UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU
Diogo Teruo Hashimoto
Caracterização citogenética e molecular de híbridos interespecíficos
das espécies Piauçu (Leporinus macrocephalus) e Piapara
(Leporinus elongatus), utilizados na piscicultura brasileira
Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista – UNESP, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas. Área de Concentração: Genética.
“Tentemos ensinar generosidade e altruísmo, porque nascemos egoístas. Compreendamos o que nossos próprios genes egoístas tramam, porque assim, pelo menos, poderemos ter a chance de frustrar seus intentos, uma coisa que nenhuma outra espécie jamais aspirou fazer.”
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RESUMO
Dentre as metodologias clássicas de manipulação genética mais comumente aplicada nas pisciculturas, a hibridação interespecífica visa principalmente ao aumento da produtividade e à obtenção de linhagens estéreis. Contudo, híbridos interespecíficos de peixes podem representar sérios riscos biológicos ao meio ambiente, “contaminando geneticamente” estoques naturais ou cultivados e competindo de diversas formas com as linhagens parentais. Assim, torna-se de grande importância a caracterização e monitoramento genético de híbridos produzidos em pisciculturas, identificando as linhagens parentais e os produtos híbridos de maneira clara e acessível. No presente estudo, com a aplicação de técnicas citogenéticas e moleculares foi caracterizada uma linhagem híbrida de exemplares de “Piaupara”, diferenciando-a de seus respectivos parentais, fêmea de Leporinus macrocephalus (Piauçu) e macho de Leporinus elongatus (Piapara). Através das metodologias citogenéticas, foi observado que tanto os parentais Leporinus macrocephalus e L. elongatus quanto o híbrido “Piaupara”, apresentaram número diplóide de 54 cromossomos dos tipos meta e submetacêntricos, morfologicamente muito semelhantes e indistinguíveis pela análise com Giemsa, não sendo possível diferenciá-los. Com relação à marcação da região organizadora de nucléolo (NOR), as espécies parentais demonstraram somente um par cromossômico portador da NOR, com diferentes tamanhos e formas, o que permitiu diferenciar o híbrido “Piaupara” tanto pela técnica de nitrato de Prata quanto pelo método de FISH com sonda ribossômica 18S. O padrão de bandamento C mostrou que cada espécie parental apresenta um par de cromossomos com blocos heterocromáticos exclusivos e diferenciados, os quais foram considerados bons marcadores específicos e, desta forma possibilitaram a identificação do híbrido. A aplicação da técnica de FISH com sonda sexo-específica demonstrou marcações consideradas como diagnósticas pelos padrões espécie e sexo-específicos, diferenciando as espécies parentais e consequentemente, o híbrido “Piaupara”. Analisando citogeneticamente o fenômeno da dominância nucleolar com a coloração por Prata, verificaram-se diferenças de
com sonda 18S demonstrou que o DNA ribossômico não foi perdido no híbrido e assim, que os sítios ribossômicos provenientes de L. macrocephalus realmente estavam inativados. Um fato interessante em relação à diferença entre a região nucleolar das espécies parentais foi a associação da NOR com blocos heterocromáticos em L. elongatus detectada pelos métodos de FISH e pela banda C, sendo considerado o principal fator citogenético para explicar o estabelecimento desse fenômeno. Em relação aos métodos moleculares, através de reações PCR Multiplex e PCR-RFLP, análises envolvendo o DNA mitocondrial 16S e o gene nuclear α -tropomiosina demonstraram diferentes perfis eletroforéticos entre L. macrocephalus e L.
elongatus. Porém, somente o gene nuclear possibilitou a clara distinção entre parentais e o
híbrido, pois este revelou um padrão heterozigótico com as bandas diagnósticas herdadas de ambas as espécies. Para o gene mitocondrial, o híbrido apresentou o mesmo padrão observado em L. macrocephalus, o que mascara sua identificação. Contudo, como o DNA mitocondrial em animais apresenta característica peculiar de herança materna, as análises confirmaram L. macrocephalus como parental materno. A simplicidade e rapidez destas técnicas poderão facilitar a implementação rotineira do monitoramento da produção de híbridos nas pisciculturas, e por fim, delinear planos de conservação biológica para um manejo adequado dos estoques naturais e cultivados de peixes.
ABSTRACT
Among the most applied classic methodologies of genetic manipulation in fish culture, the interspecific hybridization aims the increase of productivity and the formation of sterile lineages. However, fish interspecific hybrids can represent serious biological risks to the environment, "genetically contaminating” natural or cultivated fish supplies and competing in various ways with the parental species. Therefore, it becomes a great importance the characterization and genetic monitoring of hybrids produced in fish farm, identifying in clear and accessible way parental and hybrid species. In the present study, a hybrid lineage of "Piaupara" was characterized through cytogenetic and molecular techniques in order to differentiate it from its respective parental, female Leporinus macrocephalus (Piauçu) and male Leporinus elongatus (Piapara). Through the cytogenetic methodologies, it was observed that both Leporinus
macrocephalus and L. elongatus parental as the hybrid "Piaupara" present a diploid number of
54 chromosomes of meta and submetacentric types, morphologically very similar and indistinguishable in the analysis with Giemsa, not being possible to differentiate them. In the nucleolus organizer region (NOR) staining, the parental species demonstrated only one chromosomal pair bearing NOR, however, of different sizes and/or forms, what allowed to differentiate the hybrid "Piaupara" both by the Silver nitrate technique and the FISH method with 18S ribosomal probe. C-Band standard showed that each parental species presents a pair of chromosomes with exclusive and differentiated heterochromatic blocks, which have been considered good markers to differentiate them and thus allowing the identification of the hybrid possible. The application of FISH method with sex-specific probe demonstrated markers considered as diagnosis for the sex-specific standards species, differentiating the parental species and consequently, the hybrid "Piaupara". Analyzing cytogenetically the nucleolar dominance phenomenon with the Silver coloration, differences in the nucleolar activity were verified in the hybrid "Piaupara", where the NOR of the chromosome inherited of L. elongatus was dominant in relation to the one of L. macrocephalus. The application of the FISH technique
ribosomal sites proceeding from L. macrocephalus really were inactive. An interesting fact relating to the differences between the parental species nucleolar regions, was the association of the NOR with heterochromatic blocks in L. elongatus detected by the FISH and C-band methods, being considered the main cytogenetic factor to explain how this phenomenon is defined. In relation to the molecular methods, through reactions PCR Multiplex and PCR-RFLP, analysis involving the mitochondrial DNA 16S and nuclear gene -tropomyosin demonstrated different electrophoretic profiles between L. macrocephalus and L. elongatus. However, only the nuclear gene allowed the clear distinction between parental and the hybrid, therefore this disclosed a heterozigose standard with the diagnostic bands inherited of both species. As regards the mitochondrial gene, the hybrid presented the same standards observed in L.
macrocephalus, which masks its identification, however, as the mitochondrial DNA in animals
presents peculiar characteristics of maternal inheritance, the analysis confirmed that L.
macrocephalus is the maternal parental. The simplicity and rapidity of these techniques will be
able to facilitate the routine monitoring implementation of the hybrids production in fish culture, and finally, delineate plans of biological conservation for an adequate handling of the natural and cultivated fish supplies.
SUMÁRIO
Pg. 1 INTRODUÇÃO __________________________________________ 1
1.1 Programas de hibridação interespecífica ___________________ 4
Aspectos gerais _________________________________________ 4
Riscos causados pela hibridação interespecífica ___________________ 8 1.2 Considerações sobre as espécies parentais e seus híbridos ___ 10
1.3 Métodos na detecção de hibridação ______________________ 12
1.3.2 Estudos citogenéticos na identificação de híbridos ____________ 14
Aspectos gerais ________________________________________ 14
Estudos citogenéticos no gênero Leporinus ______________________ 15
Cromossomos sexuais no gênero Leporinus ______________________ 18
Fenômeno de dominância nucleolar em híbridos interespecíficos ________ 20 1.3.1 Estudos moleculares na identificação de híbridos _____________ 24 O valor do DNA mitocondrial e nuclear na identificação de híbridos _______ 28
1.4 Objetivos ___________________________________________ 30
2 MATERIAIS E MÉTODOS _________________________________ 32
2.1 Materiais ____________________________________________ 33
2.2 Métodos ____________________________________________ 38 Métodos para as análises citogenéticas ___________________ 38 2.2.1 Estimulação de mitoses _______________________________ 38 2.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos de peixes ______________ 39 2.2.3 Detecção das regiões organizadoras de nucléolos (NORs) _______ 40 2.2.4 Caracterização da heterocromatina constitutiva ______________ 41 2.2.5 Hibridização fluorescente in situ (FISH) com sondas específicas de
DNA _______________________________________________ 41 2.2.6 Estudos cariotípicos ________________________________ 46
Métodos de análises moleculares ________________________ 47 2.2.9 Extração e purificação de DNA _________________________ 48 2.2.10 Amplificação do gene mitocondrial 16S e nuclear -tropomiosina ___ 50 2.2.11 Purificação dos produtos amplificados por PCR _____________ 51 2.2.12 Reação de amplificação para o sequenciamento _____________ 52 2.2.13 Limpeza dos fragmentos marcados _____________________ 52 2.2.14 Análises de PCR Multiplex ____________________________ 53 2.2.15 Análises de PCR-RFLP ______________________________ 54 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO _____________________________ 56 3.1 Capítulo 1 ___________________________________________________ 58 3.2 Capítulo 2 ___________________________________________________ 78 3.3 Capítulo 3 ___________________________________________________ 92 3.4 Capítulo 4 ___________________________________________________ 107 4 DISCUSSÃO GERAL ____________________________________ 128 5 CONCLUSÕES _________________________________________ 133 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS _________________________ 137
1. INTRODUÇÃO
O termo “Aqüicultura” designa todas as formas de cultivo de organismos aquáticos, animais e vegetais, tanto em águas continentais como em ambientes marinhos. A piscicultura é o ramo da aqüicultura que trata exclusivamente de programas de cultivo e manejo de peixes (Pillay e Kutty, 2005). Dentro da aqüicultura, em produção mundial, a atividade de piscicultura corresponde à maior fração, principalmente quando se trata da piscicultura continental. Em 1998, por exemplo, a piscicultura alcançou o percentual de 98% dos cultivos mundiais, correspondendo, naquele mesmo ano, cerca de 17 milhões de toneladas de peixes de água doce produzidas (FAO, 2000). Já em 2004, este valor ultrapassou os 23,8 milhões de toneladas, com uma taxa da média anual de crescimento de 5,2% entre o período de 2000-2004 (FAO, 2007).
A aqüicultura no Brasil tem se desenvolvida muito modestamente quando comparada com outros países do mundo e frente às expressivas potencialidades de recursos do país. Em 2004, por exemplo, a aqüicultura continental brasileira produziu 179.737,5 toneladas de peixes e 993 toneladas de outros animais aquáticos (crustáceos, moluscos e anfíbios) (IBAMA, 2005). Os grandes problemas da aqüicultura brasileira são a falta de organização do sistema de transferência de tecnologia, a carência de pesquisa aplicada, do ordenamento e desenvolvimento, bem como a distribuição dos produtos pesqueiros (Castagnolli, 1995).
No entanto, a piscicultura vem assumindo um importante papel na economia nacional, como uma alternativa de diversificação de negócios agropecuários, otimizando recursos disponíveis e resíduos não aproveitados em propriedades rurais. Estudos que analisam os fatores econômicos evidenciam uma tendência
das criações de peixes, principalmente no estado de São Paulo (Scorvo-Filho et al., 1998). A médio prazo a aqüicultura será o setor do país que mais oferecerá possibilidades de aumento da produção de pescado, sendo necessários estudos que possibilitem a formulação de um programa de desenvolvimento para esta área, levando-se em conta as diferentes regiões brasileiras (Camargo e Pouey, 2005).
A partir dos anos 80, abordagens genéticas passaram a contribuir de maneira efetiva nos programas de criação de peixes (Foresti, 2000; Hulata, 2001). Com o emprego de técnicas clássicas e modernas, tornou-se possível a manipulação cromossômica e a obtenção de linhagens que apresentem vantagens para a comercialização (Toledo-Filho et al., 1996; Porto-Foresti e Foresti, 2004). Os principais estudos genéticos aplicados nas pisciculturas mundiais e em particular, nas brasileiras, foram revisados na década de 90 numa série de publicações denominada “Cadernos de Ictiogenética” (Toledo-Filho et al., 1992, 1994, 1996, 1998 e 1999). Segundo os autores, a genética aplicada à piscicultura abrange quatro principais áreas que estão intimamente interligadas:
Manipulação genética, a qual envolve metodologias clássicas (seleção, hibridação e endogamia) e modernas (biotecnologia e engenharia genética) destinadas ao aumento da produtividade e à obtenção de linhagens estéreis, monosexuais e hormonalmente revertidas;
Manejo genético, que consiste na aplicação de procedimentos destinados a atenuar possíveis efeitos biológicos danosos provocados pelas linhagens geneticamente manipuladas;
Monitoramento genético, cuja finalidade de detectar através de marcadores genéticos os níveis de consangüinidade, heterozigose, hibridação e introgressão em estoques de peixes;
Conservação genética, que compreendem objetivos de detecção e manutenção de bancos genéticos de espécies nativas e a avaliação continuada dos potenciais riscos biológicos de estoques de peixes geneticamente manipulados.
Atualmente, a maioria das linhagens de peixes geneticamente melhoradas que alcançam a indústria da aqüicultura foram desenvolvidas através de métodos tradicionais de manipulação genética, que incluem seleção, hibridação e endogamia (Hulata, 2001). Entre estas clássicas metodologias de cruzamentos, a hibridação interespecífica constitui um dos métodos mais utilizados tradicionalmente nas pisciculturas mundiais e brasileiras, cujos resultados, no entanto, são de interpretação difícil e detalhada (Toledo-Filho et al., 1994).
1.1 Programas de Hibridação Interespecífica
Aspectos gerais
O processo da hibridação consiste no acasalamento de indivíduos ou grupos geneticamente diferentes e pode envolver cruzamentos dentro de uma espécie (cruzamento de linhagens) ou cruzamentos entre espécies separadas (hibridação interespecífica). Esta técnica de reprodução é muito usada para produzir organismos aquáticos com características desejáveis específicas ou melhoramento geral de seus desempenhos na aqüicultura. Geralmente, resulta na produção de prole que apresenta um desempenho melhor do que a média de ambas as espécies parentais (vigor híbrido ou heterose positiva) (Bartley et al., 2001).
Segundo Chevassus (1983), os estudos de hibridação em peixes iniciaram-se ao final do século dezenove e tiveram impulso a partir de 1919 na América do Norte, com Carl Leavitt Hubbs e seus colaboradores que, ao estudarem peixes de água
freqüentes na natureza. Em estudos realizados com híbridos de espécies do gênero Lepomis, Hubbs (1955) começou a compreender melhor fatos básicos do processo de hibridação interespecífica e as vantagens apresentadas por este processo. Os exemplares híbridos das espécies estudadas geralmente apresentavam características taxonômicas intermediárias entre as espécies parentais, podendo até mesmo superá-las em certos aspectos, tais como crescimento rápido, maior brilho e intensidade de coloração, domínio no ambiente, e até maior capacidade de capturar o alimento. Em resumo, tais híbridos apresentaram “vigor híbrido” ou “heterose”.
Verifica-se atualmente que entre os peixes, a hibridação é um fenômeno bastante comum (Schwartz, 1981; Bartley et al., 2001; Scribner et al., 2001; Allendorf et al., 2001), se comparado ao que ocorre nos diversos grupos de vertebrados (Campton, 1987; Allendorf e Waples, 1996). Isto ocorre pela própria condição ecofisiológica do grupo, que apresenta características peculiares, entre elas a fertilização externa, mecanismos de isolamento, competição por territórios de desova, abundância de espécies e sobrevivência em ambientes limitados (Hubbs, 1955; Campton, 1987). Além do mais, metade da ocorrência de eventos de hibridação em peixes tem sido atribuída a intervenção humana, como observado por Scribner et al. (2001), com as atividades de aqüicultura sendo o principal fator, seguidas de introduções de espécies fora do seu local de origem e alterações ou perda de habitats.
Recentemente, Bartley et al. (2001) revisaram uma ampla aplicação da produção artificial de híbridos interespecíficos em aqüiculturas. Nesta revisão, de uma perspectiva comercial, foi observado que vários híbridos são favorecidos em situações em que a produção pode ser aumentada e direcionada para algumas características físicas ou fisiológicas desejáveis. Em muitos casos, híbridos mostram uma relativa propensão para características de desempenho economicamente
viáveis, fornecendo métodos não-biotécnológicos para a transferência potencial de características desejáveis, além da possibilidade de combinar múltiplas características num simples produto.
O uso de programas de hibridação em piscicultura tem sido utilizado em inúmeras espécies de peixes a fim de produzir animais estéreis e que possuam melhor desempenho que as espécies parentais (vigor híbrido), como o aumento da taxa de crescimento, melhor qualidade da carne, resistência a doenças e capacidade de tolerar variações ambientais, além do aperfeiçoamento de diversas outras características a fim produzir peixes mais proveitosos para o cultivo (Bartley et al., 2001). Segundo Toledo-Filho et al. (1998), o uso de programas de hibridação em piscicultura tem sido aplicado para diversos fins, tanto em programas de melhoramento genético de fenótipos com baixa herdabilidade e produção de híbridos com heterose, como na produção de linhagens estéreis, monossexuais, poliplóides, andro e ginogenéticas.
No Brasil, o uso da metodologia de hibridação artificial em peixes teve início cerca de 30 anos atrás envolvendo tilápias e foi realizada pelo Departamento de Obras Contra a Seca (DNOCS), no Nordeste (Toledo-Filho et al., 1998). Subseqüentemente, utilizando a mesma tecnologia, o Centro de Pesquisa e Gestão de Recursos Pesqueiros Continentais (CEPTA - Pirassununga, SP) produziu, em 1985, o “Tambacu”, híbrido interespecífico entre fêmea de Tambaqui (Colossoma macropomum) e macho de Pacu (Piaractus mesopotamicus) (Bernardino et al., 1986). Atualmente, a produção de híbridos de peixes envolvendo várias espécies Neotropicais se tornou uma prática comum no Brasil, resultando em produtos viáveis e, algumas vezes, de grande interesse para os produtores (Senhorini, comunicação pessoal).
Tabela 1 – Linhagens de híbridos interespecíficos entre espécies Neotropicais possíveis
de serem produzidas artificialmente nas pisciculturas brasileiras.
Riscos causados pela hibridação interespecífica
Segundo Toledo-Filho et al. (1994), existem sérios problemas práticos a serem solucionados em programas de hibridação artificial, que estão relacionados aos produtos genéticos resultantes de uma hibridação bem sucedida, às metodologias genéticas mais apropriadas para a identificação dos produtos da hibridação, à avaliação da fertilidade ou esterilidade dos híbridos e aos potenciais
GERAÇÃO PARENTAL
Parental Fêmea Parental Macho Produto Híbrido
Tambaqui
Colossoma macropomum Piaractus mesopotamicus Pacu “Tambacu”
Pacu
Piaractus mesopotamicus Colossoma macropomum Tambaqui “Paqui” Tambaqui
Colossoma macropomum Piaractus brachypomus Pirapitinga “Tambatinga” Pirapitinga
Piaractus brachypomus Colossoma macropomum Tambaqui “Pirambaqui” Pacu
Piaractus mesopotamicus Piaractus brachypomus Pirapitinga “Patinga” ou “papi” Pirapitinga
Piaractus brachypomus Piaractus mesopotamicus Pacu “Pirapicu” Piauçu
Leporinus macrocephalus Leporinus elongatus Piapara “Piaupara” Piapara
Leporinus elongatus Leporinus macrocephalus Piauçu “Piapaçu” Pintado
Pseudoplatystoma corruscans Pseudoplatystoma fasciatum Cachara “Pintachara” Cachara
Pseudoplatystoma fasciatum Pseudoplatystoma corruscans Pintado “Cachapinta” Pintado
Pseudoplatystoma corruscans Hemiosorubim platyrhynchos Jurupoca “Pintajuru” Pintado
Pseudoplatystoma corruscans Phractocephalus hemioliopterus Pirarara “Pintapira” Cachara
Pseudoplatystoma fasciatum Phractocephalus hemioliopterus Pirarara “Cachapira” Pintado
Pseudoplatystoma corruscans Leiarius marmoratus Jandiá “Pintadiá” Jandiá
Leiarius marmoratus Pseudoplatystoma corruscans Pintado “Janditado” Matrinchã
Brycon sp. Brycon orbignyanus Piracanjuba “Matrinjuba” Piracanjuba
riscos biológicos destes para a integridade genética das espécies parentais cultivadas e selvagens.
Em estoques cultivados, a grande semelhança morfológica dos híbridos com os seus parentais podem causar misturas ocasionais e resultar na formação de plantéis de reprodutores contendo indivíduos portadores de esterilidade zigótica ou gamética. Segundo Ferguson e Thorpe (1991), em pisciculturas da Hungria e da ex-Tchecoslováquia, a presença de híbridos nos estoques parentais de carpas cabeça-grande e prateada, detectados numa proporção de cerca de 2 a 8%, foi considerada a causa dos problemas de “contaminação genética” nestes estoques. Já em relação aos estoques selvagens, os impactos genéticos dos híbridos tornam-se bem mais difíceis de serem previstos, uma vez que variam de intensidade conforme os indivíduos apresentem fertilidade total, parcial ou nula, ou ainda, se são provenientes de parentais nativos ou exóticos (Ferguson e Thorpe, 1991).
Os híbridos parcialmente férteis ou os que apresentam fertilidade total são os que oferecem maiores riscos às populações selvagens, pois podem realizar introgressões provocando “contaminação genética”, e desta forma, até causar a extinção de um dos parentais (Allendorf e Leary, 1988; Rhymer e Simberloff, 1996; Epifanio e Philipp, 2001; Rosenfield et al., 2004; Konishi e Tanaka, 2004). Os efeitos nocivos da hibridação, principalmente devido à introgressão, têm causado a extinção de muitas populações e espécies de plantas e animais (Rhymer e Simberloff, 1996; Allendorf et al., 2001). Segundo Ryman e Utter (1987), os cruzamentos artificiais entre os esturjões “sterlet” e “beluga” (importante fonte produtora de caviar) provocaram uma alta incidência de híbridos, os quais foram soltos na natureza e consequentemente, deixaram as espécies parentais em risco de extinção.
estoques naturais em casos de escapes da aqüicultura. Entretanto, apesar de híbridos estéreis serem fisiologicamente incapazes de retrocruzar com os parentais, podem competir por espaço e alimento com os peixes selvagens. Ao mesmo tempo, híbridos com esterilidade zigótica apresentam desenvolvimento gonadal parcial e características sexuais secundárias, de forma que podem ocorrer cruzamentos mal sucedidos com as espécies parentais, não redundando em descendência viável, o que a longo prazo, pode interferir negativamente na dinâmica reprodutiva das espécies parentais (Toledo-Filho et al., 1994).
No Brasil, apesar da constatação de que a produção de híbridos interespecíficos atualmente já se tornou uma prática comum nas pisciculturas, poucos são os estudos sobre as vantagens da produção de híbridos entre as espécies Neotropicais e à avaliação dos reais impactos genético-ecológicos que esses animais apresentam para as populações selvagens e cultivadas. Na literatura, estudos neste sentido estão disponíveis em sua maioria para híbridos entre as espécies Piaractus mesopotamicus X Colossoma macropomum e Pseudoplatystoma corruscans X Pseudoplatystoma fasciatum, demonstrando que estes animais são vantajosos e já comercializados em aqüicultura (Ribeiro et al., 1995; Coelho e Cyrino, 2006; Faustino et al., 2007; Godinho, 2007). No entanto, também já se verificou que estes podem apresentar fertilidade e retrocruzar com as espécies parentais (Almeida-Toledo et al., 1996; Senhorini, comunicação pessoal), o que revela o perigo e eminente possibilidade de atuação destes animais no meio ambiente e nas comunidades selvagens.
Esta preocupação ainda aumenta quando se leva em consideração os escapes de indivíduos híbridos que ocorrem em pisciculturas, que pode ser considerado um dos principais meios de dispersão de espécies exóticas em novos ambientes (Welcomme, 1988; Agostinho e Julio, 1996; Orsi e Agostinho, 1999). Uma
recente forma de comercialização e lazer que rapidamente se difundiu no Brasil, denominado “pesque-pague”, também representa importantes riscos adicionais, uma vez que os escapes são considerados inevitáveis, principalmente devido ao despreparo dos proprietários em relação à conservação ambiental (Fernandes et al., 2003). Os escapes com a água efluente, o esvaziamento dos tanques durante o manejo e, principalmente, o rompimento ou transbordamento desses em razão de picos de cheias não previstos durante a construção, são as principais vias de introdução de espécies exóticas pelas atividades de cultivo (Orsi e Agostinho, 1999).
1.2 Considerações sobre as espécies parentais e seus híbridos
A família Anostomidae, relacionada dentro da ordem dos peixes Characiformes, compreende um grupo de 12 gêneros e apresenta uma ampla distribuição na América do Sul e Central, com representantes em todas as bacias hidrográficas brasileiras (Géry, 1977; Garavello e Britski, 2003). Leporinus (87 espécies) e Schizodon (14 espécies) são os gêneros mais representativos dessa família (Garavello e Britski, 2003). Dos gêneros citados, o grupo dos Leporinus destaca-se pela presença de algumas espécies com grande valor econômico, tais como o Piauçu, Leporinus macrocephalus; a Piapara, L. elongatus; o Piau, L. friderici e a Piava, L. obtusidens (Castagnolli, 1992).
Segundo Reynalte-Tataje e Zaniboni-Filho (2005), espécies do gênero Leporinus, em especial L. macrocephalus e L. elongatus, apresentam características zootécnicas bastante interessantes e promissoras para o cultivo em programas de piscicultura, entre elas a facilidade de reprodução em cativeiro, idade e tamanho na maturidade sexual após o 1º ano de vida, tolerância ao manejo e fácil aceitação de
Em geral, espécies de Leporinus como o Piauçu e a Piapara, possuem grande aceitação no mercado, pois são muito apreciadas por colecionadores de peixes ornamentais devido à beleza dos juvenis, e ainda pelos pescadores comerciais e esportivos por apresentarem excelente qualidade de carne e comportamento agressivo quando os adultos são capturados em anzol (Reynalte-Tataje e Zaniboni-Filho, 2005). Tais características as tornam muito procuradas pelos criadores que fornecem peixes aos empreendimentos de “pesque-pague”.
Em termos de hibridação interespecífica, os cruzamentos entre estas espécies podem gerar diferentes híbridos como a “Piaupara”, resultante do cruzamento da fêmea de L. macrocephalus e macho de L. elongatus, e o “Piapapi”, do cruzamento entre fêmea de L. elongatus com o macho de L. macrocephalus. Para estes híbridos ainda não há estudos descritos na literatura informando sobre suas possíveis vantagens e/ou desvantagens em relação aos parentais. Porém, o fato de que estão sendo produzidos rotineiramente nas pisciculturas e os potenciais riscos que podem representar ao meio ambiente, demonstram a necessidade da aquisição de informações e estabelecimento de estratégias para caracterização e monitoramento genético envolvendo estes híbridos.
1.3 Métodos na detecção de hibridação
Tendo em vista os eminentes riscos biológicos que os híbridos representam para as populações selvagens e cultivadas, podendo “contaminar geneticamente” os estoques ou ainda competir de diversas formas com as linhagens parentais, é de grande importância que os resultados obtidos pela hibridação interespecífica sejam devidamente analisados sob os pontos de vista zootécnicos e também genéticos (Toledo-Filho et al., 1994). Segundo estes autores, com o conhecimento do perfil
genético desses animais através programas efetivos de caracterização e monitoramento genético, em associação ao uso de práticas corretas de manejo, os possíveis problemas decorrentes do uso de animais geneticamente manipulados em programas de cultivo poderiam ser minimizados e até evitados.
A caracterização e a identificação genética de estoques que sofreram manipulação genética são procedimentos bastante recomendáveis para as estações de piscicultura que utilizam técnicas de melhoramento animal (Toledo-Filho et al., 1994; Ocalewicz et al., 2006; Porto-Foresti et al., 2006). O monitoramento genético de produtos resultantes de processos de hibridação interespecífica consiste no uso de metodologias que possibilitam encontrar características diagnósticas que identifiquem, de maneira clara e acessível, parentais e híbridos (Toledo-Filho et al., 1994; Ocalewicz et al., 2006).
Para a identificação dos produtos híbridos, existem diversas metodologias propostas na literatura. Segundo Scribner et al. (2001), numa revisão sobre os métodos empregados para identificar eventos de hibridação em peixes, relatou que a maioria dos trabalhos na identificação de híbridos empregam os métodos morfológicos (45%), seguidos de alozimas (35%), DNA mitocondrial (12%), DNA nuclear (4%) e cariótipos (2%). De acordo com estes dados, foram observados que os estudos de hibridização frequentemente têm se baseado em critérios morfológicos ou merísticos. Contudo, considera-se que os resultados obtidos com esta metodologia podem ser duvidosos e ofuscados quando utilizados como a única fonte de análise (Neff e Smith, 1978), particularmente para indivíduos híbridos além da geração F1.
Sabe-se que através de exames visuais da morfologia externa e mesmo de características morfométricas e merísticas, nem sempre é fácil uma identificação
que se mostram intermediárias nos híbridos, são de uso limitado porque geralmente apresentam herança poligênica e sua distribuição pode superar à dos parentais (Campton, 1987; Toledo-Filho et al., 1994). De acordo com Toledo-Filho et al. (1994), quando se utilizam somente métodos morfológicos na identificação de híbridos de peixes, pode ocorrer uma subestimativa da freqüência dos híbridos, como no caso de híbridos entre as espécies Piaractus mesopotamicus X Colossoma macropomum, especialmente quando são analisados exemplares jovens.
Os interesses na identificação genética de híbridos interespecíficos aliado aos recentes avanços na tecnologia molecular têm disponibilizado uma gama considerável de marcadores genéticos, o que possibilita a correta identificação de híbridos, além de permitir análises fundamentais em busca de dados sobre os eventos de hibridação e introgressão (Scribner et al., 2001).
1.3.1 Estudos citogenéticos na identificação de híbridos
Aspectos gerais
Efetivamente, de acordo com uma revisão realizada por Oliveira et al. (2006a), os primeiros trabalhos publicados sobre citogenética de peixes Neotropicais foram realizados na década de 70 e atualmente, vários outros têm sido desenvolvido com uma ampla abrangência dos grupos de peixes, resultando em uma considerável quantidade de conhecimentos disponíveis.
Segundo Porto-Foresti et al. (2006), até recentemente, os exames cariotípicos nos peixes eram considerados principalmente como uma ferramenta para estudos básicos e evolutivos, não sendo utilizados no manejo e monitoramento de estoques. Quando análises convencionais não são suficientes para caracterizar precisamente os indivíduos, a identificação pode ser baseada em marcadores cromossômicos
estruturais. Entre os marcadores cromossômicos mais utilizados em peixes têm-se a detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo (NORs) através do nitrato de Prata, a caracterização da heterocromatina constitutiva pela técnica de banda C, a incorporação da 5-bromodioxiuridina (5-Brdu), a coloração por fluorocromos base-específicos e a localização de seqüências específicas com o uso da hibridação fluorescente in situ (FISH) (Ocalewicz et al., 2006; Porto-Foresti et al., 2006).
Os métodos citogenéticos, além de serem considerados de baixo custo, constituem uma maneira bastante precisa de se verificar tanto os níveis de ploidia como a procedência dos complementos cromossômicos dos parentais nos produtos resultantes de hibridação interespecífica em peixes (Toledo-Filho et al., 1994; Ocalewicz et al., 2006). Segundo Almeida-Toledo et al. (1987), pacus e tambaquis diplóides e seus híbridos recíprocos apresentaram um cariótipo idêntico em número e morfologia. Além disso, um híbrido triplóide proveniente destes mesmos cruzamentos também foi encontrado, o qual apresentava um cariótipo com 81 cromossomos (3n).
Em alguns estudos citogenéticos de produtos resultantes da hibridação interespecífica, as espécies parentais e seus híbridos podem apresentar diferentes composições cariotípicas relacionadas a diferenças no número diplóide, fórmula cariotípica e/ou número fundamental, de tal maneira que, híbridos podem ser caracterizados pela simples diferença de morfologia de alguns cromossomos entre as espécies parentais (Kossowski et al., 1983; Manosroi et al., 2003; Park et al., 2003).
Nos casos em que híbridos e parentais apresentam o mesmo cariótipo (iguais em número e morfologia), torna-se necessário o emprego de técnicas de colorações diferenciadas e bandamentos cromossômicos na tentativa de encontrar um
permitiram a perfeita identificação dos parentais e dos híbridos obtidos dos cruzamentos entre Pacu (Piaractus mesopotamicus) e Tambaqui (Colossoma macropomum) (Almeida-Toledo et al., 1987). Outros estudos similares com a identificação de híbridos por bandamentos cromossômicos também podem foram realizados, tais como os híbridos entre espécies de carpas (Almeida-Toledo et al., 1995) e entre espécies de “catfish” (Zhang e Tiersch, 1997).
Estudos citogenéticos no gênero Leporinus
Estudos citogenéticos no gênero Leporinus iniciaram-se a cerca de 30 anos com os trabalhos de Galetti et al. (1981a, b), sendo que atualmente pode-se encontrar uma soma significativa de trabalhos contribuindo para um melhor entendimento da estrutura cromossômica deste grupo. Além disso, estes estudos envolvem uma ampla variedade de polimorfismos, que incluem desde a ocorrência de cromossomo B (Venere et al., 1999), polimorfismos de DNA ribossômicos (Galetti et al., 1995b; Martins e Galetti, 1999), padrão de heterocromatina (Galetti et al., 1991a, b; Koehler et al., 1997; Margarido e Galetti, 2000), evento de poliploidia (Molina et al., 2007), até um claro sistema de determinação sexual ZZ:ZW (Galetti et al., 1981a; Galetti e Foresti, 1986 e 1987; Galetti et al., 1995a; Molina et al., 1998).
Leporinus compartilha um cariótipo muito similar com outros gêneros da família Anostomidae. Estudos cariotípicos realizados em representantes destes gêneros evidenciaram um cariótipo básico composto por 54 cromossomos, dos tipos meta e submetacêntrico (Galetti et al., 1981b; Galetti et al., 1991a). Embora estas características demonstrem uma presença constante e com uma conservada estabilidade cariotípica, eventos interessantes de rearranjos cromossômicos parecem ter ocorrido (Galetti et al., 1984; Galetti et al., 1991a).
Análises citogenéticas básicas realizadas em três gêneros da família Anostomidae (Leporinus, Leporellus e Schizodon) demonstraram que, a princípio, estes possuem grande similaridade cariotípica (Galetti et al., 1981b). A posterior utilização de diferentes metodologias, como a impregnação pelo nitrato de Prata, foi satisfatoriamente resolutiva na caracterização de algumas espécies do grupo. Apesar de existir uma tendência a um par de cromossomos portadores de NORs, essas se encontraram em diferentes cromossomos ou em distintas posições nos cromossomos de algumas espécies de Leporinus e também em gêneros da família Anostomidae (Galetti et al., 1984; Galetti et al., 1991a, b; Koehler et al., 1997; Margarido e Galetti, 2000). Além disso, apesar desta tendência, é importante destacar casos isolados de NORs múltiplas com uma alta variabilidade inter e intra -individual em duas espécies de Leporinus (Galetti et al., 1991a; Galetti et al., 1995a e b). Provavelmente, estas diferenças poderiam estar relacionadas com eventos de translocações e/ou inversões, bem como transposições, representando marcadores citogenéticos para estas espécies (Galetti et al., 1984; Galetti et al., 1991a; Galetti et al., 1995a; Koehler et al., 1997).
Outra característica interessante que evidencia alterações na microestrutura cariotípica em espécies deste grupo é o padrão da heterocromatina constitutiva (Galetti et al., 1991a, b). Estudos em espécies de Leporinus e em gêneros da família Anostomidae demonstraram diferenças quantitativas e qualitativas nos padrões de bandamento C e de fluorocromos base-específicos, o que revelou que a heterocromatina tem representado um papel importante na evolução cromossômica dos Anostomídeos (Galetti et al., 1991a, b; Koehler et al., 1997; Margarido e Galetti, 2000). Desta forma, estes distintos padrões de heterocromatina possibilitaram que os autores sugerissem que rearranjos (inversões e/ou transposições) ou
pequenas alterações nas suas estruturas cariotípicas. Além do mais, a associação da heterocromatina com as NORs nas espécies estudadas também poderia estar influenciando estas alterações cromossômicas (Galetti et al., 1991a, b; Koehler et al., 1997; Margarido e Galetti, 2000).
Considera-se, assim, que a localização da NOR e o padrão de heterocromatina observada em diferentes cromossomos ou posições diferentes no cromossomo, podem se constituir em potenciais marcadores para a identificação de híbridos interespecíficos envolvendo as espécies Leporinus macrocephalus e Leporinus elongatus.
Cromossomos sexuais no gênero Leporinus
Apesar da maioria das espécies de peixes não apresentarem cromossomos sexuais diferenciados, um interessante aspecto encontrado em peixes Neotropicais é a sua enorme diversidade referente aos mecanismos cromossômicos de determinação de sexo, que incluem desde fêmeas ou machos heterogaméticos, até sistemas simples (XX:XY e ZZ:ZW) ou múltiplos (X1X2Y, XY1Y2 e ZW1W2)
(Almeida-Toledo e Foresti, 2001). Além disso, dois novos sistemas de heteromorfismo cromossômico ligado ao sexo já foram relatados para as espécies Neotropicais, com a descrição do sistema XO para uma espécie do gênero Ancistrus (Alves et al., 2006) e Z1Z1Z2Z2:Z1W1Z2W2 para a espécie Leporinus elongatus (Parise-Maltempi et
al., 2007). Em uma recente revisão, Oliveira et al. (2006a) apontaram a presença de 40 espécies com heterogamia feminina, enquanto 22 espécies apresentavam heterogamia masculina.
Na maioria dos casos, a diferença entre os homólogos sexuais envolve blocos heterocromáticos e este fato é muito bem estabelecido em sistemas do tipo ZZ:ZW, em que perda ou ganho de heterocromatina são as principais causas de
diferenciação entre estes cromossomos sexuais (Haaf e Schmid, 1984; Galetti e Foresti, 1986; Feldberg et al., 1987; Moreira-Filho et al., 1993; Venere et al., 2004; Vicari et al., 2006). Já os sistemas múltiplos geralmente envolvem rearranjos cromossômicos Robertsonianos ou translocação em tandem, sendo que algumas vezes podem resultar em perda de heterocromatina (Almeida-Toledo et al., 1988; Bertollo et al., 1997; Almeida-Toledo et al., 2000).
No gênero Leporinus (Anostomidae), sete espécies apresentam o sistema simples de cromossomos sexuais do tipo ZZ/ZW (Galetti et al., 1981a; Galetti e Foresti, 1986 e 1987; Galetti et al., 1995a; Molina et al., 1998). Neste sistema, um cromossomo de tamanho grande do tipo subtelocêntrico e com o braço longo totalmente heterocromático é o típico cromossomo W, presente somente no cariótipo de fêmeas; em contraste, o cromossomo Z, presente em ambos os sexos, é um submetacêntrico e apenas heterocromático na porção final do braço longo (Galetti et al., 1981a; Galetti e Foresti, 1986 e 1987; Galetti et al., 1995a; Molina et al., 1998).
Galetti e Foresti (1986 e 1987) sugeriram que este mecanismo de diferenciação foi originado apenas uma vez durante a história evolutiva deste grupo, sendo compartilhado pelas espécies por meio de um ancestral comum. A diferenciação deste típico sistema cromossômico sexual ZW em Leporinus se deu por uma inicial heterocromatinização de um dos cromossomos do par por meio da incorporação e desenvolvimento de seqüências de DNA satélites específicas. Em seguida, um processo de acúmulo desta heterocromatina, possivelmente acompanhado de mudanças qualitativas, resultou na diferenciação do cromossomo W (Galetti e Foresti, 1986 e 1987; Galetti et al., 1995a).
Atualmente, após estudos com várias formas de bandamento, entre elas corantes fluorescentes base-específicos e a incorporação de 5-Brdu, foram
nível de diferenciação e heterogeneidade deste cromossomo e que modificações espécie-específicas tenham ocorrido neste grupo (Nakayama et al., 1994; Molina et al., 1998; Molina e Galetti, 2006).
Apesar deste peculiar padrão ZZ:ZW encontrado em sete espécies de Leporinus, dois novos relatos de cromossomos sexuais no gênero foram descritos recentemente, com um atípico e morfologicamente diferente ZZ:ZW em L. aff. brunneus (Venere et al., 2004) e um sistema múltiplo Z1Z1Z2Z2:Z1W1Z2W2 para a
espécie L. elongatus, que aparentemente apresentava o sistema ZZ:ZW padrão do gênero (Parise-Maltempi et al., 2007). Neste último, através do isolamento de um novo elemento repetitivo e seu uso como sonda sexo-específica pela técnica de FISH, somado com informações de Ag-NOR e bandamento C, foi inferido que L. elongatus apresenta preferencialmente um sistema múltiplo de cromossomos sexuais envolvendo os cromossomos portadores da NOR.
Esta última descrição representa novas perspectivas para verificar se este DNA repetitivo está distribuído diferentemente nos cromossomos sexuais de outras espécies de Leporinus, e desta forma, pode gerar marcadores sexo-específicos na identificação de híbridos envolvendo as espécies Leporinus macrocephalus e Leporinus elongatus.
Fenômeno de dominância nucleolar em híbridos interespecíficos
Nos animais podem ser encontradas duas classes distintas de genes que codificam RNA ribossômico (RNAr), a classe maior do DNA ribossomal (DNAr) 45S composta pelos genes 18S, 5.8S e 28S e a classe menor de DNAr 5S (Long e Dawid, 1980). As regiões organizadoras de nucléolo (NOR) são loci genéticos em eucarionte em que os genes que codificam o precursor dos três maiores RNAr estão agrupados em centenas ou milhares de cópias, coletivamente abrangendo milhões
de pares de bases ao longo do cromossomo (Ritossa e Spiegelman, 1965; Wallace e Birnstiel, 1966; Phillips et al., 1971). A transcrição dos genes do RNAr pela RNA polimerase I resulta na formação de um nucléolo (Karpen et al., 1988), a região nuclear onde ocorre a biogênese dos ribossomos.
Dominância nucleolar é considerada um fenômeno epigenético observado em células de híbridos interespecíficos em que a NOR proveniente de uma espécie parental é dominante em relação à outra, ou seja, enquanto a NOR de um parental é ativa a outra é silenciada. Este fenômeno foi descrito primeiramente em híbridos de plantas do gênero Crepis por Navashin em 1934 e atualmente muitos estudos estão sendo realizados no intuito de descobrir quais os mecanismos pelos quais a dominância se estabelece (Pikaard, 2000a, b; McStay, 2006).
De acordo com Pikaard (2000a), nos estudos de Navashin com híbridos interespecíficos de plantas do gênero Crepis, foi observado que constrições secundárias de um cromossomo eram herdadas de apenas uma das espécies parentais nos exemplares híbridos da F1. Quando isso ocorria, independente de qual
espécie da geração parental no cruzamento, a partir de um retrocruzamento apropriado era possível resgatar o nucléolo reprimido, demonstrando que a formação nucleolar do cromossomo não foi alterada ou perdida no híbrido. Esse fenômeno foi inicialmente denominado de “differential amphiplasty”. Também em 1934, McClintock fez uma importante descoberta mostrando que as constrições secundárias correspondiam intimamente aos sítios de formação do nucléolo. Após algumas décadas, o fenômeno descrito por Navashin foi finalmente interpretado como a manifestação citológica da falha na produção de um conjunto de genes RNAr de um dos parentais e passou a ser conhecido como dominância nucleolar (Honjo e Reeder, 1973).
Experimentos complementares sobre o nucléolo sugeriram posteriormente que a transcrição de apenas um conjunto de genes RNAr de um parental é a explicação molecular para a dominância nucleolar (Chen e Pikaard, 1997). Presumivelmente, a transcrição de genes RNAr durante a intérfase de alguma forma reduz sua condensação na metáfase, dessa maneira explicando o aparecimento das constrições secundárias, que constituem os sítios cromossômicos onde o nucléolo se forma durante a intérfase (Wallace e Langridge, 1971).
Este fenômeno tem sido bem caracterizado em numerosos híbridos interespecíficos de plantas (Martini et al., 1982; Flavell et al., 1988; Chen e Pikaard, 1997; Chen et al., 1998; Lewis e Pikaard, 2001), porém estudos em alguns animais também se mostraram importantes tais como em híbridos de Drosophila (Durica e Krider, 1978; Oliveira et al., 2006b; Commar et al., 2007) e sapos Xenopus (Honjo e Reeder, 1973; Reeder e Roan, 1984; Caudy e Pikaard, 2002), enquanto em peixes são encontrados poucos relatos na literatura (Ueda et al., 1988; Ueda e Kobayashi, 1990, Gold et al., 1991).
Como em outros fenômenos epigenéticos, modificações na cromatina forçam o silenciamento dos genes RNAr de um dos parentais na dominância nucleolar. No entanto, os mecanismos que discriminam qual conjunto RNAr parental é dominante ou silenciado ainda não estão claros (Pikaard, 2000a). Algumas possibilidades incluem diferenças em relação à afinidade espécie-específico com os fatores de transcrição dos genes RNAr, outras relacionadas a hipótese de “enhancer imbalance” (desequilíbrio de reforços), enquanto algumas sugerem que o contexto cromossômico é mais importante do que a seqüência do gene RNAr, implicando em mecanismos que afetam toda a NOR ou até mesmo grandes domínios cromossômicos (Pikaard, 2000a). Em geral, dominância nucleolar parece ser uma
conseqüência da divergência evolutiva dos genes RNAr e/ou dos mecanismos de regulação da transcrição (Wallace e Langridge, 1971; Reeder, 1985).
Entre as várias hipóteses sobre a dominância nucleolar, a hipótese de “enhancer imbalance” tem sido mais amplamente estudada. Esta situação foi descoberta pela primeira vez entre híbridos de sapos Xenopus laevis e X. borealis (Reeder, 1985) e se baseia no fato de que elementos repetitivos podem servir como enhancers, que são segmentos de DNA que influenciam os promotores para a transcrição dos genes ribossômicos (Reeder, 1985; Caudy e Pikaard, 2002).
Os enhancers compartilham de certa similaridade com o domínio do gene promotor de tal forma que favorece a idéia de que enhancer e promotor ligam um ou mais fatores essenciais de transcrição em comum. Indiferente do preciso mecanismo pelo qual agem, todas as evidências disponíveis sugerem que o gene promotor adjacente a numerosos enhancers tem uma forte vantagem sobre um promotor adjacente a poucos enhancers (Reeder e Roan, 1984). Os genes RNAr de X. laevis e X. borealis apresentam diferentes tipos e números de elementos repetitivos em seus espaçadores intergênicos. Isto sugere um modelo em que o maior número de enhancers de X. laevis poderia retirar um fator e seqüestrá-lo, de forma a impedir os genes RNAr de X. borealis de acessar os fatores (Reeder e Roan, 1984; Reeder, 1985). Experimentos em que minigenes de RNAr de X. laevis e X. borealis foram coinjetados dentro de oócitos mostraram que os minigenes de X. laevis foram preferencialmente transcritos, de acordo com a situação que ocorre nos híbridos, em que somente genes RNAr de X. laevis são ativos (Reeder e Roan, 1984).
Uma característica recorrente da dominância nucleolar, tanto em plantas como em animais, é que a NOR da mesma espécie é sempre silenciada, independente dos efeitos maternais ou paternais. Essa descoberta sugere que
reprimidos em um híbrido, possivelmente por causa de diferenças espécie-específicas nos sistemas de transcrição dos progenitores (Reeder, 1985; Pikaard, 2000a).
Até hoje, a escolha dos mecanismos pela qual NOR inteira ou subconjuntos de genes RNAr são silenciados ocasionando inativação, ainda permanecem uma questão intrigante (Preuss e Pikaard, 2007). Recentes estudos moleculares evidenciam que silenciamento gênico na dominância nucleolar é freqüentemente resultado de efeitos combinados do remodelamento da cromatina, metilação do DNA e modificações de histona específicas (Chen e Pikaard, 1997; Chen et al., 1998; Richards e Elgin, 2002; Grummt e Pikaard, 2003).
Desta maneira, como este é um fenômeno bem documentado em várias espécies de plantas e animais, porém pouco estudado em híbridos de peixes, os híbridos interespecíficos entre L. macrocephalus e L. elongatus podem ser considerados como um excelente material de estudo para adicionar dados a respeito deste mecanismo que ainda precisa ser esclarecido.
1.3.2 Estudos moleculares na identificação de híbridos
A partir do final da década de 1960, deu-se início ao uso de marcadores moleculares na detecção e descrição da diversidade biológica e os anos subseqüentes assistiram a uma revolução na biologia molecular. Passaram a ser desenvolvidos métodos mais acurados para a observação e o estudo da estrutura molecular de proteínas e de ácidos nucléicos, proporcionando grandes avanços no que diz respeito às metodologias de pesquisa, biotecnologia molecular e bioinformática (Moritz e Hillis, 1996).
O desenvolvimento dos marcadores genético-moleculares tem impactado a pesquisa em quase toda área biológica, incluindo a aqüicultura, onde tais
marcadores têm se tornado importantes ferramentas para fornecer informações a respeito da variabilidade genética e endogamia, relacionamentos de parentesco, identificação de híbridos e linhagens em programas de cultivo (García de Leon et al., 1998; Spidle et al., 2004; Vandeputte et al., 2004; Liu e Cordes, 2004). Atualmente, uma ampla variedade de marcadores tem sido desenvolvida para diferentes espécies utilizadas na aqüicultura mundial (Liu e Cordes, 2004). O interesse na caracterização e identificação de híbridos em pisciculturas e também estudos envolvendo hibridações naturais tem disponibilizado uma gama considerável de marcadores moleculares na literatura. Entre os mais utilizados estão marcadores do tipo RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) (Calcagnotto, 1998; Perez et al., 1999), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) (Elo et al., 1997; Liu et al., 1999), SPAR (Single Primer Amplification Reaction) (Fonteles et al., 2005) e AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) (Congiu et al., 2001; Young et al., 2001). Os procedimentos para obtenção de marcadores do tipo RAPD foram desenvolvidos primeiramente em 1990 (Welsh e McClelland, 1990; Williams et al., 1990) usando a PCR (Polymerase Chain Reaction) para amplificar aleatoriamente segmentos anônimos do DNA nuclear com um par idêntico de primers de 8-10 pb de comprimento. Como os primers são curtos e são usadas temperaturas relativamente baixas de anelamento (frequentemente 36-40ºC), a probabilidade de amplificar produtos múltiplos é grande, com cada produto possivelmente representando um locus diferente. No estudo de híbridos realizado por Elo et al. (1997), através desta metodologia estes autores conseguiram obter fragmentos que permitiram a separação dos parentais e híbridos entre espécies de salmonídeos. Liu et al. (1999), analisando híbridos de bagres e seus parentais também encontraram bandas de ambos os parentais nos híbridos, conseguindo diferenciá-los.
Já a metodologia de SPAR, da mesma forma que o RAPD, também se baseia na amplificação por PCR de fragmentos aleatórios do DNA. No entanto, consiste da utilização de regiões genômicas flanqueadas por microssatélites, de tal forma que para a reação de amplificação são usados primers únicos de seqüências repetitivas simples (Gupta et al., 1994). No Brasil, Fonteles (2002) utilizou-se desta técnica para identificação de híbridos artificiais entre espécies parentais do gênero Piaractus. Fonteles et al. (2005) também conseguiram estabelecer relações de parentesco entre diferentes espécies de carpas e seus híbridos interespecíficos.
A técnica RFLP baseia-se na produção de fragmentos moleculares através da digestão do DNA por enzimas de restrição, o que resulta em fragmentos cujos números e o tamanho podem variar entre indivíduos, populações e espécie. Tradicionalmente, fragmentos genômicos foram separados usando a análise de “Southern blot” (Southern, 1976), em que o DNA genômico é digerido, sujeitado a eletroforese através de um gel de agarose, transferido a uma membrana e visualizado pela hibridização por sondas específicas. Este método já foi utilizada na identificação de híbridos artificiais por Calcagnotto (1998) e Perez et al. (1999).
Primeiramente empregada por Vos et al. (1995), AFLP é uma técnica baseada na PCR que combina as forças e supera as fraquezas dos métodos de RFLP e RAPD. A característica exclusiva da técnica é a adição de adaptadores aos fragmentos de DNA gerados por digestão enzimática do DNA genômico total. Como os adaptadores têm seqüências conhecidas e são ligadas às extremidades dos fragmentos, estes podem ser usados como sítios de primers para a amplificação por PCR. O principal alvo da variação genética é o mesmo que RFLP, mas em vez de analisar um locus de cada vez, permite a análise de muitos loci simultaneamente. Como exemplo, Young et al. (2001) usaram a técnica de AFLP para gerar 133
marcadores polimórficos, das quais 23 foram diagnósticos na distinção de híbridos e suas espécies parentais de truta Oncorhynchus mykiss irideus e O. clarki clarki.
Mais recentemente, ainda em relação ao método de RFLP, a maioria das análises substitui o método “Southern blot” com as técnicas baseadas na reação de PCR (PCR-RFLP). Assim, após a amplificação de uma região conhecida, os produtos de PCR podem ser digeridos com enzimas de restrição e serem visualizados por simples eletroforese devido à grande quantidade de DNA produzida por esta técnica. A técnica PCR-RFLP apresenta uma considerável redução do tempo de execução, no custo e complexidade (Ferreira e Grattapaglia, 1998). Desta maneira, tem sido utilizada com sucesso na diferenciação e identificação forense de espécies de peixes (Cocolin et al., 2000; Wolf et al., 2000; Hold et al., 2001; Hsieh et al., 2005 e 2007), sendo bastante promissora para análises aplicadas à piscicultura, principalmente na identificação de híbridos e diferenciação das espécies parentais.
Outro método muito eficaz e rápido, porém não utilizado na caracterização de híbridos, é a técnica PCR Multiplex com “primers” espécie-específicos. Este método consiste em utilizar “primers” espécie-específicos para um determinado locus, o qual difere de uma a poucas substituições nucleotídicas para as espécies a serem analisadas, de tal forma que testes podem ser multiplexados, isto é, duas ou mais reações de PCR podem ser aplicadas simultaneamente no mesmo tubo (Henegariu et al., 1997; Markoulatos et al., 2002). Esta técnica tem se demonstrado importante na diferenciação e identificação de espécies, o que também a torna promissora para a identificação de híbridos. Atualmente suas finalidades variam desde o monitoramento da qualidade de água (Abd-El-Haleem et al., 2003), determinação sexual (Seddon, 2005) e aplicações em programas de conservação (Chapman et al., 2003; Magnussen et al., 2007; Apostolides et al., 2007) até o uso em identificação
O valor do DNA mitocondrial e nuclear na identificação de híbridos
Estudos moleculares têm usado o DNA mitocondrial (DNAmt) por serem muito menor que o DNA nuclear (aproximadamente 5 vezes menor); por existirem várias cópias do DNAmt dentro da célula (versus somente 1 ou 2 cópias de DNA nuclear); e finalmente pelo fato dos íntrons estarem ausentes (Sotelo et al., 1993). Conseqüentemente, o DNAmt é uma ferramenta útil para estudos filogenéticos e de evolução em animais, por seu modo de herança uniparental, taxa relativa rápida de substituição de base, falta de recombinação e fácil isolamento (Moritz et al., 1987; Saccone, 1994). Por isso, a maioria das análises filogenéticas e de identificação de espécies tem se baseado em regiões conservadas do genoma mitocondrial (DNAmt), em especial o DNA ribossomal 16S (Meyer, 1993; Orrell e Carpenter, 2004; Calcagnotto et al., 2005; Pardo et al., 2005; Gagnaire et al., 2007).
Em relação às regiões do genoma nuclear, os íntrons (seqüências não-traduzidas que medeiam seqüências codificadoras polipeptídicas no genoma nuclear) são fontes potencialmente ricas de marcadores espécie-específicos para estudos de hibridação. Enquanto isso, por serem não-funcionais, os íntrons acumulam mutações com uma taxa mais rápida do que as seqüências codificadoras nucleares e desta forma, têm sido usados com freqüência em diferenciação de espécies, estudos filogenéticos e populacionais (Palumbi e Baker, 1994; Friesen et al., 1999; Friesen, 2000; Calcagnotto et al., 2005; Avelino, 2007).
Segundo Toledo-Filho et al. (1994), os marcadores mitocondriais e nucleares têm fornecido valiosas informações na identificação de híbridos recíprocos e na detecção de eventos históricos de hibridação em peixes, nos quais, a médio e longo
prazos, os genes de uma das espécies são lentamente incorporados ao patrimônio genético de outras espécies por meio da introgressão. Como o DNA mitocondrial em animais apresenta característica peculiar de herança materna (Moritz et al., 1987), este tipo de marcador é extremamente útil para detectar a direção do evento de hibridização, uma vez que identifica os parentais maternos, no entanto, não tem a capacidade de ser utilizado para estimar taxas de introgressão e hibridação. Por outro lado, visto que híbridos e seus descendentes herdam DNA nuclear de ambas as espécies parentais, somente através dos marcadores nucleares eventos de hibridação e introgressão podem ser detectados, entretanto, é fundamental utilizar o DNAmt em conjunto com os marcadores genéticos nucleares, pois os resultados de ambos se complementam (Scribner e Avise, 1993 e 1994a, b; Rosenfield et al., 2000; Scribner et al., 2001).
1.4 Objetivos
Como a produção de híbridos interespecíficos é uma prática comum nas pisciculturas e considerando que os estudos genéticos em híbridos ainda são escassos e, em sua maioria, não estão relacionados a projetos de cultivo, este estudo teve como principais objetivos:
1. Diferenciar e identificar geneticamente espécies de peixes de interesse comercial,
que representam as linhagens parentais das espécies Leporinus macrocephalus (Piauçu) e Leporinus elongatus (Piapara), e seus respectivos híbridos interespecíficos (“Piaupara” e “Piapapi”), que atualmente são produzidas em pisciculturas do Brasil;
2. Analisar através de várias formas de bandamentos cromossômicos, quais
marcadores citogenéticos são diagnósticos e que permitam a precisa identificação de indivíduos parentais e híbridos;
3. Verificar e estabelecer marcadores moleculares diagnósticos, tanto mitocondriais
quanto nucleares, de forma a fornecer suporte para outros projetos de hibridação e principalmente, tornar o monitoramento genético de híbridos acessível e rotineiro;
4. Promover a ordenação de dados biológicos das espécies parentais e das
linhagens híbridas que representem informações importantes com relação à dinâmica do processo de hibridação, tanto para fins de pesquisa básica como para fins comerciais.
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Materiais
Tendo em vista o interesse de caracterizar geneticamente representantes das linhagens parentais das espécies Leporinus macrocephalus (Piauçu) (Figura 1a) e Leporinus elongatus (Piapara) (Figura 1b) e seus respectivos híbridos (Figura 1c), foram coletados exemplares do estoque de cultivo provenientes da piscicultura Kabeya (Penápolis, SP) (Figura 2). Os estoques parentais de L. elongatus e L. macrocephalus cultivados nesta piscicultura foram derivados de amostras de peixes coletados no pantanal Sul Mato-grossense.
Figura 1 - Exemplar de Piauçu (Leporinus macrocephalus) (a), de Piapara (Leporinus elongatus) (b) e
exemplares de seu respectivo híbrido interespecífico (“Piaupara”). b a
A piscicultura Kabeya (Figura 2), situada em Glicério, região de Penápolis, SP, possui completa infra-estrutura para comercialização de peixes. O interesse desta empresa estava inicialmente voltado à engorda de peixes, mas se deparou com um mercado escasso na produção de alevinos, surgindo a partir daí uma nova meta, relacionada à reprodução destes organismos. Na área comercial, atende a pisciculturas, pesque-pagues e associações de criadores. Por mais de dez anos dedica-se à criação e comercialização de alevinos ou exemplares juvenis de diversas espécies tropicais.
Os peixes coletados foram transportados para o laboratório a fim de processamento do material. Nas análises cromossômicas, para a obtenção de cromossomos mitóticos, foram extraídos fragmentos de tecido da porção anterior do rim dos exemplares, enquanto que para os estudos moleculares foram coletadas amostras de sangue, fígado ou nadadeira com o intuito de se proceder à extração e purificação do DNA. A seguir, os peixes foram numerados e registrados em caderno
