Microvariantes

Na análise dos eletroferogramas obtidos detetámos variações alélicas nos loci HLD92, HLD99 e HLD84, não descritas pelo fornecedor do kit Investigator® DIPplex (Qiagen), que influenciaram a interpretação dos genótipos dos indivíduos.

Para confirmar a variação obtida foi realizada a repetição da tipagem dos indivíduos. Para além disto, de modo a uma melhor interpretação deste tipo de fenómenos foram genotipados os filhos dos mesmos indivíduos, em que a paternidade foi confirmada, uma vez que, os mesmos fenómenos deveriam, em princípio, ser transmitidos à descendência.

3.1.1.1. Loci HLD92, HLD99 e HLD84

Relativamente às microvariantes, foram detetados picos out off ladder que apresentavam a mesma força de sinal que os picos dos restantes loci analisados com recurso ao kit Investigator® DIPplex (Qiagen).

No caso do locus HLD92, em heterozigotia, verificou-se que o pico correspondente à inserção do alelo apresenta um nucleótido a mais do que o descrito, isto é cerca de 91 pb em vez de 90 pb, tendo sido denominada a variante por D92+ (+1) (figura 18). Esta microvariante só ocorreu nas amostras de uma das populações estudadas, na população de imigrantes de Angola, em que o total de indivíduos era cerca de 258, com uma frequência de 0,0058.

1. 2.

Figura 18: Microvariantes detetadas aquando a análise dos marcadores InDel. Em 1.é possível observar o pico out off ladder D92+ (+1), detetado no painel correspondente à cor verde, com um nucleótido a mais do que

aquele que era esperado como se verifica em 2. para o ladder alélico.

Em relação ao locus HLD99, encontramos dois tipos de variações, uma em que o alelo correspondente à inserção apresenta um nucleótido a menos do que o descrito, isto é cerca de 111 pb em vez de 112 pb, tendo sido denominado por D99+ (-1) (figura 19, ponto 1.), outra em que o alelo correspondente à deleção apresenta um nucleótido a mais, isto é cerca de 109 pb em vez de 108 pb, tendo sido denominado por D99- (+1) (figura 19, ponto 2.). Relativamente a estas microvariantes, as mesmas foram detetadas em duas das populações em estudo, na população de imigrantes de Angola com uma frequência de 0,0078 e na população de imigrantes guineenses com uma frequência de 0,0122, em que o número total de indivíduos era de 123.

1. 2. 3.

Figura 19: Microvariantes detetadas aquando a análise dos marcadores InDel. Em 1. é possível observar o pico out off ladder D99+ (-1) e em 2. o pico out off ladder D99- (+1), ambos detetados no painel correspondente à cor

verde, com um nucleótido a menos e a mais, respetivamente, do que aquele que era esperado como se verifica em 3. para o ladder alélico.

Por último, no caso do locus HLD84, verificou-se que o pico correspondente ao alelo de inserção apresentava quatro nucleótidos a menos do que o descrito, isto é cerca de 136 pb em vez de 140 pb, tendo sido denominado por D84+ (-4) (figura 20). Esta foi a única microvariante detetada na população de imigrantes de Moçambique com cerca de 72 indivíduos, com uma frequência de 0,0069. Para além da população de imigrantes de Moçambique também foi detetada na população de imigrantes da Guiné-Bissau com uma frequência de 0,0163.

1. 2.

Figura 20: Microvariantes detetadas aquando a análise dos marcadores InDel. Em 1. é possível observar o pico out off ladder D84+ (-4), detetado no painel correspondente à cor vermelha, com um nucleótido a mais do que

aquele que era esperado como se verifica em 2. para o ladder alélico.

Como descrito na secção anterior, a confirmação dos genótipos dos loci HLD92, HLD99 e HLD84 nos indivíduos em que foram detetadas as microvariantes foi realizada através da repetição da genotipagem dos indivíduos e da genotipagem dos filhos dos mesmos. Através da repetição da genotipagem verificou-se que as microvariantes eram reprodutíveis e com a tipagem dos filhos destes indivíduos foi possível também verificar a reprodutibilidade das mesmas, uma vez que, ocorreu transmissão à descendência.

Outra forma de confirmação dos genótipos dos indivíduos e de estudar as microvariantes observadas seria através de sequenciação.

As microvariantes correspondentes aos loci HLD99 e HLD84 já se encontram bem caracterizadas sendo denominadas por microvariantes móveis (Fondevila et al., 2012, 2011; LaRue et al., 2012). Em ambos os casos são consideradas como um polimorfismo que se localiza na região em estudo, ou seja, são consideradas como um terceiro alelo de tamanho

diferente. Assim, a presença deste terceiro alelo nos respetivos loci descritos, permite um maior poder de discriminação do kit Investigator® DIPplex (Qiagen) entre os indivíduos estudados (Fondevila et al., 2012, 2011; LaRue et al., 2012).

Relativamente à microvariante HLD99+ (-1) esta já foi descrita e estudada por alguns autores e corresponde à mobilidade de um alelo que se encontra out off ladder, ou seja, cerca de 1 pb mais pequeno que o descrito para o alelo de inserção deste locus, sendo assim considerado como um alelo de inserção com deleção de uma única base. Esta constatação foi confirmada através de sequenciação da região em que se verificou a existência de deleção de uma adenina, presente a 4 pb a montante do alelo de inserção (Fondevila et al., 2012, 2011; LaRue et al., 2012).

Em relação à microvariante HLD84+ (-4), a sequenciação confirmou que o alelo out

off ladder dizia respeito a um alelo de inserção que possuía uma deleção de 4 pb (ATTA),

localizada a 10 bases a jusante do alelo de inserção (Fondevila et al., 2012, 2011; LaRue et

al., 2012).

Por último, relativamente à microvariante do locus HLD92, esta não foi ainda descrita em nenhum estudo e, de modo a caracterizá-la da melhor forma, deveria proceder-se à sequenciação do polimorfismo em questão.

3.2. CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DAS POPULAÇÕES EM ESTUDO COM