Continuando a busca por novos precursores gênicos de ciclotídeos em plantas presentes no bioma Cerrado, após investigação da família Rubiaceae (primeiro grupo vegetal a ter ciclotídeos e seus genes elucidados), a espécie Hybanthus lanatus (Figura 36) foi escolhida como representante da família Violaceae (grupo vegetal detentor da maior diversidade e abundancia de sequências de ciclotídeos e de seus genes produtores depositadas em bancos de dados), devido à baixa ocorrência de espécies da família Violaceae no bioma Cerrado, sendo esta a única encontrada nas áreas utilizadas para coletas.
Figura 36 - Fotos da planta Hybanthus lanatus, encontrada no Cerrado. Em evidência, suas folhas
pequenas, finas e pilosas, as quais foram utilizadas nos experimentos.
Como não havia nenhuma evidência de ciclotídeos na família Violaceae no continente Americano, todo o trabalho desenvolvido com H. lanatus foi norteado por sequências completas de mRNA de genes produtores de precursores de ciclotídeos isoladas de outras espécies da mesma família. Em torno de 40 sequências de genes completos foram utilizadas em múltiplos alinhamentos, realizados pelo software ClustalW2, na busca por regiões conservadas para o desenho de oligonucleotídeos iniciadores.
Estudos anteriores evidenciaram a existência de regiões conservadas no início dos genes de Violaceae, como uma sequência presente no ER-Signal codificante dos aminoácidos AAFALPA, presente na maioria das espécies de Violaceae já estudadas (SIMONSEN et al., 2005). Utilizando esta região como alvo para o desenho de iniciadores, vários precursores de ciclotídeos semicompletos foram elucidados (HERRMANN et al., 2008; ZHANG et al., 2009; BURMAN et al., 2010), facilitando assim a busca por novas sequências de ciclotídeos sem a necessidade de evidencias proteicas, sendo possível isolar precursores quase completos com apenas uma etapa de amplificação, clonagem e
sequenciamento, aumentando a eficiência das pesquisas na área de biologia molecular de genes de ciclotídeos.
Baseados nesses dados, através dos múltiplos alinhamentos realizados com as sequências pertencentes às espécies Melicytus ramiflorus, Viola baoshanensis e Viola odorata, regiões conservadas localizadas no início dos genes foram selecionadas para o desenho de 8 oligonucleotídeos iniciadores no sentindo senso, utilizando o mínimo de degenerações possível, sendo que dos oito, apenas três possuíam degenerações.
Assim, as folhas de H. lanatus foram utilizadas no processo de extração de RNA total através do uso de TRIzol® Reagent (Ambion), seguindo as especificações do fabricante. Após extração, o RNA total foi quantificado através de metodologia fluorimétrica Qubit (Invitrogen) e sua integridade e qualidade foram aferidas por eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo (Figura 37).
Figura 37 - Eletroforese em gel de agarose 1% da extração de RNA total de H. lanatus através do
uso de TRIzol® Reagent (Ambion). Nos poços foram aplicados: (1) Marcador 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen), onde os números ao lado indicam o tamanho relativo das bandas em pares de base; (3) extração de RNA de H. lanatus, contendo 130 ng.
Após a visualização em gel de agarose, foi possível perceber que o processo de extração mostrou-se eficiente, rendendo um RNA total de qualidade, apresentando bandas íntegras, sem degradação aparente do RNA ribossomal (rRNA) (rRNA nuclear: 25/26S e 17/18S; rRNA de cloroplasto: 23S e 16S; e rRNA mitocondrial: 18S). Porém, uma contaminação com DNA foi observada, devido à aparição de uma banda alta, acima do maior fragmento do marcador de tamanho de DNA. Então, o RNA extraído foi submetido novamente ao processo de extração de RNA total através do InviTrap® Spin Plant RNA Mini Kit, para limpeza e tratamento com DNAse I (RNase-Free DNase Set).
1 2 3 1000 850 650 500 400 300 200 100
A partir deste RNA fita simples foi sintetizada a primeira fita de DNA complementar (cDNA) através do SuperScript® II Reverse Transcriptase Kit (Invitrogen™), do qual foi utilizado 1 µL como molde em amplificações por PCR, contendo 0,5 µM de cada iniciador desenhado para busca em Violaceae (MrF1, VbF1-4 e VoF1-3), e do Oligo-dT. Devido à grande quantidade de primers para serem testados, o volume de cDNA seria insuficiente para testes com várias temperaturas de anelamento para cada primer. Assim, todas as reações foram configuradas com 55 ºC de temperatura de anelamento e realizadas com tempo de 1 min de extensão, levando em consideração que o maior precursor completo de ciclotídeos conhecido em Violaceae possui 300 aminoácidos (Vtt1), o qual é produzido por V. tricolor e é do tipo triplo, codificado por um mRNA de aproximadamente 900 pb (GRUBER et al., 2008), na tentativa de amplificação de algum gene semicompleto de tamanho desconhecido.
Nenhuma amplificação foi observada nas reações contendo os primers MrF1, VbF1, VbF2, VbF4, VoF2 e VoF3. Apenas apresentaram resultado positivo as reações decorrentes da utilização do primer VbF3, onde foi possível a visualização de quatro bandas com tamanho aparente variando entre 300-650 pb, e VodorataF1, onde foi possível a visualização de uma banda de aproximadamente 600 pb (Figura 38).
Figura 38 - Eletroforese em gel de agarose 1% da amplificação por PCR de cDNA de H. lanatus
utilizando primers de Violaceae, com 55 ºC de temperatura de anelamento e 1 min de extensão. Nos poços foram aplicados: (1) Marcador 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen), onde os números ao lado indicam o tamanho relativo das bandas em pares de base; (2) PCR sem DNA molde, como controle negativo; (3) PCR com conjunto de primers VbF3+Oligo-dT, onde as setas vermelhas indicam a posição dos produtos de amplificação; e (4) PCR com conjunto de primers VoF1+Oligo-dT.
Como a amplificação contendo os primers VbF3+Oligo-dT apresentou baixa eficiência, apresentando bandas fracas no gel, novas reações foram realizadas com
1 2 3 1000 850 650 500 400 300 200 100 4
intenção de intensificar a quantidade de produto em cada banda, para que a quantidade de DNA presente em cada uma fosse suficiente para excisão, purificação e clonagem. Contudo, nenhuma variação nas condições de PCR testadas foi satisfatória, indicando que provavelmente estas bandas eram inespecíficas para este iniciador, impossibilitando a utilização destes fragmentos nas etapas subsequentes do projeto.
Assim, com a apresentação de apenas uma banda no gel proveniente da reação contendo os iniciadores VoF1+Oligo-dT, o produto desta PCR foi purificado com o GeneJET™ PCR Purification Kit (Fermentas) e o fragmento foi inserido no vetor pGEM®-T, incubando a reação de ligação a 4ºC overnight. Após a ligação, o plasmídeo foi utilizado para transformação de cepas E. coli XL1-Blue por eletroporação, conforme discriminado na metodologia. Depois de transformadas e plaqueadas, 11 colônias foram selecionadas. Para confirmação da presença dos insertos, as colônias selecionadas foram utilizadas como molde em PCR de colônia, revelando a presença de insertos de diferentes tamanhos entre as colônias (Figura 39).
Figura 39 - Eletroforese em gel de agarose 1% da amplificação dos insertos por PCR das colônias
selecionadas, utilizando o conjunto de primers SP6+T7. Nos poços foram aplicados: (1) Marcador 1
Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen), onde os números ao lado indicam o tamanho relativo das bandas
em pares de base; (2) ao (12) amplificação dos insertos das colônias selecionadas.
Como era anteriormente conhecido o tamanho do produto de PCR (~600 pb), somado ao fragmento de vetor pGEM®-T e aos iniciadores SP6 e T7 (~170 pb), apenas os clones contendo insertos superiores a 600 pb foram submetidos ao processo de extração de DNA plasmidial e sequenciados, totalizando 6 amostras. Cada plasmídeo foi sequenciado em triplicata para cada primer (SP6 e T7), resultando em 18 sequências para cada primer, totalizando 32 sequências. Destas, 30 sequências exibiram qualidade suficiente para serem analisadas. 1000 850 650 500 400 300 200 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
O resultado do sequenciamento foi analisado através do programa DNA Baser Sequence Assembler, onde foi possível a remoção das regiões do vetor pGEM®-T e construção de uma sequência consenso para cada clone, as quais foram traduzidas in silico pelo programa BioEdit, confirmando a presença da mesma sequência em todas as colônias, sendo esta positiva para um precursor de ciclotídeo completamente novo. A sequência do mRNA apresentou uma ORF incompleta de 309 nucleotídeos, revelando a organização de um precursor semicompleto de ciclotídeo, o primeiro do continente Americano encontrado na família Violaceae, codificando uma proteína de 102 aminoácidos. Este novo precursor encontrado, nomeado Hyla1 (Hybanthus lanatus 1), apresenta a mesma configuração geral de um típico precursor de ciclotídeo, possuindo um peptídeo sinal para o reticulo endoplasmático (ER-Signal) com 16 aminoácidos elucidados, um pró-domínio N-terminal (NTPD) com 36 aminoácidos, um domínio de repetição do N-terminal (NTR) com 15 aminoácidos, um domínio do ciclotídeo maduro (MCD) com 31 aminoácidos (contendo a sequência de um ciclotídeo inédito) e um domínio C-terminal (CTR) com 4 aminoácidos (Figura 40).
Figura 40 - Sequência semicompleta do gene Hybanthus lanatus 1 (Hyla1), contendo uma ORF de
309 nucleotídeos, a qual codifica in silico o precursor proteico de um novo ciclotídeo, contendo os domínios ER-Signal, NTPD, NTR, MCD e CTR. As letras em vermelho indicam o códon terminador (TAA).
Este novo precursor elucidado foi isolado através da utilização de primers com alvos no início dos genes, confirmando o alto nível de conservação existente no ER-Signal dos genes ciclotídeos em espécies de Violaceae, pois o iniciador VoF1 foi desenhado contra uma região anterior à codificante da sequência AAFALPA, revelando outra região com potencial para o desenho de primers (SIMONSEN et al., 2005; GRUBER et al., 2008). A região AAFALPA é bastante comum em genes de Violaceae, sendo encontrada somente em genes desta família, onde vários precursores foram isolados através de primers
GTTGGGCTCTTCCTCATTGCCGCCTTGGCTCTTCCGGCTCTCGCAACCTTTGAGAAAGATGTGATC ACTGCTGAAACCATGCAGGCAGTTCTTGAGAAAACTGGAGGAGGTAATGCCATTAACCTTCTTCTT AACAGCAAGACCATTATCTCTAAAACCGTGCTCGAGGAGGCACTCATTAAGACCGATCATTCTGCA AATGGTGTTATTCCTTGTGGTGAAAGTTGTGTGTTCATTCCATGCATCTCTAGCTTCCTTGGGTGC TCTTGCAAGAACAAGGTTTGCTACAGGAACTCCCTCGTTATTTAA ER-Signal NTPD CMD CTR Sequência de Nucleotídeos Sequência de Aminoácidos NTR VGLFLIAALALPALATFEKDVITAETMQAVLEKTGGGNAINLLLNSKTIISK TVLEEALIKTDHSANGVIPCGESCVFIPCISSFLGCSCKNKVCYRNSLVI
desenhados contra essa região, como os precursores de Gloeospermum blakeanum, Gloeospermum pauciflorum, Hybanthus floribundos, Viola biflora e um precursor de Viola tricolor (SIMONSEN et al., 2005; GRUBER et al., 2008; HERRMANN et al., 2008; BURMAN et al., 2010). Além disso, uma variação da sequência AAFALPA foi identificada neste gene, AALALPA, a qual nunca havia sido observada. Variações dessa região ocorrem em alguns genes de Violaceae, onde todas as variantes encontradas até a atualidade estão representadas na Figura 41.
Figura 41 - Alinhamento realizado pelo software ClustalW2 entre o precursor de ciclotídeo isolado de
H. lanatus (Hyla1) e outros precursores simples da família Violaceae, com destaque para região
contendo a sequência AAFALPA, presente em grande parte dos precursores desta família, representados por Gbc6, produzido por G. blakeanum. Os outros precursores representam todas as variações existentes nessa região, comparando aqueles que apresentam uma modificação, como Hyla1 (H. lanatus) e Hyfl K (H. floribundos), duas modificações, como VbPC1 e VbCP2a (V.
baoshanensis) e Voc3 (V. odorata), ou três modificações, como VbCP3d (V. baoshanensis) e Mra13
(M. ramiflorus). Os resíduos destacados em vermelho evidenciam as diferenças existentes nas sequências em relação à AAFALPA.
Este novo precursor elucidado é do tipo simples, ou seja, contém apenas um domínio de ciclotídeo, comum em espécies da família Violaceae, como, por exemplo, os precursores Gbc1-6 e Gpc1-4 presentes no gênero Gloeospermum, Hyfl D-E e Hyfl I-M presentes algumas espécies do gênero Hybanthus, Mra13 e Mra20-26 presentes em Melicytus ramiflorus. Este tipo de precursor também é encontrado em espécies do gênero Viola, como, por exemplo, VbPC1-5 presentes em V. baoshanensis, Voc1-3 e Vov1 presentes em V. odorata e Vbc1-6 presentes em V. biflora (DUTTON et al., 2004; SIMONSEN et al., 2005; IRELAND; COLGRAVE; CRAIK, 2006; HERRMANN et al., 2008; TRABI et al., 2009; ZHANG et al., 2009; BURMAN et al., 2010). Além de apresentar o mesmo tipo de precursor, Hyla1 possui alta similaridade com diversos precursores encontrados em outras espécies de Violaceae, exibindo até 75% de identidade máxima quando comparados com precursores do gênero Gloeospermum e Melicytus.
Através da tradução in silico do precursor Hyla1 foi possível analisar a sequência do novo ciclotídeo presente em seu MCD, contendo 31 resíduos de aminoácidos e nomeado
Gbc6 AAFALPALATFEKDVITPETIQAVLKRTAP-LSNIMLEGDAIN-ALITGKTVISKTVLEEALLKNDGLG-- Hyla1 AALALPALATFEKDVITAETMQAVLEKTG---GGNAIN-LLLNSKTIISKTVLEEALIKTDHSAN- Hyfl K AAFVLPAIATLEKDVITPKAIELILKKTNTPLSNITLQDDALVNALVKSKTMISNTVFEEALLKHSNHGLG VbCP2a ATFALPPLATFEKYFITTEAVRAILQKTNS---NAMPSENAIN--ALTGKTLISSVVLEEALLKNLDHGRN VbCP1 ATFALPTLATFEKDFITTEAVRAILKKTNA---NVMPSEDVIN--ALTGKTVISNVVLEETLVMKLDNGLT Voc3 ATFALPSLATFEKDFITPETIQAILKKSAP-LSNIMLEEDVIN-ALLKSKTVISNPIIEEAFLK-NSNGLN VbCP3d ATFVLPSLATFEKDFITPETIQAILKKSAP-LSNIMLEEDVIN-ALLKSKTVISNPIIEEAFLK-NSNGLN Mra13 ATFATAAFAALDKDAITPGAIHALSKSMKL---PTDAVN-VLTKSKTLVSPTKLAEEFLNDANDGVN
de hyla-br1 (Figura 33). Este novo ciclotídeo exibe grande similaridade com outros produzidos por espécies da família Violaceae quando alinhados, onde poucas variações são encontradas, com identidade máxima variando entre 90% e 97% (Figura 42).
Figura 42 - Alinhamento realizado pelo software ClustalW2 entre o novo ciclotídeo hyla-br1 e outros
ciclotídeos da família Violaceae: mra23 (Melicytus ramiflorus), cicloviolina A (Leonia cymosa), globa B (Gloeospermum blakeanum) e viba 7 (Viola baoshanensis). As barras amarelas destacam os resíduos de Cisteína, os quais delimitam os loops (L1-L5). Os resíduos destacados em vermelho evidenciam as diferenças existentes nas sequências em relação à hyla-br1.
As diferenças encontradas entre hyla-br1 e os outros ciclotídeos da família Violaceae durante o alinhamento concentram-se em sua maioria no loop 3, onde todas as substituições são marcadas por aminoácidos hidrofóbicos (alanina, valina e isoleucina), sendo apenas uma diferença encontrada no loop 5, onde ocorre a substituição de uma asparagina por uma serina, dois aminoácidos pertencentes ao mesmo grupo bioquímico (polares não carregados). Além do mais, assim como os outros ciclotídeos similares, hyla- br1 também não possui uma cis-prolina no loop 5, sendo então classificado na subfamília Bracelete.
Dentre os ciclotídeos que apresentaram maior similaridade com hyla-br1, viba 7 e mra23 também possuem apenas sequências preditas a partir da tradução in silico de mRNA isolado, sem evidências proteicas e, consequentemente, sem atividades biológicas in vitro conhecidas. O mesmo acontece com o ciclotídeo globa B, isolado de Gloeospermum blakeanum, o qual também teve seu gene codificador clonado, entretanto, não possui atividade biológica conhecida. No caso da cicloviolina A, purificada de extratos naturais de Leonia cymosa, nenhum gene codificador deste ciclotídeo foi elucidado, mas é o único que possui atividade biológica conhecida: anti-HIV (HALLOCK et al., 2000). No estudo realizado por Hallock e colaboradores, as cicloviolinas A-D foram purificadas e avaliadas contra HIV- 1. Todas apresentaram atividades semelhantes, sendo então sugerido pelos autores que as variações existentes entre as sequências de aminoácidos dos quatro ciclotídeos não interferem significativamente no perfil de atividade. Contudo, a sequência da cicloviolina A apresenta maior similaridade à hyla-br1 do que quando comparada às outras cicloviolinas,
L1 L2 L3 L4 L5
Hyla-br1 GVIPCGESCVFIPCISSFLGCSCKNKVCYRN 31
Mra23 GVIPCGESCVFIPCISSVLGCSCKNKVCYRN 31
Cicloviolina A GVIPCGESCVFIPCISAAIGCSCKNKVCYRN 31
Globa B GVIPCGESCVFIPCISAVLGCSCKSKVCYRN 31
Viba 7 GVIPCGESCVFIPCISSVIGCSCKSKVCYRN 31
sendo possível assim sugerir uma possível atividade biológica para o novo ciclotídeo encontrado (Figura 43).
Figura 43 - Alinhamento realizado pelo software ClustalW2 entre o novo ciclotídeo hyla-br1 e as
cicloviolinas A-D, isoladas de Leonia cymosa (Violaceae).
Para obtenção da sequência completa do gene codificante do precursor Hyla1, o RNA total de H. lanatus foi submetido à síntese de cDNA dupla-fita através do ExactSTART™ Eukaryotic mRNA 5'- & 3'-RACE Kit (Epicentre). Para ser utilizado na amplificação da extremidade 5' deste cDNA, inicialmente, um oligonucleotídeo iniciador no sentido antisenso foi desenhado dentro da região 3'-UTR da sequência (Hl5R), logo após o códon terminador (Figura 44).
Figura 44 - Sequência semicompleta de nucleotídeos do gene Hyla1. As letras em vermelho
representam o códon terminador, e a região destacada em azul representa o local de anelamento do oligonucleotídeo iniciador no sentido antisenso (Hl5R).
Em amplificações por PCR foi utilizado 1 µL de cDNA como molde, contendo 0,5 µM dos primers (Primer1+Hl5R). As reações foram configuradas com 60 ºC de temperatura de anelamento e realizadas com tempo de 1 min de extensão, já que se trata de um gene com região 5'-UTR de tamanho desconhecido. O resultado foi a amplificação de um fragmento com tamanho aproximado de 500 pb (Figura 45).
Hyla-br1 GVIPCGESCVFIPCISSFLGCSCKNKVCYRN 31
Cicloviolina A GVIPCGESCVFIPCISAAIGCSCKNKVCYRN 31
Cicloviolina D G-FPCGESCVFIPCISAAIGCSCKNKVCYRN 30
Cicloviolina C G-IPCGESCVFIPCLTTVAGCSCKNKVCYRN 30
Cicloviolina B G-TACGESCYVLPCFT--VGCTCTSSQCFKN 28
* .***** .:**:: **:*... *::*
GTTGGGCTCTTCCTCATTGCCGCCTTGGCTCTTCCTGCTCTCGCAACCTTTGAGAAAGATGTGAT 65 CACTGCTGAAACCATGCAGGCAGTTCTTGAGAAAACTGGAGGAGGTAATGCCATTAACCTTCTTC 130 TTAACAGCAAGACCATTATCTCTAAAACCGTGCTCGAGGAGGCACTCATTAAGACCGATCATTCT 195 GCAAATGGTGTTATTCCTTGTGGTGAAAGTTGTGTGTTCATTCCATGCATCTCTAGCTTCCTTGG 260 GTGCTCTTGCAAGAACAAGGTTTGCTACAGGAACTCCCTCGTTATTTAAGACCTGATTAGCTGGG 325 TGTCAATAATGGCATATAATCCAGTGAGAAAGCCAACTTTGCATTTTTTTTTTATTTGGTATGTC 390 <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<AATGTCATGCCGGTGTCCGTTAGCAAGCTATATATGCTTGCAACATAAAAACTATGTCAAGGATG 455 CTTCCTTGTAATAATTCCCATTAGTGGAAATGTTCTCTGCTTTTTATATTACCTCAAGCTAGC 518
Figura 45 - Eletroforese em gel de agarose 1% da amplificação por PCR da extremidade 5' do cDNA
de H. lanatus. Nos poços foram aplicados: (1) Marcador 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen), onde os números ao lado indicam o tamanho relativo das bandas em pares de base; (2) PCR contendo 1 µL de cDNA, com 60 ºC de temperatura de anelamento e 1 min de extensão.
Devido apresentação de apenas uma banda no gel, esta reação de PCR foi purificada com o GeneJET™ PCR Purification Kit (Fermentas) e o fragmento foi inserido no vetor pGEM®-T, incubando a reação de ligação à 4ºC overnight. Após a ligação, o plasmídeo foi utilizado para transformação de cepas E. coli XL1-Blue por eletroporação, conforme discriminado na metodologia. Depois de transformadas e plaqueadas, 6 colônias foram selecionadas e utilizadas como molde em PCR de colônia, para confirmação da presença dos insertos, revelando a amplificação de fragmentos de mesmo tamanho.
Após a confirmação dos insertos, todos os clones foram submetidos ao processo de extração de DNA plasmidial e sequenciados, totalizando 6 amostras. Cada plasmídeo foi sequenciado em duplicata para cada primer (SP6 e T7), resultando em 12 sequências para cada primer, totalizando 24 sequências. O resultado do sequenciamento foi analisado através do programa DNA Baser Sequence Assembler, onde foi possível a remoção das regiões do vetor pGEM®-T e construção de uma sequência consenso para cada clone, as quais foram traduzidas in silico pelo programa BioEdit, revelando que todas as colônias exibiram a mesma sequência, sendo esta positiva para o precursor Hyla1. A sequência completa do mRNA revelou o tamanho real da ORF, contendo 330 nucleotídeos, mostrando que a proteína precursora de hyla-br1 contem no total 109 resíduos de aminoácidos. Além disso, foi possível conhecer os resíduos iniciais que faltavam, exibindo a sequência MDAKKML, totalizando 23 aminoácidos no ER-Signal (Figura 46).
1 2 1000 850 650 500 400 300 200 100
Figura 46 - Sequência completa do gene Hybanthus lanatus 1 (Hyla1), contendo uma ORF de 330
nucleotídeos, a qual codifica in silico o precursor proteico do ciclotídeo hyla-br1, contendo 109 resíduos de aminoácidos. As regiões sublinhadas representam as sequências que faltavam no precursor semicompleto, e as letras em vermelho indicam os códons iniciador e terminador.
A sequência completa do gene é idêntica àquela obtida anteriormente, onde apenas sete aminoácidos do início do primeiro domínio estavam faltando, continuando a apresentar alta similaridade com diversos precursores encontrados em outras espécies de Violaceae, novamente exibindo até 75% de identidade máxima quando comparados com precursores do gênero Gloeospermum e Melicytus.
Após obtenção da sequência completa de mRNA de Hyla1, torna-se possível a busca pela sua sequência no DNA genômico de H. lanatus, através do desenho de oligonucleotídeos iniciadores no sentido senso dentro da região 5'-UTR do mRNA e antisenso, dentro da região 3'-UTR do mRNA, com intenção de amplificação de um ou mais genes codificadores deste gene, possibilitando a comparação das sequências de RNA e DNA e visualização de possíveis introns, para uma completa caracterização molecular deste precursor de Violaceae. ATGGATGCCAAGAAGATGTTGGTTGGTCTTTTCCTCATTGCCGCCTTGGCTCTTCCTGCTCTCGCA ACCTTTGAGAAAGATGTGATCACTGCTGAAACCATGCAGGCAGTTCTTGAGAAAACTGGAGGAGGT AATGCCATTAACCTTCTTCTTAACAGCAAGACCATTATCTCTAAAACCGTGCTCGAGGAGGCACTC ATTAAGACCGATCATTCTGCAAATGGTGTTATTCCTTGTGGTGAAAGTTGTGTGTTCATTCCATGC ATCTCTAGCTTCCTTGGGTGCTCTTGCAAGAACAAGGTTTGCTACAGGAACTCCCTCGTTATTTAA ER-Signal NTPD CMD CTR Sequência de Nucleotídeos Sequência de Aminoácidos NTR MDAKKMLVGLFLIAALALPALATFEKDVITAETMQAVLEKTGGGNAINLLLNSKTIISK TVLEEALIKTDHSANGVIPCGESCVFIPCISSFLGCSCKNKVCYRNSLVI