I.4.4.1 Actividade antibacteriana
Para a determinação da concentração bactericida mínima (MBC) dos extractos de diclorometano (EBD) e de etanol (EBE), da (+)cicloeucalenona (24), da (+)-24-oxo-31-norcicloartanona (107) e da cernumidina (109) foram utilizadas diferentes estirpes de bactérias Gram- (Escherichia coli (ATCC 9637), Salmonella enterica (ATCC 14028), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Helicobacter pylori (ATCC 700392) e estirpes de bactérias Gram+ (Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Bacillus cereus (ATCC 11778), Enterococcus faecalis (ATCC 29212).
A actividade antibacteriana dos extractos EBD, EBE e dos compostos 24, 107 e 109 foi testada segundo o método de microdiluição do meio. Foram preparadas soluções do EBD, do EBE, e dos compostos 24, 107 e 109 em dimetilsulfóxido de concentrações 200 mgmL-1 e de 2 mgmL-1, respectivamente. A microdiluição do meio foi realizada com o meio Muller-Hinton (Oxoid, UK) usando o soro fetal de vitela (Cultilab, Brasil) como suplemento. Foram preparadas diluições, em duplicado, numa gama de concentrações de 0,6 a 50 mgmL-1 para EBD e EBE e de 200 a 3,12 mgmL-1 para os compostos isolados.
As estirpes de bactérias foram ajustadas de modo a obter-se uma concentração final de 1,0106 CFU por poço. Foram aplicados 2L de cada amostra em cada placa de agar Muller-Hinton (Oxoid, UK) de modo a determinar a MBC. As placas foram observadas entre 24 a 48 horas após a incubação. Todos os ensaios foram realizados em duplicado usando antibióticos (de concentração superior a 1 mg/mL) como controle interno positivo. O valor da concentração bactericida mínima (MBC) representa a menor concentração que mata pelo menos 99,9% do inóculo original. Os resultados são os valores coincidentes de pelo menos três ensaios independentes.
I.4.4.2 Actividade anti-neoplásica
Para a determinação da actividade antiproliferativa da (+)cicloeucalenona (24), da (+)-24-oxo- 31-norcicloartanona (107), da (+)24-(1,3-dioxietano)-31-norcicloartanona (108) e da cernumidina (109) foram utilizadas linhas celulares de diferentes origens histológicas. As linhas celulares humanas de UACC-62 (melanoma), MCF-7 (mama), NCI-H460 (pulmão, células não pequenas), K-562 (leucemia), OVCAR-3 (ovário), PC-3 (próstata), HT-29 (colon), 786-O (renal), NCI-ADR/RES (fenotipo do ovário que expressa multi-resistência) e U251-glioma foram fornecidas pelo National Cancer Institute (NCI, Frederick, Maryland, USA). As culturas de células stock foram desenvolvidas num meio de cultura de 5 mL RPMI-1640 (Gibco, NY, USA) com um suplemento de soro bovino fetal 5% (Gibco). Foi adicionada uma solução de gentamicina (50 g/mL) a todas as culturas experimentais. Foi utilizado doxirrubicina como fármaco de referência dos ensaios proliferativos.
Foram colocadas culturas de células em microplacas estéreis de 96 poços (100 L de células/poço variando a gama de densidade de inoculação entre 4 e 7x104 células/mL). As culturas de células foram expostas a várias soluções de compostos em RPMI/DMSO com concentrações 0,25, 2,5, 25 e 250 g/mL a 37 oC, 5% de CO
2 no ar durante 48 horas. A concentração final de DMSO (Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA) não afectou a viabilidade celular. As placas foram então incubadas numa solução 50% de TCA (Merck, SP, Brasil) durante 30 minutos a 4 oC para a fixação celular. Após lavagem e secagem, a proliferação celular foi determinada por quantificação espectrofotométrica (540 nm) do conteúdo celular proteico usando como corante sulforodamina B (SRB) (Sigma). Os dados de absorvância foram usados para calcular a inibição de crescimento total (TGI), a inibição de crescimento 50 (GI 50) e a concentração letal 50 (LC 50) através de uma regressão paramétrica sigmoidal usando o software Origin 7.1.
Actividade para moléculas alvo pertencentes à rede de sinalização
I.4.4.3 Produção da citoquina TNF- em células de macrófagos diferenciados THP-1
A produção de citoquina TNF- pro-inflamatória foi quantificada em sobrenadantes de macrófagos diferenciados THP-1 da fase monocítica por adição de PMA (200 nM, 24 horas). Foi realizado um ensaio de imunoabsorção enzimática(ELISA) de acordo com as especificações de um kit
comercial (e-Biosciences, Biomol, PA, USA). As células foram previamente estimuladas com LPS (1 gmL-1). Foram utilizadas soluções de (+)-cicloeucalenona (24) (50 gmL-1), (+)-24-oxo-31- norcicloartanona (107) (15 gmL-1) e da cernumidina (109) (50 gmL-1) e utilizada uma solução de dexametasona (3,4 g/mL) como controle anti-inflamatório. Os resultados foram expressos em pgmL- 1 de TNF-.
I.4.4.4 Expressão da COX-2 em células diferenciadas THP-1
Para a determinação da expressão proteica da ciclooxigenase-2 (COX-2), em primeiro lugar, a concentração proteica do homogenato foi determinada de acordo com o método colorimétrico de Bradford. Aliquotas de sobrenadante contendo teores proteicos idênticos a 50 g foram separados em gel de acrilamida a 10% por electroforese em gel de poliacrilamida-SDS (sodium dodecyl sulfate). As proteínas foram então transferidas por electroforese para uma membrana de nitrocelulose e incubadas com anticorpos primários específicos: COX-2 (M-19, Santa Cruz Biotechnology, CA) a uma diluição de 1:1500. Cada filtro foi lavado 3 vezes durante 15 minutos e incubado com o anticorpo secundário (para COX-2) anti-cabra associado à peroxidase de rábano silvestre. De modo a provar igual carga, a mancha foi analizada para a expressão da -actina usando um anticorpo anti--actina (Sigma-Aldrich, Mo, USA). A imunodetecção foi realizada usando um kit detector de luz de quimioluminescência acrescida (Supersignal, West pico Chemilumenescent Sustrate Pierce, IL., USA). Para a determinação foram realizados três ensaios independentes. Os dados de densitometria foram calculados de acordo com a normalização com o controle (house-keeping gene). Os sinais foram analizados e quantificados (ImageJ, Image Analysis Software).
I.4.4.5 Actividade da Sirtuína 1 (SIRT1)
O efeito da (+)-cicloeucalenona (24), da (+)-24-oxo-31-norcicloartanona (107), da cernumidina (109) na actividade enzimática da sirtuína 1 (SIRT1) foi determinada com um kit comercial (AK-555, SIRT 1 Fluorimetric Drug Discovery Kit, BIOMOL, PA, USA) que mede a actividade da lisil desacetilase do recombinante humano da SIRT1 que utiliza como substracto o péptido humano p53 que compreende os aminoácidos 379-382: Arg-His-Lis-Lis(Ac). O sinal de fluorescência do ensaio gerado é proporcional à desacetilação da lisina Lis-382, o qual é um alvo in vivo da actividade da sirtuína 1. O ensaio procede em dois passos: o substracto que compreende a sequência de aminoácidos p53-(Ac) é incubado com o recombinante humano SIRT1 juntamente com o co-substracto NAD+. Um produto do
sirtuína, e a suramina de sódio, um inibidor, como controles positivos. A fluorescência das amostras foi lida num fluorímetro leitor de microplacas, na gama de 350 a 380 nm e a detecção da luz emitida foi realizada na gama 450-480 nm em intervalos de 5 minutos. Foram realizados ensaios com soluções (+)-cicloeucalenona (24), da (+)-24-oxo-31-norcicloartanona (107) e de cernumidina (109) de concentrações de 50 gmL-1, 5 gmL-1 e 0,5 gmL-1. Os resultados correspondem à média de três ensaios independentes e são expressos como percentagens (%).
I.4.4.6 Efeitos inibidores na produção de interleuquina 8 (IL-8) em células HT-29
As células HT-29 (células do adenocarcinoma do cólon humano) foram fornecidas pela Unidade de Cultura de células da Universidade de Granada (Granada, Espanha) e foram cultivadas no meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com um suplemento de 10% de FBS e de 2mM de l- glutamina, numa atmosfera de 5% de CO2 humidificada a 37 oC. As células foram estimuladas com LPS (100 ngmL-1) e simultaneamente tratadas com soluções em DMSO de cernumidina (109) de diferentes concentrações (1 M, 10 M e 50 M). Após 24 horas , os sobrenadantes foram recolhidos, centrifugados a 10,000g durante 5 minutos e guardados a -80 oC até à determinação de interleucina 8 (IL-8) por ELISA (Biosource, Invitrogen TM). Os resultados são expressos como percentagem de inibição (meansem) quando comparados com a produção máxima de IL-8 em células sem tratamento.