genomas estudados, não é compatível com uma análise extensiva de polimorfismos no
elevado número de variedades de videira disponíveis, devido ao grande dispêndio de
tempo na sua execução e resultados pouco reprodutíveis. Tendo em conta os dados
obtidos, que indicavam uma forte presença de sequências microssatélites no genoma da
videira e as sondas executadas com este tipo de sequências pouco eficientes na detecção
Castas, clones, mostos e vinhos - méiodos moleculares
para o desenvolvimento de metodologias baseadas na técnica de Sequence Tagged Site (STS), será eventualmente conseguida a detecção de polimorfismos por uma via mais fácil.
Desde então o interesse por este tipo de marcadores conheceu um forte crescimento e alguns grupos em todo o mundo iniciaram os trabalhos no seu desenvolvimento, resultando no aparecimento de novas sequências de microssatélites. Algumas destas sequências que têm sido descobertas pelos vários investigadores podem ser encontradas em bases de dados de consulta gratuita disponíveis na internet. Este assunto será tratado com maior profundidade em secções posteriores deste capítulo[p'120].
A leitura, ou interpretação, de um gel de acrilamida onde foram separados fragmentos originados pela amplificação de um marcador microssatélite é relativamente simples e os dados - o tamanho ou massa molecular dos alelos - podem ser expressos de uma forma numérica (número de pares de bases ou número de repetições do padrão do microssatélite). Os resultados obtidos podem ser reproduzidos e comparados em laboratórios diferentes ou em diferentes períodos, sempre que a padronização dos tamanhos dos alelos seja efectuada. Esta padronização deverá ser baseada na utilização de um conjunto de castas e marcadores, os quais deverão ser analisadas por um conjunto diverso de laboratórios que estabeleçam o perfil (massa molecular dos alelos) que determinada variedade origina quando amplificada com determinado marcador. A escolha dos pares casta/marcador a usar para a construção dos padrões deverá ser feita de modo a abranger o maior número de alelos possível. Os melhores marcadores para esta finalidade serão aqueles que originam bandas bem definidas onde o fenómeno de stutter seja pouco pronunciado. As castas a usar devem, de preferência, ser de fácil acesso (e.g. castas
Métodos moleculares de análise da variabilidade da videira
usadas a nível internacional), podendo, assim, ser facilmente obtidas por qualquer investigador, em qualquer país, que pretenda calibrar o seu método.
O valor de um marcador para a identificação de castas não deve ser estimado exclusivamente a partir da contagem do número de alelos, pois os desvios da distribuição homogénea destes diminui severamente o conteúdo em informação proporcionado por esse marcador, mesmo apresentando este um elevado número de alelos[Se
ai., 1999] Desta forma, algoritmos que tenham em consideração a frequência dos alelos
reflectem com maior exatidão a variabilidade de um locus. Dois desses algoritmos, a seguir listados, foram desenvolvidos para marcadores moleculares de videira pelos autores indicados.
' Probabilidade de Identidade (PI) - cujo cálculo é baseado na frequência
dosalelos[Setee,al'im2m].
• Poder Discriminatório (D) - cujo cálculo é baseado nos padrões de bandas ou nas frequências genotípicas (sendo C a probabilidade de confusão ou a probabilidade de dois indivíduos escolhidos aleatoriamente numa população apresentarem o mesmo perfil de bandas, D=l-C)
1999]
Ambos os indicadores reflectem a probabilidade com que duas castas não relacionadas podem ser distinguidas por um determinado marcador. A um marcador microssatélite apenas pode corresponder um valor de PI igual a 0,05, o que significa que a probabilidade de duas castas não relacionadas apresentarem o mesmo genótipo é igual a 5%. Combinando um maior número de marcadores microssatélite, e.g. cinco, o valor pode descer até IO"5. Valores de D iguais a 0,959 e 0,825 foram calculados por Tessier et
Castas, clones, mostos e vinhos - métodos moleculares
al. (1999) para os primers VVMD5 e VVMD8, quando usados isoladamente, o que
reflète bem o poder polimórfico destes marcadores.
O parâmetro D pode ser usado para comparar diferentes tipos de marcadores e chegar a uma combinação ideal entre eles. Tessier et ai. (1999), no trabalho de apresentação do algoritmo D, concluíram que para uma população de 224 castas, onde foram aplicados 23 primers (21 RAPD e 2 microssatélites), a combinação de % primers (6 RAPD e 2 microssatélites) apresentou o maior poder discriminatório.
Tendo em conta a enorme diversidade de castas, a eficiência de determinado marcador pode variar, em diferentes colecções de castas, visto a frequência alélica variar entre grupos genéticos. No entanto, na generalidade, um marcador que se mostre eficiente num determinado grupo genético terá também um bom poder discriminatório quando aplicado a outro grupo. Este facto poderá ser muito útil na escolha de marcadores para aplicação em determinado grupo nunca antes estudado.
Os marcadores do tipo ADN microssatélite rapidamente se tornaram os marcadores de eleição na identificação de castas de videira. Para além da sua grande capacidade discriminatória, estes marcadores propiciam um leque alargado de aplicações[Quadro 23], tão distintas como a reconstituição da linhagem de castas e o
mapeamento genético, este último de extrema importância para a definição de marcadores relacionados com o controlo da expressão de características agronómicas desejáveis[Sefc et
ai, 2001]
Métodos moleculares de análise da variabilidade da videira
Quadro 2.3.- Perspectivas de avaliação da informação obtida pela utilização de marcadores de ADN microssatélite. Adaptado de Sefc et a/., 2001.
Gestão de colecções de germoplasma Identificação de castas
Identificação de sinonímias e homonímias Reconstrução genealógica
Caracterização dos pools genéticos Variabilidade genética
Composição alélica e genotipica Diferenciação entre pools de genes Avaliação de marcadores Heterozigosidade
Frequência dos alelos Frequência de alelos nulos Análise de agrupamentos Determinação da similaridade
Construção de fonogramas