteína inflamatória de macrófago-1α, IFN-α e TNF-α, e aumenta a síntese de IL - 1AR. A IL-13 apresenta características estruturais e funcionais semelhantes a IL-4, diferenciando-se por não estimular a proliferação de blastos induzidos por mitógeno ou clones de linfócitos-T e também por não promover a expressão de CD8α em clones de linfócitos T CD4. (LIN; CALVANO; LOWRY, 2000; OLIVEIRA et al.,2011).
3.9.5 Interleucina-17 (IL-17)
Essa interleucina, atualmente chamada de IL-17A, é o protótipo da família IL- 17. É uma glicoproteína homodimérica de 155 aminoácidos ligada a um radical dissulfeto. É pró-inflamatória, levando a formação de IL-6 e IL-8 (quimiocinas) e da molécula de adesão intercelular em fibroblastos humanos. A IL-17 é predominantemente produzida por linfócitos-T-CD4 e atua como um homodímero de 35kDa em linfócitos T (SOMMER; WHITE, 2010; OLIVEIRA et al.,2011).
3.9.6 Fator de necrose tumoral (TNF)
A principal atividade biológica do TNF é uma acentuada citólise e citoestase em diferentes linhagens neoplásicas, apresentando uma ação antitumoral importantíssima, sendo o principal mediador na caquexia das neoplasias malignas (VARELLA; FORTE, 2001).
O TNF é sintetizado principalmente por macrófagos, podendo também ser sintetizado por monócitos, neutrófilos, células T e NK, após estimulação por LPS. A produção é estimulada por IFN, IL-1, IL-2, GM-CSF, substância P, bradicinina, imunocomplexos, inibidores da cicloxigenase e PAF. A sua produção é inibida por ciclosporina, dexametasona, PGE2, IL-6 e antagonistas do PAF. Tanto o TNF- α quanto o TNF-β ligam-se aos mesmos receptores no início, mas intracelularmente, após a endocitose deste complexo, exercem atividades distintas (VARELLA;
FORTE, 2001).
As alterações endoteliais, principalmente a perda da função de diminuição de coagulação, a atividade quimiotática e estímulo ao metabolismo oxidativo de fagócitos são ações do TNF compartilhadas com a IL-1. Apresenta também atividade de pirógeno endógeno, aumentando a reabsorção óssea, a atividade de adipócitos e a expressão de MHC-I e II. Porém, diferentemente da IL-1, o TNF não tem ação em córtex da adrenal. O TNF estimula a produção de IL-6 fazendo com que os hepatócitos produzam proteínas da fase aguda da inflamação (VARELLA;
FORTE, 2001).
