Estudo de marcadores do tipo InDel

A PCR é descrita por três grandes fases, mais especificamente, desnaturação do ADN, ligação dos primers e extensão dos primers. Cada uma destas fases ocorre durante um tempo previamente estipulado e também durante ciclos definidos, que variam consoante o tipo de polimorfismo a analisar e consoante uma série de particularidades dos reagentes utilizados, sendo que, quando utilizado em kit, as condições são indicadas pelo fabricante. Neste estudo utilizamos um kit - Investigator® DIPplex (Qiagen) -.

Para se proceder ao ensaio de amplificação com a utilização do kit referido, começamos por preparar uma master mix de acordo com a tabela 7. Esta possui todos os componentes necessários para a reação em cadeia da polimerase ocorrer, à exceção das amostras a amplificar. O volume desta master mix deve ser 10% superior ao que é requerido para o número total dos ensaios de PCR a realizar.

Após preparação da master mix, agitamos a mesma, cuidadosamente, e distribuímos os volumes apropriados pelos respetivos tubos de PCR. De seguida, adicionamos 2 µL de ADN a cada tubo de PCR que contém a master mix, perfazendo o volume total de reação por amostra de 12,5 µL. Quanto aos controlos, positivo e negativo, estes foram realizados com

DNA 9948 e com água livre de nucleases, respetivamente.

Tabela 7: Componentes e respetivos volumes de preparação da master mix para amplificação com o kit Investigator® DIPplex (Qiagen).

Componente Volume por reação

H2O desionizada 5,2 µL

Reaction Mix A 2,5 µL

Primer Mix 2,5 µL

Multi Taq2 DNA Polymerase 0,3 µL

ADN 2 µL

Volume total de reação 12,5 µL

Cada um dos componentes de reação da PCR possui a sua função. Relativamente à

Reaction Mix A, esta possui uma mix de dNTPs, de MgCl2 e de BSA (bovine serum albumin).

ADN formados por uma base azotada (adenina, citosina, guanina e timina), um açúcar - uma desoxirribose -, e três grupos fosfato. Estes são utilizados na PCR no processo de extensão das novas cadeias de ADN. Quanto ao MgCl2, cloreto de magnésio, este fornece à PCR o

magnésio necessário para a mesma ocorrer, uma vez que, a Taq polimerase presente nesta reação necessita de magnésio, funcionando como cofator. Relativamente ao BSA, este é útil nas reações enzimáticas, onde a ausência de nucleases é essencial, uma vez que, é utilizado na estabilização das enzimas durante o processo de PCR.

A primer mix, possui todos os primers necessários para a reação de PCR. Por último, a

Taq polimerase, é obtida de uma bactéria, a Thermus aquaticus e trata-se de uma enzima

resistente a elevadas temperaturas, que permite a ligação dos nucleótidos à cadeia molde, sendo responsável pela síntese das novas moléculas de ADN.

Quanto ao termociclador em que ocorreu a PCR, este foi programado de acordo com as condições assinaladas na tabela 8.

Tabela 8: Condições do processo de amplificação do kit Investigator® DIPplex (Qiagen).

Temperatura Processo Tempo Número de ciclos 94°C Desnaturação inicial 4 min. -

94°C Desnaturação 30 seg.

30 ciclos 61°C Ligação dos primers 120 seg.

72°C Extensão dos primers 75 seg.

68°C Extensão final 60 min. -

4°C Conservação ∞ -

Normalmente, quando se utiliza amostras que possuem pouca quantidade de ADN, designadamente amostras com menos de 100 pg, utilizamos as condições descritas na tabela 8, mas, fazendo 32 ciclos em vez de apenas 30.

Após amplificação do produto extraído, as amostras foram armazenadas entre -30°C e -15°C e protegidas da luz ou passamos diretamente para a eletroforese capilar.

2.5.2. ELECTROFORESE CAPILAR DO PRODUTO AMPLIFICADO

A eletroforese é descrita como o movimento de espécies iónicas num meio condutor que está sob o efeito de um campo elétrico. A separação através da eletroforese ocorre segundo um princípio básico, em que diferentes moléculas ou as mesmas moléculas mas com diferentes tamanhos, que possuem cargas, movem-se a diferentes velocidades e, por isso, ocorre separação devido às suas cargas (Ban, Yoo e Song, 2015; Harrison et al., 1992; Siegel

et al., 2013; Sivapragasam, Pande e Grove, 2015; Stangegaard, Hansen e Morling, 2013;

Turkia et al., 2015).

Para se proceder à eletroforese capilar é necessário termos o produto amplificado, que não é mais do que uma mistura de fragmentos de ADN marcados por fluorescência que necessitam de ser separados com recurso a um sequenciador automático Genetic Analyzer 3130 xl (Applied Biosystems).

Assim, antes de se proceder à eletroforese capilar utilizamos uma placa de 96 poços, MicroAmp® Optical (Applied Biosystems), em que cada poço corresponde a uma amostra a

analisar. Preparamos, inicialmente, uma mistura com formamida Hi-DiTM (Applied

Biosystems) e com size standard, que corresponde ao marcador interno de peso molecular de 550 (BTO) (Qiagen) para um volume final por poço de 11,5 µL (Fondevila et al., 2012), com cerca de 0,5 µL de size standard e com 10 µL de formamida Hi-DiTM (Applied Biosystems). De seguida, a cada poço adicionamos 1 µL do produto da PCR ou 1 µL de ladder alélico, este último de modo a que seja possível identificar os alelos aquando da análise (tabela 9). Após, desnaturação durante cerca de 3 minutos a 95ºC no termociclador GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems), realizamos a eletroforese capilar.

Tabela 9: Volumes utilizados por reação para realizar a eletroforese capilar.

Reagente Volume por reação

Formamida Hi-DiTM 10 µL Size standard 550 (BTO) 0,5 µL ADN ou ladder alélico 1 µL

Quanto às condições da eletroforese capilar, estas correspondem às aconselhadas pelo fabricante do kit Investigator® DIPplex (Qiagen), com utilização do polímero POP 4® (Applied Biosystems).

2.5.3. DETEÇÃO E ANÁLISE DO PRODUTO AMPLIFICADO

A deteção do produto amplificado ocorreu via fluorescência através de um detetor acoplado ao capilar, sendo uma deteção multicolor. Esta foi realizada pela quantificação da fluorescência de fluorocromos marcados que estão incorporados em cada cadeia de ADN durante o processo de amplificação, os quais se ligam covalentemente aos fragmentos de ADN durante o processo de PCR, marcando assim as moléculas de ADN alvo com um fluoróforo ou fluorocromo. Os fluorocromos utilizados nestas reações absorvem a comprimentos de onda semelhantes, mas emitem a diferentes comprimentos de onda. Assim, um único laser pode ser utilizado para excitar quatro ou mais fluorocromos.

Os dados resultantes foram obtidos sob a forma de um eletroferograma e foram analisados usando o software GeneMapper® ver.3.2. (Applied Biosystems), de acordo com as indicações do fabricante (Ban, Yoo e Song, 2015).

2.6. ESTUDO DE MARCADORES Y-SNP