Durante as últimas décadas inúmeras sequências proteicas de ciclotídeos foram desvendadas ao redor do mundo em plantas de diversas famílias. Contudo, nenhum peptídeo ou precursor proteico de ciclotídeo foi elucidado em plantas latino-americanas, inclusive no Brasil. Assim, norteado pela descrição do ciclotídeo palicoureína em Palicourea condensata (Rubiaceae) (BOKESCH et al., 2001), foi executado um trabalho pioneiro, utilizando extratos proteicos de espécimes de Palicourea rigida presentes no planalto central sul do Brasil, especificamente no Cerrado, Distrito Federal, Brasil (PINTO et al., 2011a). Este estudo evidenciou a presença de ciclotídeos na inflorescência, pedúnculo e folhas, sendo que alguns se apresentavam apenas em tecidos específicos, enquanto outros apareciam em todas as partes exploradas. Um destes peptídeos foi sequenciado, levando à caracterização do primeiro ciclotídeo brasileiro, a parigidina-br1, contendo 32 resíduos e classificado na subfamília das Braceletes, devido a ausência de uma cis-prolina no loop 5 (Figura 9).
Figura 9 - Modelo tridimensional do ciclotídeo parigidina-br1, onde a cadeia principal é mostrada em
azul e as pontes dissulfeto entre as cisteínas estão representadas em amarelo. No modelo é possível a visualização dos seis loops e das três pontes dissulfeto, formando o motivo CCK, característico dos ciclotídeos (adaptado de PINTO et al., 2011a).
Após ser totalmente caracterizado em relação à sua sequência primária, alguns testes biológicos foram realizados, onde a parigidina-br1 não apresentou nenhuma atividade antibacteriana, baixa atividade hemolítica e elevada atividade inseticida, sendo capaz de causar 60% de mortalidade em larvas neonatas da broca-da-cana (Diatraea saccharalis) através de administração oral do ciclotídeo, inserido na dieta artificial especifica para este inseto (PINTO et al., 2011a).
Com esta descoberta novas perspectivas se abrem no campo de estudo de ciclotídeos, agora encontrados também no Brasil, ampliando o interesse para espécies nativas brasileiras, onde novas sequências proteicas e gênicas podem ser elucidadas e estudadas, podendo ser utilizadas em diversos testes de atividades biológicas ainda não testados, com intuito de aprofundar os conhecimentos sobre esta classe de peptídeos cíclicos vegetais de alto potencial biotecnológico.
2 JUSTIFICATIVA
Mesmo apresentando múltipla funcionalidade comprovada in vitro, as funções fisiológicas dos ciclotídeos in planta ainda estão sob investigação, podendo desempenhar diversas funções, em diferentes tecidos, sendo expressos constitutivamente ou induzidos por estímulos bióticos e/ou abióticos. Sua potente atividade contra pragas sugere que os ciclotídeos possam funcionar no sistema de defesa das plantas. Além disso, sua capacidade de inibir bactérias e vírus patogênicos humanos revela sua potencial aplicabilidade no ramo da saúde, funcionando como promissores fármacos ou como bases para o desenho de novas drogas.
Dessa forma, as informações presentes na literatura e nos bancos de dados evidenciam a necessidade de ampliação do conhecimento sobre essa recente família de peptídeos, buscando tanto novos ciclotídeos quanto plantas produtoras destas moléculas, para que possamos aprofundar a compreensão sobre sua diversidade de sequência e plasticidade estrutural e, assim, entender melhor suas relações estrutura-atividade. Para isso, é necessário desvendar sua síntese e processamento, assim como sua organização gênica e regulação de expressão, onde os genes que codificam ciclotídeos tornaram-se alvos em diversos projetos de pesquisa nesta área na ultima década.
As buscas por novas sequências codificadoras de ciclotídeos visam, adicionalmente, complementar os estudos baseados na extração e purificação desses peptídeos vegetais, possibilitando encontrar ciclotídeos que são pouco produzidos, aumentando as chances de encontrar novas e diferentes sequências. Além disso, os genes codificadores desses precursores podem ser utilizados na produção de plantas transgênicas, as quais poderão ser aplicadas, em um futuro próximo, na indústria farmacêutica para produção de novas drogas, bem como na agropecuária, conferindo resistência contra pragas às culturas economicamente importantes.
Assim sendo, os peptídeos cíclicos de plantas e seus genes assumem importância ímpar neste contexto de novas tendências da fitoquímica moderna e da engenharia metabólica, fazendo-se necessário estudá-los cada vez mais devido seu alto potencial biotecnológico.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Clonar e caracterizar genes que codificam precursores de ciclotídeos presentes em espécies vegetais do bioma Cerrado, pertencentes às famílias Rubiaceae, Violaceae e Fabaceae.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Isolar genes parciais codificadores de ciclotídeos em RNA foliar de Palicourea rigida (Rubiaceae), Hybanthus lanatus (Violaceae) e Clitoria sp. (Fabaceae); Elucidar a sequência completa dos genes encontrados;
Estudar a possível estrutura proteica dos precursores de ciclotídeos in silico Avaliar a presença de Introns na sequência genômica dos genes codificadores
de ciclotídeos encontrados;
Identificar no DNA genômico das plantas investigadas o possível número de cópias dos genes codificadores de ciclotídeos encontrados;
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 MATERIAL VEGETAL
Folhas das espécies Palicourea rigida (Rubiaceae), Hybanthus lanatus (Violaceae) e Clitoria sp. (Fabaceae) foram coletadas no parque da Ermida Dom Bosco e na Reserva Ecológica do IBGE, Brasília/DF. Após a coleta, as folhas foram imediatamente armazenadas em gelo durante o transporte e, posteriormente, armazenadas a -80 oC, até a utilização do material.
4.2 EXTRAÇÃO DE RNA
Para extração de RNA total de alta qualidade de células vegetais, fragmentos foliares sem a presença de nervuras foram colocados imediatamente em nitrogênio líquido, onde foram macerados com auxílio de pistilo e almofariz até a obtenção de um pó fino. Após trituração, 100 mg do macerado de P. rigida foram submetidos ao InviTrap® Spin Plant RNA Mini Kit (Invitek/STRATEC Molecular), seguindo as orientações do fabricante, enquanto 100 mg dos macerados de H. lanatus e Clitoria sp. foram submetidos separadamente ao TRIzol® Reagent (Ambion), seguindo as orientações do fabricante.