RESUMO
Dominância nucleolar é considerada um fenômeno epigenético comum em híbridos interespecíficos, em que conjuntos de genes RNA ribossômicos herdados de um parental são preferencialmente transcritos em relação ao outro. No presente trabalho, é descrito a ocorrência de dominância nucleolar em peixes da linhagem híbrida “Piaupara”, resultante do cruzamento entre fêmea de Leporinus macrocephalus (Piauçu) e macho de L. elongatus (Piapara). As análises demonstraram que, no híbrido, a região nucleolar do cromossomo herdado de L. elongatus apresentou maior atividade, com expressão gênica em 100% das células, enquanto que a de L. macrocephalus apareceu ativa numa freqüência de 11,6%. A aplicação da técnica de hibridização in situ com sonda 18S mostrou que o DNA ribossômico da formação nucleolar não foi perdido no híbrido, pois os resultados demonstraram invariavelmente marcações em dois cromossomos, cada um proveniente de um dos parentais. Estes dados confirmam que nas células coradas pela Prata onde apenas uma NOR estava ativa, ocorreu o efeito de dominância nucleolar, apesar desta ser uma dominância parcial. Um aspecto interessante em relação à diferença entre a região organizadora nucleolar das espécies parentais foi a associação da NOR com blocos heterocromáticos, evidenciada em L. elongatus. Do ponto de vista citogenético, sugere-se que a presença de DNA repetitivo associada à NOR em L. elongatus possa se constituir num elemento determinante no estabelecimento do processo de dominância nucleolar. Esse é o primeiro relato de dominância nucleolar em peixes Neotropicais e o híbrido “Piaupara” demonstrou ser um modelo de estudo interessante e promissor em análises enfocando o melhor entendimento deste fenômeno nesses peixes.
INTRODUÇÃO
Duas classes distintas de genes que codificam RNA ribossômico (RNAr) podem ser encontradas nos animais, sendo a classe maior do DNA ribossomal (DNAr) 45S composta pelos genes 18S, 5.8S e 28S e a classe menor de DNAr 5S (Long e Dawid, 1980). As regiões organizadoras de nucléolo (NORs) são loci genéticos em eucariontes em que os genes que codificam o precursor dos três maiores segmentos de RNAr estão agrupados em centenas ou milhares de cópias, coletivamente abrangendo milhões de pares de bases ao longo do cromossomo (Ritossa e Spiegelman, 1965; Wallace e Birnstiel, 1966; Phillips et al., 1971). A transcrição dos genes RNAr pela RNA polimerase I resulta na formação do nucléolo, a região nuclear onde ocorre a biogênese dos ribossomos (Karpen et al., 1988).
Dominância nucleolar é considerada um fenômeno epigenético observado em células de híbridos interespecíficos, em que a NOR proveniente de uma espécie parental é dominante em relação à outra, ou seja, enquanto a NOR de um parental é ativa a outra é silenciada. Este fenômeno foi descrito primeiramente em híbridos de plantas do gênero Crepis por Navashin em 1934, e atualmente muitos estudos estão sendo realizados no intuito de desvendar os mecanismos pelo qual a dominância se estabelece (Pikaard, 2000a, b; McStay, 2006).
Como em outros fenômenos epigenéticos, modificações na cromatina forçam o silenciamento dos genes RNAr de um dos parentais na dominância nucleolar. No entanto, os mecanismos que discriminam qual conjunto RNAr parental é o dominante ou o silenciado ainda não estão claros (Pikaard, 2000a). Em geral, dominância nucleolar parece ser uma conseqüência da divergência evolutiva dos genes RNAr e/ou seus mecanismos de regulação da transcrição (Wallace e Langridge, 1971; Reeder, 1985).
Um mecanismo considerado muito importante na dominância nucleolar se baseia no modelo de “enhancer imbalance” (desequilíbrio de reforços), primeiramente estudado entre híbridos do anfíbio Xenopus laevis e X. borealis (Reeder e Roan, 1984; Reeder, 1985; Caudy e Pikaard, 2002). Este modelo se baseia no fato de que um maior número de elementos repetitivos (enhancer) e diferenças na seqüência dos espaçadores intergênicos do DNAr 45S de uma espécie, poderia retirar fatores essenciais da transcrição, de forma a deixar os genes RNAr da outra espécie inativos por impedir de acessá-los.
O fenômeno de dominância nucleolar tem sido bem caracterizado em numerosos híbridos interespecíficos de plantas (Martini et al., 1982; Flavell et al., 1988; Chen e Pikaard, 1997; Chen et al., 1998; Lewis e Pikaard, 2001) e do mesmo modo, estudos também têm se mostrado importante em alguns animais como em híbridos de Drosophila (Durica e Krider, 1978; Oliveira et al., 2006b; Commar et al., 2007) e anfíbios Xenopus (Honjo e Reeder, 1973; Reeder e Roan, 1984; Caudy e Pikaard, 2002), enquanto em peixes são restritos a poucos dados apenas descritivos (Ueda et al., 1988; Ueda e Kobayashi, 1990, Gold et al., 1991).
Um novo relato deste fenômeno em peixes foi descrito por Hashimoto et al. (Capítulo 1) em híbridos interespecíficos da família Anostomidae, no entanto o principal objetivo do trabalho foi buscar marcadores citogenéticos diagnósticos que diferenciassem parentais e híbridos. Nestas análises, o estudo de marcação da NOR pelo nitrato de Prata demonstrou variações na expressão destas regiões no híbrido, com uma maior atividade da NOR herdada de um dos parentais, caracterizando uma descrição prévia sobre a ocorrência do processo de dominância nucleolar.
Deste modo, para um melhor entendimento sobre este efeito nucleolar nestes peixes, o objetivo deste estudo foi analisar citogeneticamente o fenômeno de
dominância nucleolar em híbridos interespecíficos artificiais, resultantes do cruzamento entre fêmeas de Leporinus macrocephalus e machos de L. elongatus.
MATERIAIS E MÉTODOS
Na linhagem parental, 19 exemplares de Leporinus macrocephalus (14 machos e 5 fêmeas) e 20 indivíduos de Leporinus elongatus (12 machos e 8 fêmeas) foram analisados citogeneticamente. Cruzamentos artificiais realizados entre estas espécies resultaram na produção do híbrido interespecífico “Piaupara”, a linhagem entre fêmeas de L. macrocephalus e machos de L. elongatus, cujas análises citogenéticas compreenderam 21 exemplares (8 machos e 13 fêmeas). Todas as amostras estudadas foram obtidas do estoque pertencente à Piscicultura Kabeya, Penápolis (SP), Brasil, que também é o local onde os híbridos foram produzidos artificialmente. Os estoques parentais de L. elongatus e L. macrocephalus cultivados nesta piscicultura, foram derivados de amostras de peixes coletados no pantanal Sul Mato-grossense. Os peixes analisados foram identificados e depositados na coleção de peixes do Laboratório de Genética de Peixes, UNESP, Bauru (SP), Brasil.
Para os estudos citogenéticos, os exemplares foram previamente submetidos à técnica de estimulação mitótica (Oliveira et al., 1988). Em seguida, preparações cromossômicas foram obtidas de fragmentos de tecidos de rins e brânquias, utilizando o método descrito por Foresti et al. (1981). A coloração por nitrato de Prata das regiões organizadoras de nucléolo foi realizada de acordo com Howell e Black (1980) e análises de heterocromatina constitutiva foram realizadas com base na técnica de bandamento C (Sumner, 1972). Para realização da técnica de hibridização fluorescente in situ foram utilizadas a sonda sexo-específica (LeSpeI) isolada de
Leporinus elongatus, preparada e cedida pela Dra. Patricia Pasquali Parise Maltempi, e a sonda de DNA ribossômico 18S obtida de Oreochromis niloticus, preparada e cedida pelo Dr. Cláudio de Oliveira. As sondas foram marcadas por meio da incorporação da biotina-dATP pela técnica de nick translation (BionickTM
Labelling System-Gibco.BRL). Após as marcações, procedeu-se a técnica de hibridização utilizada por Porto-Foresti et al. (2002) e as lâminas foram contra- coradas com DAPI.
A morfologia cromossômica foi determinada de conformidade com o proposto por Levan et al. (1964), com os cromossomos sendo classificados em metacêntrico (M), submetacêntrico (SM), subtelocêntrico (ST) e acrocêntrico (A).
RESULTADOS
Os resultados da análise citogenética nas espécies parentais e no híbrido mostraram identidade no número diplóide de 54 cromossomos e na morfologia cromossômica dos tipos meta e submetacêntricos, além da ocorrência de heteromorfismo cromossômico sexual do tipo ZZ/ZW. A identificação das NORs por meio da coloração com Prata revelou nas espécies Leporinus macrocephalus e L. elongatus apenas um par de cromossomos portadores de cístrons ribossômicos. A NOR localizou-se na posição terminal de um par cromossômico submetacêntrico em ambas as espécies (Figura 1), no entanto, os pares cromossômicos de uma espécie em relação à outra apresentaram diferenças de tamanhos e/ou formas.
Figura 1 - Metáfases das espécies parentais L. macrocephalus (a) e L. elongatus (b) submetidas à
coloração de Prata. Setas indicam os pares portadores da NOR.
A aplicação do bandamento C em preparações cromossômicas das espécies parentais possibilitou observar no cromossomo da NOR de L. elongatus a presença de blocos heterocromáticos associados com a região da constrição secundária (NOR), diferentemente de L. macrocephalus em que não foi observada esta situação (Figura 2). Desta forma, em exemplares de L. elongatus, utilizou-se a técnica de hibridização in situ com a sonda de DNA repetitivo LeSpeI, demonstrando que estes blocos heterocromáticos associados com a NOR também apresentaram homologia com a sonda LeSpeI, pois foram hibridizados pela mesma (Figura 3). Além disso, observaram-se várias outras marcações distribuídas nos cromossomos da NOR e no cromossomo W. As fêmeas tiveram o cromossomo W hibridizado em alguns loci, além de regiões do par cromossômico portador da NOR, porém com diferentes marcações entre os homólogos; em contrapartida, os machos também demonstraram marcações nos cromossomos da NOR, que se apresentaram semelhantes em ambos os cromossomos homólogos.
Figura 2 - Cromossomos portadores da NOR de L. macrocephalus (1) e L. elongatus (2). (a)
representação esquemática, (b) coloração com nitrato de Prata, (c) bandamento C, com heterocromatina associada à constrição secundária apenas em L. elongatus e (d) FISH demonstrando homologia da sonda de DNA repetitivo LeSpeI com a heterocromatina.
Figura 3 - Metáfases de macho (a) e fêmea (b) de L. elongatus, submetidas à técnica de FISH com a
sonda LeSpeI. Estrela mostra as marcações no cromossomo W e as setas indicam os cromossomos portadores da NOR marcados pela sonda, com a heterocromatina associada à constrição secundária (NOR) também exibindo marcações.
Em metáfases do híbrido “Piaupara”, as regiões nucleolares herdadas de cada parental revelaram diferenças de atividade gênica pela técnica de nitrato de Prata. De um total de 1.710 células analisadas, 88,4% (1.512 metáfases) apresentaram NOR
a b
a2 b2 c2
a1 b1 c1
enquanto que somente 11,6% (198 metáfases) revelaram atividade da NOR em dois cromossomos, que não são homólogos, tendo em vista as diferenças em relação às suas morfologias, sendo um herdado de L. elongatus e o outro de L. macrocephalus (Figura 4). Nos híbridos, as diferenças de atividade da NOR se apresentaram similares entre indivíduos machos e fêmeas.
Figura 4 - Metáfases do híbrido “Piaupara” corado com nitrato de Prata. Em (a), marcação apenas no cromossomo proveniente de L. elongatus, e em (b), dois cromossomos marcados (um de cada parental). Setas escuras indicam o cromossomo da NOR de L. elongatus e seta clara de L. macrocephalus.
Utilizando o método de FISH com sonda de DNAr 18S, as análises em preparações cromossômicas do híbrido “Piaupara” mostraram marcações presentes na região telomérica do braço longo de dois cromossomos submetacêntricos, que se apresentaram diferentes em relação às suas morfologias, indicando não serem homólogos e correspondendo aos cromossomos portadores da NOR das espécies parentais (Figura 5).
Figura 5 - Metáfases do híbrido interespecífico “Piaupara”, submetidas à técnica de FISH com sonda de
DNAr 18S. Marcações de DNAr 18S estão indicadas por setas brancas no cromossomo de L. elongatus e setas azuis de L. macrocephalus.
DISCUSSÃO
No presente estudo, as características citogenéticas de Leporinus macrocephalus e L. elongatus obtidas com dados de número diplóide, número fundamental, cromossomos sexuais, padrões de bandamento C e NOR estão de acordo com os resultados recentemente discutidos por Hashimoto et al. (Capítulos 1 e 2). Com relação às regiões nucleolares, o par cromossômico portador da NOR de L. macrocephalus apresentou diferente tamanho e/ou morfologia em relação ao de L. elongatus, demonstrou ser um fato fundamental para as análises de dominância nucleolar na linhagem híbrida “Piaupara”. Diferentemente, em estudos de híbridos de ciprinídeos (Gold et al., 1991), apenas a morfologia dos cromossomos não foi o suficiente para distinguir o cromossomo parental portador da NOR que o apresentava ativo no híbrido, sendo necessário utilizar o bandamento G para tal
Sabe-se que as NORs representam regiões dos cromossomos envolvidas na transcrição dos genes ribossômicos e, de acordo com sua atividade na intérfase que precede à mitose, podem ser visualizadas após coloração com nitrato de Prata (Goodpasture e Bloom, 1975; Miller et al., 1976; Howell e Black, 1980). A coloração pelo nitrato de Prata detecta NORs ativas, uma vez que o material corado não é o DNAr mas sim um conjunto de proteínas ácidas envolvidas no processo de produção dos ribossomos (Howell, 1977; Jordan, 1987), tornando o uso desta coloração uma excelente ferramenta que permite o estudo de atividade dos genes ribossômicos através da citogenética.
Em referência a estes aspectos, as variações encontradas pela coloração de Prata em metáfases do híbrido “Piaupara” são devidas a diferenças de atividade da NOR herdada de cada parental, em que a maior porcentagem das células analisadas teve a região nucleolar ativa apenas no cromossomo proveniente de Leporinus elongatus. Tais variações são decorrentes do fenômeno epigenético de dominância nucleolar.
No intuito de verificar a integridade do DNA ribossômico na formação nucleolar e que possuíam dois sítios de NORs potencialmente ativos em todas as células dos indivíduos híbridos, aplicou-se a técnica de hibridização in situ com sonda 18S, que revela o segmento genômico constituinte da NOR independente de sua atividade, como documentado por outros estudos (Galetti et al., 1995b; Fujiwara et al., 1998; Ferro et al., 2001; Nirchio et al., 2007). Os resultados demonstrando invariavelmente marcações em dois cromossomos, cada um proveniente de um parental, confirmam a ocorrência do efeito de dominância nucleolar nas células coradas pela Prata em que apenas uma NOR estava ativa. Este fenômeno também pode ser descrito como uma dominância parcial, como também relatado por outros autores (Honjo e Reeder, 1973; Gold et al., 1991; Oliveira et al., 2006b).
Assim, considerando que todas as células apresentavam os genes ribossômicos responsáveis pela formação nucleolar de ambos parentais, pode-se observar citogeneticamente que no híbrido a região nucleolar do cromossomo herdado de L. elongatus apresentou maior atividade, com expressão gênica em 100% das células, enquanto que a de L. macrocephalus apareceu ativa somente numa freqüência de 11,6%. Tais dados indicam que a NOR proveniente de Leporinus elongatus mostrou ser dominante em relação à de L. macrocephalus, estando ativa na maioria das células. Neste caso, enquanto a NOR de um parental é ativa a outra é silenciada.
Do ponto de vista citogenético, em relação aos mecanismos pela qual esta dominância é definida, um dado interessante a ser discutido é a presença de blocos heterocromáticos associados com o DNA ribossômico em L. elongatus. Esta situação parece identificar a ocorrência do modelo de “enhancer imbalance”, primeiramente descrita em híbridos de anfíbios Xenopus (Reeder e Roan, 1984; Caudy e Pikaard, 2002) e encontrada em situações similares em outros organismos (Simeone et al., 1985; Reeder, 1985; Goodrich-Young e Krider, 1989). Isto porque a heterocromatina geralmente é composta por DNA altamente repetitivo (Haaf et al., 1993; Reed e Phillips, 1995; Garrido-Ramos et al., 1998; Mestriner et al., 2000; Phillips e Reed, 2000; Mantovani et al., 2004), e como proposto no modelo acima, a presença de DNA repetitivo na região dos espaçadores intergênicos do DNAr 45S de L. elongatus pode servir como enhancers, que influenciam os promotores para a transcrição dos genes ribossômicos (Reeder e Roan, 1984; Labhart e Reeder, 1985; Simeone et al., 1985; Pikaard et al., 1990; Caudy e Pikaard, 2002), de forma a interferir no acesso dos fatores de transcrição aos genes RNAr em Leporinus macrocephalus.
Recentemente, em estudos realizados por Parise-Maltempi et al. (2007), uma nova família de DNA altamente repetitivo nos cromossomos sexuais foram identificadas e isoladas de L. elongatus. Quando este DNA repetitivo é utilizado como sonda para ser aplicado pela técnica de FISH em metáfases de L. elongatus, os resultados demonstraram homologia com as regiões heterocromáticas associadas à NOR, além das marcações nos cromossomos sexuais descritas anteriormente por Parise-Maltempi et al. (2007) e Hashimoto et al. (Capítulo 2). A partir da constatação desta similaridade, estudos por meio de técnicas moleculares tornam-se promissoras, principalmente no sentido de se identificar a relação, localização e organização estrutural destas seqüências associadas às regiões organizadoras de nucléolo em L. elongatus, visto que em L. macrocephalus esta situação não foi observada (Hashimoto et al., Capítulo 2).
Outro fato a ser investigado refere-se aos indícios da presença de DNAr no cromossomo sexual W de L. elongatus, como descrito por Molina e Galetti (2006), quando a identificação da Ag-NOR é realizado em preparações cromossômicas previamente submetidas à substância 5-BrdU. Isto porque em espécies de Drosophila do complexo mulleri, a NOR é encontrada tanto em um microcromossomo quanto no cromossomo sexual X, possibilitando que diferentes situações de dominância nucleolar, provavelmente influenciadas pela presença ou ausência do cromossomo X, sejam observadas entre machos e fêmeas envolvendo híbridos de algumas destas espécies (Bicudo e Richardson, 1977; Durica e Krider, 1977 e 1978; Commar et al., 2007). Entretanto, em nossos dados não foram observadas diferenças significativas entre machos e fêmeas de “Piaupara”, mesmo porque o cromossomo W na fêmea do híbrido é herdado de L. macrocephalus. Assim, para melhor elucidar estas situações seria necessário tanto verificar se L. macrocephalus também apresenta NOR no cromossomo W, quanto realizar análises
no híbrido recíproco “Piapaçu”, que poderá indicar se a NOR do cromossomo W de L. elongatus pode exercer alguma influência de dominância na manifestação da ação gênica destes segmentos.
Dominância nucleolar também pode ser uma conseqüência de um processo regulatório que controla a dosagem efetiva de genes RNAr até mesmo em espécies puras (não-híbridas) (Pikaard, 2000a). As regiões nucleolares podem ser consideradas loci bastante ativos, calculado por volta de 40-80% de transcrição nuclear em células em crescimento (Jacob, 1995). Assim, um sistema de compensação de dosagem poderia explicar a dominância nucleolar parcial relatada no híbrido “Piaupara”. Isto porque a pequena taxa de atividade dos genes ribossômicos de L. macrocephalus possivelmente seja devida a um mecanismo secundário de compensação de dosagem para suprir as necessidades celulares dos ribossomos na síntese de proteínas.
Uma característica recorrente da dominância nucleolar, tanto em plantas como em animais, é que a NOR da mesma espécie é sempre silenciada independente dos efeitos maternais ou paternais. Essa descoberta sugere que diferenças fundamentais ditam os conjuntos de genes RNAr dominante e reprimido em um híbrido, possivelmente por causa de diferenças espécie-específica nos sistemas de transcrição dos progenitores (Reeder, 1985; Pikaard, 2000a).
Alguns estudos anteriores demonstraram que o efeito maternal pode influenciar na dominância nucleolar, como é o caso de híbridos de peixes ciprinídeos, em que a dominância sempre é do cromossomo herdado do parental materno, indicando que possivelmente algum tipo de efeito citoplasmático ou materno está relacionado com a atividade da transcrição de genes RNAr (Gold et al., 1991). No caso do híbrido “Piaupara”, o cromossomo dominante é o herdado de L.
influência de algum fator citoplasmático ou materno, e que provavelmente a dominância deve-se a diferenças do conjunto de genes RNAr entre as espécies parentais.
Até hoje, a escolha dos mecanismos pela qual todo segmento genômico da NOR ou subconjuntos de genes RNAr são silenciados por inativação, ainda permanecem uma questão intrigante (Preuss e Pikaard, 2007). Estudos moleculares recentes evidenciam que o silenciamento gênico na dominância nucleolar é freqüentemente resultado de efeitos combinados do remodelamento da cromatina, metilação do DNA e modificações de histona específicas (Chen e Pikaard, 1997; Chen et al., 1998; Richards e Elgin, 2002; Grummt e Pikaard, 2003).
A ocorrência do processo de dominância nucleolar em híbridos de peixes Neotropicais fornece um excelente material de estudo para o uso de metodologias moleculares mais específicas, apresentando-se como um modelo promissor de estudos enfocando o melhor entendimento e funcionamento deste mecanismo. Os resultados deste trabalho, além de serem os primeiros relatos desse mecanismo em peixes Neotropicais, servem como subsídios para a avaliação deste mecanismo epigenético em outros híbridos envolvendo diferentes espécies de peixes, bem como podem adicionar informações relacionadas ao intenso polimorfismo da NOR em peixes Neotropicais, relatado em diversos trabalhos citogenéticos (Foresti et al., 1981; Almeida-Toledo et al., 2000b).