Apesar de estarem identificadas muitas espécies e subespécies de microrganismos presentes na placa bacteriana subgengival, apenas uma pequena parte delas é considerada patogénica para o periodonto. Essas espécies têm a capacidade de colonizar a superfície radicular e bolsas periodontais. A placa bacteriana subgengival lembra a estrutura da placa bacteriana supragengival (constituída sobretudo por coccos gram negativos e positivos, bastonetes, filamentos e espiroquetas) mas com uma concentração superior em espiroquetas e gram negativos. A doença periodontal e a peri- implantite distinguem-se das demais infecções do corpo humano por serem causadas não especificamente por uma bactéria. Os mapeamentos microbiológicos, a ampliação da reação de polimerização enzimática em cadeia (PCR), clonagem e sequência filogenética através da placa bacteriana nos diferentes locci da cavidade oral, tanto em indivíduos saudáveis como naqueles com patologia associada, resultaram numa categorização de mais de 700 espécies bacterianas, comensais e indígenas (Roos-Jansaker, Lindahl et al. 2006; Rylev and Kilian 2008; Fernandes, Aquino et al. 2010). No entanto quando se avalia a microbiologia associada com a patologia periodontal e peri- implantar, temos que ter dois aspectos em consideração. Por um lado nem todas as entidades de uma espécie bacteriana possuem efeito patogénico, e por outro, a etiologia microbiana de ambas as patologias não é a mesma em todos os indivíduos (Rylev and Kilian 2008; Meijndert, van der Reijden et al. 2010).
Socransky e colaboradores em 1998 observaram que os microrganismos subgengivais constituíam complexos, aos quais atribuiu cores representativas, e observou ainda que aqueles constituintes do complexo vermelho, Tannerella forsythia (Tf), Porphyromonas gingivalis (Pg) e Treponema denticola (Td), se
encontram fortemente relacionados com o aumento de profundidade de sondagem e com a hemorragia à sondagem (Socransky, Haffajee et al. 1998). De forma semelhante, notaram também que as bactérias que compunham o complexo laranja, Prevotella intermedia (Pi), Fusobacterium nucleatum (Fn) e Campylobacter rectus, também se encontravam associadas ao aumento de profundidade de bolsas periodontais.
Este achado relativo à associação frequente entre determinados microrganismos e a doença periodontal tem sido repetidamente confirmado por outros autores, havendo hoje a ideia amplamente aceite que o principal grupo de agentes patogénicos periodontais inclui espécies gram negativas anaeróbias, mais concretamente Pg, Pi, Aa, Tf e Td (Kocar, Seme et al. ; Mengel, Stelzel et al. 1996; Iacono 2000; Greenstein and Cavallaro 2010; Vered, Zini et al. 2011).
É sabido que a colonização microbiana em implantes segue padrão idêntico àquele conhecido nos dentes naturais (Hultin, Gustafsson et al. 2002; Karoussis, Salvi et al. 2003). É também hoje sabido que a flora bacteriana responsável pelo desenvolvimento da doença periodontal e peri-implantar é semelhante (Meffert 1996; Fardal, Johannessen et al. 1999; Sbordone, Barone et al. 1999; Fernandes, Aquino et al. 2010). Existe também a ideia que a microbiota da cavidade oral anterior à colocação de implantes determina a composição da microflora peri-implantar (Karoussis, Kotsovilis et al. 2007).
Se por um lado, é verdade que em saúde a microbiota periodontal e peri- implantar é idêntica, também é verdade que na doença essa realidade se mantém (Shibli, Melo et al. 2008). No entanto alguns autores defendem que apesar de semelhante em termos qualitativos, a quantidade de bactérias em locais de peri-implantite é superior quando comparados a locais com periodontite (Shibli, Melo et al. 2008; Greenstein, Cavallaro et al. 2010) e a sua virulência aumenta à medida que aumenta a profundidade da bolsa peri- implantar (Kocar, Seme et al.).
INTRODUÇÃO
Quanto à qualidade bacteriana associada à peri-implantite, têm sido frequentemente identificadas espécies Gram negativas pigmentadas e anaeróbias, como por exemplo Tf, Fn, Cr, Pm e Pi (Mombelli, van Oosten et al. 1987; Meffert 1996; Hultin, Gustafsson et al. 2002; Chen and Darby 2003; Klinge, Hultin et al. 2005). Existem outros microrganismos que, apesar de não serem tão frequentemente associados à periodontite, foram também frequentemente isolados de bolsas peri-implantares, como é o exemplo de Candida, Staphylococcus e Neisseria (Kocar, Seme et al. ; Alcoforado, Rams et al. 1991; Hultin, Gustafsson et al. 2002; Klinge, Hultin et al. 2005; Pye, Lockhart et al. 2009).
Colheita Microbiológica de Bolsas Periodontais
É de ter em conta, no entanto, que existem muitos fatores que condicionem o diagnóstico microbiológico e que, por essa razão, nem sempre uma colheita nos leva a uma detecção acertada. A saber é relevante a seleção dos locais a analisar, os métodos de colheita de amostras, o transporte das mesmas e aspectos específicos referentes à metodologia.
Previamente à colheita de amostras subgengivais, a placa supragengival deve ser removida de forma a evitar contaminação. Frequentemente a colheita de amostras para avaliação microbiológica de bolsas periodontais é feita através da utilização de curetas ou pontas de papel absorvente. As amostras de placa bacteriana colhidas com curetas são usadas sobretudo para avaliação com microscópio de campo escuro e para cultura microbiológica. É de salientar que, independentemente do método, existe sempre uma incompatibilidade relativa entre a dimensão do instrumento a utilizar para colher a amostra (cone de papel 300µm, cureta 800µm) comparativamente ao orifício de entrada de uma bolsa periodontal de 4 mm (150µm). Este facto sugere que não existe nenhuma forma de colheita microbiológica de utilização corrente, que providencie uma colheita primorosa e exata.
As pontas de papel têm a capacidade para remover os microrganismos que se encontram aderentes ao tecido da parede interna da bolsa periodontal, mas por outro lado, deixam na bolsa os microrganismos mais aderente à superfície dentária (Tanner and Goodson 1986). Renvert e colaboradores (1992) observaram que as pontas de papel recuperam um maior número de unidades formadoras de colónias (CFU) do que as amostras conseguidas com a utilização de curetas. Diferenças qualitativas foram ainda encontradas em microrganismos isolados por diferentes métodos. Espécies Bacteroides, Espiroquetas encontradas em maior número quando as amostras eram colhidas por pontas de papel absorvente (Lang, Kiel et al. 1983; Renvert, Wikstrom et al. 1992).
Avaliação Microbiológica
A avaliação microscópica é das mais simples e antigas formas de se monitorar morfotipos bacterianos. Entre as técnicas possíveis destaca-se a Microscopia de Campo Escuro. Neste tipo de avaliação, e porque o condensador do microscópio não permite a passagem direta de luz, as amostras são atravessadas pela luz num ângulo oblíquo. Apenas a luz que encontra os microrganismos é reflectida e captada pela objectiva. Toda a restante luz é perdida e por isso o campo torna-se escuro. Este método é útil para a detecção de bactérias (exemplo de Espiroquetas, Treponema denticola) que são difíceis de cultivar. Estas espécies aparecem extremamente brilhantes sobre um fundo de campo escuro. O número total de microrganismos é contabilizado e os morfotipos são determinados. Esta avaliação pode ser uma ferramenta de diagnóstico na avaliação do paciente. Listgarten e Hellden (1978) observaram amostras de placa bacteriana subgengival com uma ampliação de 1220 vezes e notaram que numa situação de saúde periodontal, existia uma percentagem de 90% de células cocóides e bastonetes e apenas 1.8% de Espiroquetas (Listgarten and Hellden 1978).
INTRODUÇÃO
Cultura de Microrganismos
A cultura de microrganismos é a forma mais generalizada para avaliação microbiológica. É considerada a metodologia de referência para identificar bactérias subgengivais e oferece uma grande versatilidade no que respeita à análise de todos os componentes major dos microrganismos.
No entanto, trata-se de uma metodologia muito sensível tecnicamente, especialmente se o objetivo for cultivar microrganismos anaeróbios. Nem todos os microrganismos podem ser cultivados, e muito menos cultivados na proporção exata em que se encontravam no ambiente oral. A extensão a que os microrganismos irão crescer e desenvolver-se em cultura, está também dependente das características do ambiente artificial, mais concretamente, está dependente da quantidade de oxigénio e dióxido de carbono, da temperatura, do pH, da mistura de gases, da viscosidade do meio, da presença de outros microrganismos e obviamente, dos nutrientes presentes.
Para se proceder à cultura de uma determinada espécie bacteriana, é necessário primeiro que se proceda a uma cultura não-seletiva por um período de 5 a 7 dias. A cultura em meio específico é então necessária para detectar espécies periodontais específicas. A avaliação inclui a avaliação da morfologia das colónias e a contagem do número total de colónias isoladas. A identificação definitiva da maioria das espécies periodontais requer avaliação bioquímica extensa, incluindo análise de produtos finais metabólicos.
Avaliações Imunológicas
As técnicas imunológicas, como é o caso das de imunofluorescência e enzyme-liked immunosorbent assay (ELISA) são capazes de detectar a presença e proporções relativas de espécies bacterianas selecionadas. Estas técnicas dependem da disponibilidade de anticorpos específicos que se ligarão a antigenes bacterianos.
Na técnica de imunofluorescência, o anticorpo é marcado com um marcador fluorescente. No ELISA o anticorpo primário é detectado através de uma reação colorimétrica após ligação ao anticorpo.
Aglutinação Látex
Está a tornar-se um método standard na avaliação clínica de patógenos periodontais. É rápido e requer pouco equipamento ou competências técnicas. Este teste envolve o uso de leitos de látex com anticorpos específicos para a detecção de terminada espécie. Quando este meio entra em contacto com a superfície do microrganismo, ocorrem reações cruzadas e formam-se amontoados visíveis a olho nu num espaço de 2 a 5 minutos. Este método é muito específico e eficazmente utilizado para detectar Pg, Aa e Pi presentes na placa bacteriana (Zambon, Bochacki et al. 1986; Nisengard, Mikulski et al. 1992).
ELISA
Este teste baseia-se na presença de reagentes serológicos específicos que se ligam a determinadas espécies presentes em matrizes de poliestireno. A amostra bacteriana é dispersada num meio tampão adicionando um detergente e anticorpos marcados. A união a bactérias alvo é detectada através da adição de um segundo anticorpo conjugado com uma enzima e o respectivo substrato.
Sondas DNA
A tecnologia de hibridação de ácidos nucleicos utilizando sondas para o genoma no seu todo ou para ácido desoxyrribonucleico (DNA) específico para determinada espécie permitem a detecção de tão poucas células quando 103. A vantagem deste método é a rápida identificação de espécies bacterianas e não depende da sua viabilidade após colheita.
INTRODUÇÃO
O DNA bacteriano é desnaturado de forma a obter uma cadeia única de DNA. Depois de rotuladas, sondas de DNA específicas para pré-determinadas espécies são adicionadas de forma a hibridizar com DNA e ácido ribonucleico (RNA) complementares. Depois de lavadas as amostras, de forma a remover as sondas remanescentes, as posições das sondas hibridizadas identificam uma específica bactéria. As sondas marcadas com radioisótopos identificam as bactérias presentes na amostra através da autoradiografia. Se um determinado DNA bacteriano for previamente separado por electroforese, este método será então denominado de Southern Blot.
Testes Enzimáticos
Determinadas espécies bacterianas podem ser detectadas através da identificação de enzimas que lhes sejam únicas. Uma forma de o fazer é através da exposição da amostra que possa ser hidrolisada por apenas uma enzima específica. Por exemplo o benzoil arginina naftilamida (BANA) é hidrolisado por enzimas tripsin-like produzidas pelo T. denticola, B. forsythus, e P. gingivalis.
Durante a hidrólise um cromóforo (naftilamida) é libertado e o substrato incolor torna-se laranja. A intensidade da reação colorimétrica é proporcional à concentração da bactéria. Uma vez que qualquer uma das três bactérias em causa se encontra associada com a periodontite, a detecção da enzima “tripsin- like” pode ser usada para indicar a presença dessas 3 bactérias numa amostra de placa bacteriana (Loesche 1986).
Influência do edentulismo parcial na microbiota implantar:
Tem sido demonstrado que a microflora que coloniza os implantes dentários é semelhante àquela que coloniza os dentes naturais (Apse, Ellen et al. 1989; Quirynen and Listgarten 1990; Meffert 1993). Assim a remoção da placa bacteriana e cálculo em toda a dentição é essencial para a manutenção da saúde peri-implantar.
Uma vez que a microflora é estabelecida, logo após a cirurgia de colocação do implante, não são esperadas grandes alterações na qualidade microbiológica numa situação de saúde clínica. É sabido que a microflora supragengival é estabelecida ao fim de 14 dias após a colocação do implante, enquanto que a microflora subgengival leva cerca de 28 dias a estabelecer-se.
A microflora supragengival consiste em pelo menos 85% de cocos sendo também cerca de 80% constituída por bactérias gram-positivas. No que respeita às espécies encontradas a nível subgengival, destacam-se as espécies Haemophilus, Veillonella parvula (Vp), Capnocytophaga sputigena, Eikenella corrodens, Fusobacterium nucleatum e raramente Bacteroides (Nakou, Mikx et al. 1987; Mombelli, Buser et al. 1988; Koka, Razzoog et al. 1993).
Lee examinou a microbiota pré- e pós-osteointegração dos implantes, dentes e língua, recorrendo a sondas de DNA. Da avaliação em causa os autores concluíram que a língua alojava a totalidade das bactérias que viriam a constituir a placa subgengival peri-implantar. Apesar de uma forma menos evidente, os dentes serviam também de reservatórios bacterianos para as bactérias colonizadoras dos implantes (Lee, Maiden et al. 1999).
Em caso de patologia periodontal, as bolsas periodontais funcionam como reservatórios para a colonização bacteriana no leito implantar (Rams, Roberts et al. 1984; Lang, Wilson et al. 2000; Salvi and Lang 2004; Klinge, Hultin et al. 2005; Karoussis, Kotsovilis et al. 2007; Quirynen, Abarca et al. 2007; Al-Zahrani 2008; Carcuac and Jansson 2010; Greenstein, Cavallaro et al. 2010; Heitz-Mayfield and Lang 2010; Simonis, Dufour et al. 2010). Como já foi visto anteriormente neste trabalho, a existência desta translocação bacteriana implica que implantes em pacientes parcialmente edêntulos possuam maior risco de desenvolver peri-implantite uma vez que apresentam uma flora mais patogénica do que implantes colocados em pacientes totalmente desdentados (Kocar, Seme et al. ; Meffert 1996; Quirynen, Abarca et al. 2007; Kocar, Seme et al. 2010).
INTRODUÇÃO
Utilizando testes de aglutinação de látex, Kalykakis e colaboradores observaram que pacientes desdentados parciais acumulavam mais placa bacteriana do que os desdentados totais, e especificamente bactérias como Pg e Pi eram mais frequentemente encontradas nos desdentados parciais (Kalykakis, Mojon et al. 1998).
Por outro lado, foi também observado que, quando no mesmo maxilar existem bolsas com determinas bactérias patogénicas, as mesmas bactérias são encontradas a colonizar os sulcos peri-implantares e em maior número que nas referidas bolsas periodontais (Quirynen, Papaioannou et al. 1996).
Apesar de tudo o que foi já referido, não existe informação ainda suficiente para discernir quais os microrganismos iniciadores e promotores das peri-implantites (Kocar, Seme et al.). Porém, e uma vez que está provada a translocação de microrganismos das bolsas periodontais para as superfícies implantares, é fundamental iniciar a terapia periodontal em pacientes com periodontite ativa antes da colocação de implantes, de forma a diminuir o seu potencial patogénico e inibi-los de colonizar os implantes (Renvert and Persson 2009; Greenstein, Cavallaro et al. 2010; Heitz-Mayfield and Lang 2010). E tal qual acontece para a periodontite, temos ainda que considerar a susceptibilidade do hospedeiro como fator fundamental para permitir dano peri- implantar face a uma estabelecida virulência dos microrganismos que certamente influem na severidade e no estabelecimento da doença peri- implantar (Meijndert, van der Reijden et al. 2010)
Influência do edentulismo total na microbiota implantar:
Em pacientes edêntulos, o principal reservatório de colonização bacteriana são as mucosas orais como a língua e a mucosa jugal (Kocar, Seme et al. ; Salvi and Lang 2004; Fernandes, Aquino et al. 2010). Provavelmente por essa razão, tem sido demonstrado que as bactérias encontradas em casos de reabilitações parciais com implantes são mais patogénicas (especialmente gram negativas e espiroquetas) do que nos casos de reabilitações totais (Meffert 1996). Foi também observado que, após extração dentária, espécies
como Aa e Pg não são frequentemente isoladas em locais que posteriormente desenvolvam patologia peri-implantar mesmo quando haviam sido previamente detectadas em torno dos dentes extraídos (Fardal, Johannessen et al. 1999; Klinge, Hultin et al. 2005; Greenstein, Cavallaro et al. 2010). Por outro lado, alguns autores têm reportado uma possível re-emergência de bactérias patogénicas num período de até doze meses com um espectro semelhante àquele diagnosticado previamente às extrações devido à sua permanência por exemplo no dorso da língua (Kocar, Seme et al. ; Emrani, Chee et al. 2009; Fernandes, Aquino et al. 2010; Kocar, Seme et al. 2010; Meijndert, van der Reijden et al. 2010).