IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR E ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE LEITE FERMENTADO TIPO PIIMA
2. Materiais e métodos
3.1 Identificação molecular
Bactérias lácticas utilizadas na fermentação de alimentos são capazes de inibir ou reduzir a contaminação por microrganismos deteriorantes e/ou patogênicos através da produção de compostos antimicrobianos, como a redução do pH (acidificação), produção de diacetil, de dióxido de carbono, peróxido, etanol e bacteriocinas que podem exercer ação inibitória sobre diferentes
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Dentre as bacteriocinas conhecidas, a mais utilizada é a nisina, produzida por várias linhagens de Lactococcus lactis subsp. Lactis. Considerada como uma substância segura e não tóxica, tem sido amplamente utilizada na indústria alimentícia de inúmeros países como agente antimicrobiano em queijos, ovo líquido, molhos e alimentos enlatados, prolongando a vida de prateleira destes
produtos (NASCIMENTO et al., 2008).
Resultados obtidos por NASCIMENTO et al. (2008) demonstraram que que o espectro de
ação antimicrobiano da bacteriocina produzida por Lc. lactis subsp. lactis depende da espécie e
cepa do microrganismo alvo, sendo que 100% das cepas de L. monocytogenes e S. aureus avaliadas
apresentaram sensibilidade à bacteriocina e 40% das cepas de B. cereus avaliadas foram sensíveis à bacteriocina.
3.2 Análises microbiológicas
Os resultados relativos da análise microbiológica de coliformes a 45oC e bolores e leveduras do leite fermentado tipo Piima são apresentados na tabela 1.
Para a análise de Coliformes a 45ºC/g a tolerância máxima e padrões mínimos exigidos aos parâmetros microbiológicos sanitários satisfatórios estão estabelecidos no anexo I da Resolução RDC n°12 de 02 de janeiro de 2001 da ANVISA (BRASIL, 2001) (Quadro 1).
Conforme determina a legislação, a unidade amostral analisada será classificada como “aceitável”, “qualidade intermediária aceitável” ou “inaceitável”, em função dos limites m e M (BRASIL, 2001). Para as análises de bolores e leveduras, os parâmetros utilizados foram os descritos na Portaria nº 451, de 19 de setembro de 1997, da Secretária de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde (BRASIL, 1997) (Quadro 2).
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Quadro 1. Parâmetros microbiológicos RDC n° 12/2001 8 - LEITE DE BOVINOS E DE OUTROS MAMÍFEROS E DERIVADOS
GRUPO DE ALIMENTOS MICRORGANISMO Tolerância
Para Amostra Indicativa
Tolerância para Amostra Representativa
n c m M
a) leite fermentado, com ou sem adições, refrigerado, e com bactérias lácticas viáveis nos números mínimos.
Coliformes a
45ºC/g 10 5 2 < 3 10
Para fins de aplicação de plano de amostragem entende-se:
m: é o limite que, em um plano de três classes, separa o lote aceitável do produto ou lote com qualidade intermediária aceitável. M: é o limite que, em plano de duas classes, separa o produto aceitável do inaceitável. Em um plano de três classes, M separa o lote com qualidade intermediária aceitável do lote inaceitável. Valores acima de M são inaceitáveis.
n: é o número de unidades a serem colhidas aleatoriamente de um mesmo lote e analisadas individualmente. Nos casos nos quais o padrão estabelecido é ausência em 25g, como para Salmonella sp e Listeria monocytogenes e outros patógenos, é possível a mistura das alíquotas retiradas de cada unidade amostral, respeitando-se a proporção p/v (uma parte em peso da amostra, para 10 partes em volume do meio de cultura em caldo).
c: é o número máximo aceitável de unidades de amostras com contagens entre os limites de m e M (plano de três classes). Nos casos em que o padrão microbiológico seja expresso por “ausência”, c é igual a zero, aplica-se o plano de duas classes.
Fonte: Resolução RDC no 12, janeiro de 2012 (BRASIL, 2001)
Quadro 2. Parâmetros microbiológicos Portaria n° 451/1997
GRUPO DE ALIMENTOS Salmonelas (ausência em) Coliformes Fecais: NMP (máximo) Bolores + Leveduras (máximo)
f) Leite fermentado 25mL 1/mL 103/mL (N)
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Os produtos em condições higiênicas insatisfatórias serão aqueles que apresentarem valores acima dos limites estabelecidos pela legislação e no valor máximo de até dez (10) vezes esses limites (BRASIL, 1997).
Para as demais análises (Coliformes totais, Clostrídios Sulfitos Redutores, Staphylococus aureus,
Contagem Padrão em placa, Bacillus cereus e Vibrio Parahaemolyticus) a legislação sanitária brasileira
não estabelece parâmetros microbiológicos satisfatórios para o consumo.
Não foi detectada a presença de coliformes a 45oC e de bolores e leveduras no material analisado, o que indica manipulação adequada do produto e o enquadra como dentro dos padrões microbiológicos exigidos pela legislação brasileira vigente.
Os resultados obtidos na contagem de Lactococcus demonstraram o valor de 9,1x107 UFC/mL.
Considerando uma porção de 200 mL, o consumo da bacteria probiótica seria de 1,8x1010 UFC. O consumo de quantidades adequadas dos microrganismos probióticos desejados nos bioprodutos (109 a 1010 UFC / 100 g de produto) são suficientes para a manutenção das concentrações ativas fisiologicamente (quantidade intestinal de 106 a 107 UFC/g) in vivo (Charteris et al., 1998).
Para que um alimento seja considerado como probiótico, as células probióticas depois de ingeridas devem possuir a capacidade de sobreviver às condições adversas presentes no trato gastrointestinal, manter sua efetividade para chegar metabolicamente ativa no intestino e exercer
funções benéficas no hospedeiro (SAAD, 2006; ARAÚJO, 2007, apud LIMA, 2017), além de conter
pelo menos 106 UFC/g de bactérias probióticas viáveis em 100g de produto, considerada a dose minima diária da cultura probiótica com fins terapêuticos (SAAD, 2006).
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