Castas, clones, mostos e vinhos - métodos moleculares
seus colaboradores, decidiram estudar o efeito da variação da concentração de Tris do tampão referido por Doyle e Doyle (1990), na qualidade dos extractos de ADN obtidos. Desta forma, estudaram as concentrações 0,1 (usada por Doyle e Doyle, 1990); 0,5; 1,0 e 2,0 M de Tris tendo concluído que a concentração ideal seria de 1,0 M, uma vez que, ao contrário do sucedido com concentrações inferiores, não se verificava um decréscimo do pH do meio quando se homogeneizavam as folhas no meio extractivo. Constataram ainda que, a partir de uma concentração de Tris superior a 1,5 M, o precipitado de ADN apresentava uma coloração amarelada estável à lavagem e, em algumas amostras, o rendimento da extracção era menor. Além disso, os autores estudaram o efeito do tempo de incubação e da concentração de CTAB e, embora estes dois parâmetros não tenham influenciado a qualidade do extracto com a mesma intensidade que a concentração de Tris, concluíram que 30 minutos de incubação e 3% de CTAB seriam os valores ideais. Apesar das conclusões dos autores, a utilização de Tris na concentração de 1,0 M não tem merecido grande atenção por parte dos investigadores, sendo encontradas apenas referências esporádicas a este trabalho[Geunae,al- l991-2m\
Adaptando a metodologia descrita por Doyle e Doyle (1990), Cipriani e seus colaboradores (1994) reclamaram o desenvolvimento de um método de extracção para folhas de videira, baseado na utilização de CTAB e PVP, em todo idêntico a todas as outras adaptações do trabalho original.
Devido à necessidade de obtenção de ADN com um grau de pureza elevado para utilização em técnicas de RFLP, Bourquin et ai. (1995) optaram pela utilização de um processo extractivo em duas fases. Uma primeira fase de extracção dos núcleos celulares utilizando o tampão de extracção A, referido no Quadro 2.1, e posterior digestão dos núcleos com um segundo meio extractivo, tampão B. A precipitação final do ADN foi
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executada com 0,6 volumes de isopropanol. Outros autores [Xu el a'-m5] recorreram, de
igual forma, a um processo extractivo em duas fases. Após a ressuspensão, com o tampão de extracção B, dos núcleos extraídos com o tampão de extracção A, foram sucessivamente adicionados ao meio os reagentes necessários para a separação do ADN em gradiente de cloreto de césio. Sublinhe-se que os métodos referidos, baseados num processo extractivo duplo relativamente complexo, são extremamente morosos, mas necessários para a obtenção de ADN de suficiente qualidade para ser sujeito a sondas de hibridação.
Wang et ai. (1996), tendo em vista o desenvolvimento de um método capaz de proporcionar a obtenção de bons extractos de ADN a partir de amostras conservadas em gel de sílica, segundo proposta de Chase e Hills (1991), testaram uma extracção baseada na utilização de CTAB. Este método compreendia duas fases de extracção - extracção de núcleos celulares e extracção de ADN do precipitado nuclear - nas quais se utilizam dois meios tamponados diferentes, sendo o meio usado para a extracção de ADN dos núcleos (tampão B)[Quadro 21] o descrito por Lodhi et ai. (1994). Tal como no artigo original de
Lodhi, Wang et ai. (1996) não incorporam PVP directamente no meio de extracção, mas adicionam-na numa das fases do processo. A fase escolhida para a adição de PVP foi a da trituração das amostras, com evidentes vantagens para o processo de homogeneização, tendo em conta que o pó de PVP funciona como coadjuvante de trituração. A utilização de coadjuvantes de trituração em folhas de videira (e.g. sílica pulverizada) tem sido sugerida por vários autores, inclusivamente por Chase e Hills (1991), mas a utilização de um dos componentes do meio extractivo, como PVP em pó, para este efeito, nunca tinha sido referida.
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This et al. (1997), tendo por base a metodologia desenvolvida por Bowers et al. (1993), adaptaram-na à extracção de DNA de partes lenhosas da planta. Essa adaptação consistiu na substituição do reagente CTAB pelo CDAB. Apesar da clara referência à modificação do método de Bowers, os autores não fazem qualquer alusão às razões de tal substituição dos reagentes, nomeadamente se o CDAB apresenta alguma vantagem na extracção de material lenhoso. Todavia, num trabalho posterior[Do,,gez el "'"2002], o mesmo
método de extracção é aplicado a folhas jovens de videira, permitindo e observação da efectividade do reagente em tecidos de videira, lenhosos e não lenhosos.
Num trabalho onde Di Gaspero et ai. (2000) apresentam 9 novos microssatélites, o método de extracção utilizado foi o método clássico de Doyle e Doyle (1991) modificado para extracção em microescala - 200 mg de folha - e cujo tampão foi enriquecido pela adição de 1% de PVP. Em termos gerais, os autores seguiram a convergência da maioria dos trabalhos de extracção de ADN para métodos em microescala, usando CTAB, PVP e cloreto de sódio para remoção de interferentes.
Baseando-se numa metodologia previamente desenvolvida pelos mesmos autores, contudo adaptada à extracção de espécies lenhosas, Lefort e Roubelakis-Angelakis (2001) desenvolveram uma metodologia de extracção de ADN de folhas de videira em que são usados dois detergentes [Quadro2I], CTAB e Tween 20, e cloreto de lítio, usualmente não
utilizado neste tipo de extracções.
Labra et ai. (2001), impulsionados pela necessidade de desenvolver uma metodologia capaz de fornecer ADN de qualidade compatível com a metodologia AFLP - DNA muito puro e de relativamente elevado peso molecular - propuseram uma metodologia, baseada no trabalho de Doyle e Doyle (1990). Consistia numa purificação
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pós-extracção, pela introdução de alguns passos na metodologia que tinham por objectivo a digestão de interferentes com enzimas como a RNase, proteinase K e a-amilase, e uma dupla precipitação com etanol, na presença de um excesso de iões de sódio. Os autores reclamam para este método a eliminação completa de polissacarídeos, inibidores da Taq polimerase do ADN. Acrescente-se que este método tem sido usado apenas pelos seus autores e colaboradorestGrassie""'2003'2003al.
Pela análise dos vários trabalhos publicados ao longo dos últimos 15 anos, sensivelmente, verifica-se a evolução das metodologias para microescala e a utilização da conjugação dos reagentes CTAB, cloreto de sódio e PVP. A partir do início da primeira década do século XXI, verifica-se, igualmente, um incremento na utilização de kits de extracção de ADN disponíveis no mercado adaptados à utilização em plantas. Estes produtos são desenvolvidos tendo em vista a sua utilização em plantas cujos estudos genéticos estão bastante disseminados, como, por exemplo, da Arabidopsis thaliana. A aplicabilidade destas metodologias a plantas bastante mais complexas como a videira requer, por vezes, pequenas adaptações tais como as executadas por Vidal et ai (2000), em que o volume dos reagentes de digestão foi aumentado devido à elevada viscosidade do extracto originado, e por Adam-Blondon (2004) que adicionaram PVP a uma das soluções de extracção e executaram a eluição do ADN em dois passos. Apesar de haver cada vez maior disponibilidade destes kits - que permitem extracções com maior economia de tempo - os métodos clássicos continuam a ser bastante utilizados pois: (i) são bastante menos dispendiosos; (ii) são mais flexíveis, i.e. permitem uma mais fácil adaptação às condicionantes da matriz.
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