Os ciclotídeos representam uma classe promissora de biomoléculas, tanto para a agricultura quanto para a indústria farmacêutica. No entanto, um problema real sobre estes peptídeos consiste no baixo rendimento proteico a partir de extratos naturais, sendo necessária elevada quantidade de biomassa (CRAIK; MYLNE; DALY, 2010; DÖRNENBURG, 2010). Além disso, para estudos de relação estrutura-atividade, análogos e mutantes são necessários, os quais podem ser obtidos através de meios não naturais, principalmente pela síntese química, semissíntese ou expressão heteróloga (CAMARERO et al., 2007; ABOYE et al., 2008; DÖRNENBURG, 2010).
Os ciclotídeos podem ser sintetizados por química convencional, orientando a oxidação antes da ciclização, tal como utilizado na síntese de kalata B1 (GUNASEKERA et al., 2006), sendo produzidos in vitro através de uma adaptação da tecnologia da ligação química nativa (KENT, 2004). Neste procedimento, a cadeia principal pode ser inicialmente ciclizada, ocorrendo posteriormente o enovelamento oxidativo (KENT, 2004; GUNASEKERA et al., 2006; CAMARERO et al., 2007). Porém, o rendimento de síntese ainda é insatisfatório, pois alguns ciclotídeos tornam-se inviáveis para produção. Dessa forma, a abordagem utilizada na síntese química de ciclotídeos é diferente das metodologias convencionais, como a síntese em fase sólida ou a síntese em solução, as quais possuem limitações para a ciclização de peptídeos com grande distância entre seus N-terminal e C- terminal (30 resíduos de aminoácidos em média, contendo aproximadamente 90 átomos), tornando-se relativamente ineficientes.
A metodologia desenvolvida para síntese química de ciclotídeos, nomeada thia zip reaction, é mediada por tioéster, onde precursores proteicos lineares desprotegidos são sintetizados com um resíduo de cisteína no N-terminal e um ligante tioéster C-terminal. Assim, a síntese ocorre por uma série de reações reversíveis de substituições de tiol- tiolactonas através do tiol das cadeias laterais, finalizando com uma -amino tiolactona, a qual sofre uma reação irreversível e espontânea de contração do anel por migração do S,N- acil para a forma de proteína cíclica. Após a thia zip reaction, o peptídeo cíclico passa pelo dobramento oxidativo. Porém, através deste método, apenas cerca de 50% das moléculas sintetizadas adotam a conformação nativa, enquanto os outros 50% resultam em moléculas enoveladas de forma errônea. No entanto, a produtividade de síntese pode ser melhorada para mais de 75% através da redução e re-enovelamento dos produtos não nativos (GUNASEKERA et al., 2006; ABOYE et al., 2008).
Outro método para obtenção de produtos cíclicos maduros é a síntese quimioenzimática, onde, ao contrário do método anterior, o tioéster C-terminal é
desnecessário. Nesta estratégia, primeiro ocorre o processo oxidativo e em seguida a ciclização. No entanto, uma modificação na sequência é indispensável, sendo necessário um resíduo do aminoácido lisina ou fenilalanina no C-terminal, os quais participam da ciclização. Depois da síntese peptídica e enovelamento, a ciclização é mediada por uma serinoprotease (tripsina ou quimotripsina), imitando o mecanismo de biossíntese, uma vez que as proteases podem ser induzidas para sintetizar uma ligação peptídica, se as condições da reação forem controladas. Esta é a razão da necessidade de um resíduo específico no C-terminal (THONGYOO et al., 2008).
Além da síntese química, os ciclotídeos também podem ser produzidos por expressão em sistema heterólogo, na qual bactérias representam a principal alternativa. Nesta metodologia ocorre a produção de ciclotídeos recombinantes fusionados à inteína para permitir a ciclização. Assim como no método anterior, a sequência deve ser mudada, a fim de que o primeiro resíduo seja uma cisteína. Em seguida, esta sequência modificada é fundida com uma metionina no N-terminal e com uma inteína modificada no C-terminal. O processo de splicing mediado pela inteína representa uma reação autocatalítica que não necessita de enzimas auxiliares. Inteínas são domínios proteicos internos com alto potencial de autoclivagem induzido, fundidos com um domínio de afinidade, o que permite uma purificação proteica eficiente através de cromatografia (PERLER et al., 1994).
A utilização da inteína exclui a falta de proteases exógenas ou químicos necessários em outros sistemas de fusão para eliminar o carreador. A inteína modificada também fornece o tioéster C-terminal, sendo que duas etapas são necessárias antes da thia zip reaction ocorrer: (a) primeiro, a remoção da metionina por uma Met-aminopeptidase; (b) depois, a mudança do N,S-acil C-terminal. Posteriormente, a thia zip reaction ocorre, levando à ciclização. Subsequentemente, o produto ciclizado dobra espontaneamente no citoplasma, através do uso da cepa Escherichia coli Origami 2 (DE3), uma linhagem celular construída para promover a formação de pontes dissulfeto. Esta abordagem foi aplicada com sucesso na expressão dos ciclotídeos MCoTI-I e MCoTI-II, os quais foram produzidos e ciclizado totalmente dentro do citoplasma das células bacterianas, sendo completamente funcionais (CAMARERO et al., 2007).
Recentemente, um aperfeiçoamento da técnica de expressão heteróloga de ciclotídeos recombinantes foi aplicado à produção do ciclotídeo kalata B1, onde a expressão do precursor proteico linear foi facilitada através da fusão de uma tiorredoxina ao N- terminal, produzindo peptídeos ciclizados e enovelados corretamente. Esta estratégia agrega a utilização enzimática da síntese quimioenzimática ao processo, substituindo a utilização de uma inteína para mediar a ciclização, aumentando o rendimento e a eficiência
de enovelamento corretos dos ciclotídeos produzidos (COWPER; CRAIK; MACMILLAN, 2013).
Além desses métodos, esforços têm sido feitos na construção de plantas transgênicas para a produção ciclotídeos (SASKA et al., 2007; GILLON et al., 2008). A criação de proteínas recombinantes em culturas de células vegetais propõe vantagens sobre a expressão microbiana tradicional e/ou sistemas hospedeiros mamíferos, tais como a sua segurança intrínseca, o custo-benefício do bioprocessamento e a facilidade de fazer modificações pós-traducionais. Estudos demonstraram que plantas não produtoras de ciclotídeos podem expressar genes de ciclotídeos quando transformadas (GILLON et al., 2008). Neste caso, a kalata B1 foi produzida a partir da inserção do cDNA de OaK1 em Arabidopsis thaliana e Nicotiana tabacum para provar que os peptídeos circulares poderiam ser produzidos por plantas que não são das famílias Rubiaceae ou Violaceae e que também não são produtoras naturais de ciclotídeos. Os resultados mostraram que as plantas não produtoras de ciclotídeos possuem a maquinaria bioquímica necessária para produzi-los, tal como a kalata B1 foi, no entanto, não são tão eficazes como as espécies produtoras naturais de ciclotídeos, gerando também espécimes lineares de kalata B1 (GILLON et al., 2008).