MÉTODOS ANALÍTICOS

4.4.1. Composição em Ácidos Graxos

A composição em AG do PA e PATH foi obtida por cromatografia em fase gasosa, de acordo com o método da AOCS Ce 2-66 (AOCS, 2004) utilizando o cromatógrafo Agilent 6850 Series II

single channel GC, Santa Clara, EUA, após a esterificação segundo Hartman e Lago (1973). A coluna

capilar utilizada foi a DB-23 AGILENT (50 % cianopropil–metilpolisiloxano, d.i=60 m x 0,25 mm e 0,25 µm de espessura de filme), condições de análise: fluxo de 1,0 mL/min; velocidade linear de 24 cm/s; temperatura do detector de 280 ˚C; temperatura do injetor de 250 ˚C; programação da temperatura do forno: 110 ˚C por 5 min, 110–215˚C (5 ˚C/min), 215 ˚C–24 min; Gás de arraste: hélio; Volume injetado: 1,0 μL, split 1:50. A composição qualitativa foi determinada por comparação dos tempos de retenção dos picos com os dos respectivos padrões para AGs e a quantificação foi determinada por normalização da área dos picos. As análises foram conduzidas em duplicata.

4.4.2. Composição em Triacilgliceróis

Essa análise foi realizada no PA e PATH, em cromatógrafo gasoso capilar Agilent 6850

Series II single channel GC, Santa Clara, EUA. Com uma coluna capilar DB-17HT Agilent Catalog 122-

1811 (50%-fenilmetilpolisiloxano), d.i.=15 m x 0,25 mm e 0,15 μm de filme. Condições de análise: injeção split, razão de 1:100; temperatura da coluna: 250 ˚C, programada até 340 ˚C à razão de 5 ˚C/min; gás de arraste: hélio, em vazão de 1,0 mL/min; temperatura do injetor: 375 ˚C; temperatura do detector: 375 ˚C; volume injetado: 1,0 L; concentração da amostra: 100 mg/5 mL de tetrahidrofurano. A identificação dos grupos de TAGs foi realizada por comparação dos tempos de retenção, segundo os procedimentos de Antoniosi Filho, Mendes & Lanças (1995). As análises foram conduzidas em duplicata.

4.4.3. Comportamento Térmico do MP e das MPLs com e sem Ativo

As análises térmicas foram realizadas por calorimetria diferencial de varredura (DSC), conforme o método descrito pela AOCS Cj 1-94 (AOCS, 2004). Para essas análises foi utilizado um calorímetro modelo 2920 Modulated DSC, marca TA Instruments (New Castle, Delaware, EUA). Para cada análise, foram pesados cerca de 5 mg de amostra em cápsulas herméticas de alumínio. O PA, o PATH e as MPLs sem ativo foram submetidos ao seguinte programa de temperatura: temperatura ambiente equilibrada a 80 °C e mantida por 10 minutos, resfriada a -70 °C a uma taxa de 5 °C/min, mantida 30 minutos e aquecida a 80 °C a uma taxa de 5 °C/min. Enquanto as MPLs com o ativo foram submetidas ao seguinte programa de temperatura para detecção do pico do AA: temperatura ambiente

equilibrada a 80 °C e mantida por 5 minutos, resfriada a -70 °C a uma taxa de 5 °C/min, mantida 30 minutos e aquecida a 250 °C a uma taxa de 5 °C/min mantida 5 minutos. O software do equipamento foi utilizado para a obtenção das curvas térmicas e para definir os parâmetros de cristalização e fusão. As análises foram conduzidas em duplicata.

4.4.4. Distribuição de Tamanho e Diâmetro Médio das MPLs

A distribuição do tamanho das MPLs com e sem ativo foi determinada por difração a laser utilizando o equipamento Mastersizer S (Malvern Instruments, Malvern, UK) através do acessório

Scirocco de dispersão em ar comprimido. A distribuição do tamanho das partículas foi monitorada

durante cada uma das medições, até que as leituras sucessivas tornassem constantes (CONSOLI et

al., 2016). O diâmetro médio foi determinado com base na relação área superficial/volume, através do

parâmetro D[43] (Equação 3). Onde di é o diâmetro das partículas e n é o número de partículas. A

distribuição do tamanho foi identificada através dos parâmetros: d (0,1), d (0,5) e d (0,9), que representam o diâmetro da distribuição acumulada de 10%, 50% e 90% das partículas totais. O valor

Span (índice de polidispersidade), que dá a largura da distribuição de tamanho, foi calculado a partir da

Equação (4) (JINAPONG, SUPHANTHARIKA, & JAMNONG, 2008). Cada amostra foi analisada em triplicata.

(3)

(4)

4.4.5. Morfologia de Superfície por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Para análise da morfologia das micropartículas com e sem AA foi utilizado um microscópio eletrônico de varredura com detector de energia dispersiva de raios-X, SEM: Leo 440i, EDS 6070, SEM/EDS: LEO Microscopia Eletrônica/Oxford (Cambridge, Inglaterra). As análises foram realizadas com voltagem de aceleração de 10 kV e uma corrente de feixe de 50 pA. Foram utilizadas as imagens com ampliação de 500x e 5000x. Foram realizadas micrografias de cada duplicata.

Antes da obtenção das imagens, foi necessário recobrir as amostras com uma camada de ouro, por não serem elas compostas por materiais metálicos. O equipamento utilizado foi um metalizador Sputter Coater POLARON (marca VG Microtech, modelo SC7620, Uckfield, Inglaterra).

4.4.6. Eficiência de Encapsulação Total (EET)

A EET foi determinada a partir da adição de 180 mg de MPLs com AA em 10 ml de clorofórmio para romper as partículas, liberar o composto e assim, quantificar todo o ativo presente. Em seguida, a suspensão foi inserida em tubos com tampa de polipropileno, para centrifugação. Na centrífuga, modelo AP-56 Phoenix Luferco, os tubos foram submetidos a uma agitação por 10 s, por duas vezes, com um intervalo de 10 min entre as agitações. Encerrado esse processo, foram adicionados 10 mL de água destilada aos tubos, submetendo-os à agitação por 1 min, por duas vezes, com descanso de 10 min entre as agitações. Posteriormente, os tubos foram levados a centrifugação por 10 min a 10.000 rpm, seguindo a metodologia descrita por Leonel et al. (2010), com algumas adaptações. A quantidade de AA presente na amostra foi determinada ao final da centrifugação pelo método descrito no Item 4.4.8. A EET das MPLs foi obtida a partir da Equação 5, ou seja, como a razão entre a quantidade total de AA presente na amostra (AAT) e a quantidade inicial de AA adicionada no

sistema lipídico (AAA), em base úmida. Cada análise foi feita em triplicata.

(5)

4.4.7. Eficiência de Encapsulação Efetiva (EEE)

Para a determinação do teor de AA superficial (AAS), ou seja, o AA presente somente na

superfície das MPLs, foi realizada utilizando à metodologia descrita por Ribeiro et al. (2012), com algumas adequações. Em um erlenmeyer de 125 mL, 180 mg de MPLs foram suspensas em 10 mL de solução de Tween 80 (0,1 %). As amostras foram mantidas sob agitação em uma incubadora com agitação orbital (TE-420 Tecnal), a 100 rpm por um período de 5 min. Em seguida, a suspensão foi filtrada em papel de filtro Whatman (Cat n°1001-110) e o teor de ácido ascórbico foi determinado de acordo com o Item 4.4.8. A EEE foi calculada a partir dos valores de AAS, ácido ascórbico total (AAT) e

a AAA, ambos em base úmida, através da Equação 6. Cada análise foi feita em triplicata

(6)

4.4.8. Determinação do teor de ácido ascórbico nas MPLs – Espectrofotômetro

A curva padrão (R2 _{= 0,997) foi preparada com concentrações de AA variando de 1-10}

ppm (mg/L), em metanol. Uma alíquota de 13,80 µL da amostra contendo o ativo, preparada de acordo com os procedimentos em 4.4.6 ou 4.4.7, foi adicionada a 4986,11 µL de metanol. Para a determinação do teor de AA nas MPLs as absorbâncias das soluções foram lidas em espectrofotômetro

(modelo SQ-2800 UV/VIS, marca UNICO, United Products & Instruments Inc., Nova Jersey, EUA) por varredura espectral (200-400 nm), a cada 5 nm. Como controle para calibrar o aparelho foi utilizado o respectivo solvente (metanol). A quantidade de AA foi expressa em mg de ácido ascórbico/mg de amostra, sendo calculada a partir da média ± desvio padrão de três repetições.

4.4.9. Microscopia por Hot-stage

As alterações físicas durante o aquecimento das MPLs com AA foram monitoradas por Microscopia Hot-stage (MHS). Foi utilizada uma placa Linkam (THMS 600, Linkam Scientific Instruments Ltd., Reino Unido) ligada a um controlador de temperatura (FP 5 Mettler). Uma pequena quantidade de micropartículas foi colocada em lâminas, coberta com lamínulas e colocadas no suporte de amostra e foi aquecida até 80 °C a uma taxa de 10 °C / min. As mudanças nas amostras foram observadas através de um microscópio óptico (Nikon, Modelo AZ100, Japão) com ampliação de 40x. As análises foram feitas em duplicata.

4.4.10. Polimorfismo

As formas polimórficas do material de parede e das MPLs com AA foram determinadas por difração de Raios-X, segundo o método AOCS Cj 2-95 (AOCS, 2004). As análises foram realizadas em difratômetro Philips (PW 1710, Holanda), utilizando a geometria Bragg-Brentano (:2) com radiação de Cu-k ( = 1.54056 Å, tensão de 40 KV e corrente de 40 mA). As medidas foram obtidas com passos de 0,02˚ em 2 e tempo de aquisição de 1 segundo, com varreduras de 5 a 40˚ (escala 2). A quantidade de cada polimorfo foi estimada pela intensidade relativa do short spacings (SCHENCK & PESCHAR, 2004; MARANGONI, 2005). A análise foi feita em uma única repetição.