Costas, clones, mostos e vinhos - métodos moleculares
' neutralidade: a maioria não se localiza perto ou dentro de sequências codificantes, onde poderiam causar alterações das funções do gene codificado ou sofrer pressões selectivas inerentes ao gene;
' elevado polimorfismo;
' co-dominanância - permitindo a discriminação entre homozigóticos e heterozigóticos;
' possibilidade de representação pelo tamanho dos alelos, expresso em pares de bases, permitindo uma fácil transferência e partilha de resultados; ' transferibilidade entre espécies relacionadas, muitas vezes possível (e.g.
Vitis vinifera e Vitis riparia), - permitindo assim ultrapassar a fase dispendiosa e morosa da construção e rastreio de bibliotecas genómicas para o desenvolvimento de novos marcadores. Thomas e Scott, 1993, referem a conservação destas regiões entre espécies de Vitis e Muscadinia; ' reprodutibilidade dos resultados obtidos com estes marcadores.
5.3.3.1.
CARACTERIZAÇÃO DOS MICROSSATÉLITES NOS ORGANISMOS EDISTRIBUIÇÃO NO GENOMA
A existência de microssatélites no ADN nuclear de plantas foi referida, pela primeira vez, por Delseny et ai. (1983) como repetições (CA)n. Mais tarde foi
demonstrada a sua presença na maioria dos organismos e no genoma de organelas[Wang el
"'' ' 94], embora diferentes tipos de repetições abundem mais do que outras em cada
organismo. Assim, nas plantas, as repetições do tipo GA e AT são mais frequentes do que as do tipo CA, primeiramente descritas. No genoma da levedura Saccharomyces
cerevisiae as sequências AT são as mais frequentes enquanto que nos humanos, e na
Métodos mo/ecu/ares de análise da variabilidade da videira
maioria dos mamíferos, padrões repetitivos com CA e TG apresentam-se como os mais abundantes[Hanc0Ck'1999].
Num trabalho que avalia a praticabilidade da utilização destes marcadores em genética vegetal, Morgante e Olivieri (1993) estudaram as sequências repetitivas disponíveis pertencentes a 34 espécies de plantas superiores quanto à presença, abundância e distribuição de repetições di e trinucleotídicas. Estes autores confirmaram a presença destas sequências em todas as plantas estudadas com uma frequência média de 50 Kb cada. Scott et ai. (2001) refinam estes valores para 21,2 Kb em dicotiledónias e para 64,6 em monocotiledónias. As repetições do tipo AT formam a classe de dinucleotídeos mais abundante enquanto que as repetições do tipo CA, frequentes nos animais, encontram-se entre as muito pouco abundantes nas plantas estudadas. Relativamente às sequências trinucleotídicas, as repetições do tipo TAT apresentaram-se como as mais frequentes.
A distribuição dos microssatélites no genoma é melhor conhecida em humanos e ratos devido à sua intensa utilização na construção de mapas genéticos destes organismos. Alguns autores sugerem uma distribuição aleatória e relativamente uniforme por todo o genoma[Dibe'aL 1996, Dietrich""'"19%]. Contudo, numa visão mais pormenorizada, Hancock et
ai. (1999) referem que a existência deste tipo de sequências dentro de regiões codificantes
é pouco frequente. Não especifica as razões da restrição de microssatélites nestas regiões genómicas. Morgante et ai. (2002), no estudo das regiões do genoma das plantas às quais os microssatélites estão preferencialmente associados, concluíram que estas sequências são mais frequentes em regiões não codificantes, nomeadamente em regiões genómicas não transcritas (5'UTRs e 3'UTRs).
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Como foi mencionado anteriormente, as sequências simples encriptadas podem surgir da acumulação de mutações pontuais em microssatélite, mas o contrário, a acumulação de mutações pontuais em sequências simples encriptadas, também poderá originar um novo microssatélite. Talvez por esta razão nem sempre se distingam os verdadeiros microssatélites de sequências simples encriptadas. Esta instabilidade provocada pelas taxas de mutação relativamente elevadas está na origem da grande utilidade deste tipo de marcadores em estudos evolucionários, genéticos e discriminatórios.
5.3.3.2.
FUNCIONALIDADE DOS MICROSSATÉLITES NO GENOMASefc et ai. (2001), numa referência às principais características dos microssatélites, salientam o facto de estes serem neutros, isto é, não se localizarem perto ou dentro de sequências codificantes - onde poderiam causar alterações das funções do gene codificado ou sofrer pressões selectivas inerentes ao gene - como uma vantagem destes marcadores moleculares. De facto, a maioria dos autores referem-se aos microssatélites como sequências não codificantes, distribuídos aleatoriamente pelo genoma mas raros em zonas codificantes.
Apesar de, como referido, estes marcadores serem considerados como lixo genómico (i.e. não terem qualquer função definida), num trabalho de revisão dos estudos efectuados sobre a função dos microssatélites no genoma, Soller e Kashi (1999) indicam que este tipo de sequências, principalmente as trinucleotídicas, desempenha um papel funcional no genoma. Estas conclusões estão de acordo com um estudo previamente realizado por Morgante e Olivieri (1993), exclusivamente em plantas, em que os autores não encontraram repetições dinucleotídicas em sequências codificantes tendo, por sua
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vez, associado grande parte das sequências trinucleotídicas a regiões codifícantes. As repetições dinucleotídicas encontraram-se, na sua maioria, repartidas entre regiões flanqueadoras 5' e intrões.
Segundo os referidos autores há evidências que estes marcadores desempenhem funções codifícantes e funções de regulação do genoma. Como sequências codifícantes, alguns microssatélites foram encontrados em variadas proteínas tendo a variação do número de repetições - número de aminoácidos das cadeia polipeptídicas homopoliméricas - sido associada a algumas funções do gene. Como sequências reguladoras são encontrados distribuídos ubiquitariamente pelo genoma, a montante das sequências promotoras (sequências repetitivas integradas em regiões promotoras funcionam como elementos de activação da expressão das regiões codifícantes). Da mesma forma os microssatélites também podem ter um papel de activação a montante do gene devido à sua grande capacidade, típica de sequências activadoras, de se ligarem a proteínas.
5.3.3.3.
MECANISMOS DE INSTABILIDADE (MODELOS DE MUTAÇÃO) DEMICROSSATÉLITES
Os ritmos de mutação dos microssatélites são bastante elevados quando comparados com os das mutações pontuais, ocorrentes nas regiões não-repetitivas, que rondam as IO"10 mutações por replicação[Hancock'l999]. Estimativas dos ritmos de mutação,
por locus, dos microssatélites em sistemas in vivo referenciam os seguintes valores: 10" , por replicação, em bactérias E. coli[Levmson e Gutman'1987]; IO"4 a IO"5 em leveduras[Smind « <"'
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plantas, encontram-se referências aos ritmos de mutação de microssatélites em milho, que rondam os lo^'m^ cai., 2002^
A instabilidade elevada destes marcadores torna-os excepcionalmente úteis para estudos genéticos. Embora muitos tipos de mutações ocorram em repetições microssatélites, tal como nas outras regiões do genoma, o elevado ritmo de mutação destas sequências é essencialmente devido a mutações que provocam alterações do número de repetições dos padrões do microssatélite. Este tipo de mutações ocorre a um ritmo muito mais elevado (da ordem dos milhares de vezes superiores em alguma espécies) que as restantes, justificando a alta variabilidade encontrada.
Estão actualmente propostos dois modelos que explicam esta elevada instabilidade. Um dos modelos propõe que a instabilidade dos microssatélites é causada por um elevado ritmo de ocorrências de crossing-over irregulares dentro das regiões microssatélites. Um crossing-over irregular é o resultado da recombinação de cromossomas homólogos alinhados de uma forma imperfeita e ocorre com elevada frequência em zonas repetitivas devido à também elevada probabilidade de erros no emparelhamento das cadeias de ADN, característica deste tipo de sequências. O segundo modelo[Ilustraçâo 2,4] justifica esta elevada instabilidade pelo elevado número de erros de re-
emparelhamento após o deslizamento das cadeias durante o processo de replicação (Slip-
strand mispairing errors - SSM). Este processo de erros de emparelhamento inicia-se
quando a polimerase do ADN desliza durante o processo de replicação provocando o desalinhamento das cadeias[Ilustraçã0 2A a)], a cadeia mãe em replicação e a nova cadeia em
construção. Para que a replicação prossiga, as cadeias devem voltar a alinhar-se e emparelhar-se de uma forma correcta. Se este re-emparelhamento for imperfeito podem ocorrer mutações[IIustraça0 2A b)1. A probabilidade de um re-emparelhamento imperfeito
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