Marcadores genéticos em Genética Forense e em Genética Populacional

O genoma humano é constituído por sequências repetitivas (52%) e por sequências de cópia única (48%) (figura 8).

As sequências repetitivas incluem elementos genéticos móveis (44%), sequências simples repetidas (3%) e duplicações segmentares (5%). Por sua vez, os elementos genéticos móveis incluem Long Interspersed Elements - LINEs - (20%), Short Interspersed Elements - SINEs - (13%), Long Terminal Repeats - LTRs - (8%) e outras sequências de ADN (3%).

Relativamente às sequências de cópia única estas incluem ADN não repetitivo (26,5%) e genes (21,5%) que incluem intrões (20%) e regiões codificantes de proteínas (1,5%).

O genoma humano contém múltiplas sequências repetitivas, que existem em diversos tamanhos e que, habitualmente, são designadas pelo número de repetições da unidade de repetição (Alberts, 2008).

A identificação genética individual é o modo de se estabelecer a identidade de um indivíduo a partir de amostras biológicas (Pinheiro, 2010). A identificação genética individual é realizada, maioritariamente com recurso aos STR, uma vez que estes são marcadores bastante informativos, no entanto, em alguns casos mais complexos, a análise destes marcadores não é suficiente para se alcançar uma identificação individual positiva, sendo necessário o estudo do ADN mitocondrial (ADNmt) ou o estudo de outro tipo de polimorfismo de ADN, como por exemplo, SNP.

Os polimorfismos referidos correspondem a variações ao nível da sequência e ao nível do tamanho da molécula de ADN. Assim basicamente existem duas formas de polimorfismos, os polimorfismos de sequência e os polimorfismos de comprimento. Os polimorfismos de sequência consistem numa troca de uma base por outra e os polimorfismos de comprimento são variações na molécula de ADN como consequência de uma deleção ou inserção de uma ou mais bases, bem como no número de unidades de repetição de um determinado motivo ou sequência.

1.7.1. MARCADORES DO TIPO STR

Os marcadores do tipo short tandem repeat (STR) são os marcadores de eleição na rotina forense, uma vez que preenchem requisitos indispensáveis para serem utilizados como marcadores forenses, designadamente, são extremamente sensíveis, possuem elevado grau de polimorfismo, são muito discriminativos e estão disponíveis em kits que requerem quantidades mínimas de ADN e podem ser facilmente amplificados mediante a reação em cadeia da polimerase, PCR.

Os STR são também conhecidos como microssatélites e consistem em pequenos blocos de nucleótidos que se repetem em tandem, com cerca de 2 a 7 pares de base (pb). O número de repetições varia, geralmente, entre 2 e 40, ou seja, repetem-se em tandem de 2 a 40 vezes. Os STR são designados conforme o tamanho da unidade de repetição e podem ser mono-, di-, tri-, tetra-, penta- ou mesmo hexanucleotídicas, sendo que as repetições de blocos tetranucleotídicos são os mais utilizados na identificação humana (Butler, 2012), pois as suas

15% do alelo real, enquanto nos casos de blocos com unidades di- e tri- nucleotídicas as

stutters apresentam picos com altura que chega a cerca de 30% ou mais do alelo real,

dificultando assim a interpretação nos casos em que ocorram misturas de material biológico (Butler, 2010, 2012).

Existem STR autossómicos e STR nos cromossomas sexuais, STR do cromossoma Y e STR do cromossoma X. Normalmente em estudos forenses são utilizados os marcadores autossómicos, a razão mais óbvia para a sua utilização é devido ao facto de serem utilizados na identificação de indivíduos quer do sexo masculino quer do sexo feminino (Ramachandran

et al., 2004). Quanto aos marcadores dos cromossomas sexuais, são herdados num conjunto

designado por haplótipo, devido ao facto de se localizarem muito próximos uns dos outros, não segregando de uma forma independente (Buckleton, Krawczak e Weir, 2011).

Apesar de possuírem inúmeras vantagens também possuem algumas limitações, mais significativas, por exemplo, aquando da utilização em misturas de amostras, como é o caso de amostras provenientes de crimes sexuais, em que há uma probabilidade elevada de ocorrer uma mistura de perfis. Nestes casos os STR do cromossoma Y, são uma boa alternativa, uma vez que estes marcadores produzem apenas perfil dos indivíduos do sexo masculino (Leat et

al., 2004). Relativamente aos STR do cromossoma X, estes são úteis em casos de

investigação de maternidade e em casos de paternidade complexos, em que o pretenso pai se encontra ausente, sendo importante ter em conta que o poder de discriminação destes varia com o género ao qual pertence a amostra biológica (Pinheiro, 2013).

Em suma, os STR autossómicos são utilizados pela Genética Forense, uma vez que, possuem um poder de discriminação elevado, encontram-se em diferentes cromossomas; e quando se encontrarem no mesmo cromossoma são selecionados os que se localizam distantes uns dos outros (Imad et al., 2014). Para além destas características apresentam elevada robustez e reprodutibilidade dos resultados quando se realiza um ensaio em multiplex e apresentam baixa taxa de mutação.

1.7.2. MARCADORES DO TIPO SNP

Os marcadores do tipo Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) envolvem tipicamente substituições de uma base nucleotídica na sequência de ADN, resultante de uma troca, deleção ou inserção de um nucleótido, surgindo de uma mutação pontual e são considerados como polimorfismos de posição (figura 9).

Apesar do número elevado de SNP existentes no genoma humano, 1 SNP por cada 200 a 300 pares de base, a taxa de mutação destes é inferior à dos marcadores do tipo STR, daí que possam ser utilizados para distinguir populações, para definir a história geográfica de determinada população, sendo também utilizados em identificação humana (Costa et al., 2008; Pinheiro, 2010; Vignal et al., 2002).

Figura 9: Exemplo de um SNP em que é possível observar que a sequência de ADN 1 é diferente da sequência de ADN 2, num único par de base, C-G e T-A (Fonte: Pinheiro, 2010).

Os SNP, em termos forenses, são utilizados principalmente para obter informação de amostras em que o ADN se encontra degradado, uma vez que, apenas é necessário uma pequena região alvo do ADN, pois o tamanho dos produtos amplificados tem menos de 100 pb, tratando-se de um estudo mais viável do que o estudo de STR. Apenas é estudado um único nucleótido com este tipo de marcadores, em vez de uma quantidade elevada de nucleótidos como nos STR.

Uma das vantagens que os SNP apresentam é taxa de mutação mais baixa que os STR, cerca de 100 000 vezes mais baixa, sendo assim possível afirmar que os SNP são mais estáveis em termos de transmissão à descendência, o que é útil na Genética Forense. Para além disso, podem ser também amplificados em multiplex e não produzem stutters, ou artefactos de amplificação. Por fim, podem ser utilizados para a determinação da origem étnica do indivíduo a que pertence a amostra (Amorim e Pereira, 2005; Costa et al., 2008; Pinheiro, 2010).

Para além das vantagens da utilização deste tipo marcadores, quando comparados com os STR, possuem diversas desvantagens, tal como o número de loci estudados necessários,

uma vez que, estes não são polimórficos como os STR, são bialélicos e, por esse motivo, não são tão informativos quanto outros marcadores e daí serem necessários mais SNP para atingir o poder de discriminação dos STR, cerca de 60 a 100 SNP equivalem ao poder de discriminação de 13 a 15 STR e para além desta desvantagem, também tornam muito complexa a interpretação de misturas de ADN, pois é difícil a distinção dos perfis de cada contribuidor da mistura (Amorim e Pereira, 2005; Butler, Coble e Vallone, 2007; Jobling e Gill, 2004; Zha et al., 2012).

Os SNP de aplicação forense podem ser divididos em quatro tipos distintos: SNP para identificação individual, que têm como principal objetivo complementar a informação obtida pelos STR, sendo os SNP mais indicados para a identificação aqueles que possuem maior heterozigotia, porque quanto maior esta for, menos SNP são necessários para identificar um indivíduo; SNP para a identificação de linhagens, SNP do cromossoma Y (linhagem paterna) e do ADNmt (linhagem materna) de herança uniparental e que não sofrem recombinação genética; SNP de ancestralidade, que permitem inferir acerca da origem geográfica de um dado indivíduo e, normalmente, são característicos de determinada população; e SNP de inferência de características físicas, envolvidos na determinação de características fenotípicas.