2.1 Materiais
Tendo em vista o interesse de caracterizar geneticamente representantes das linhagens parentais das espécies Leporinus macrocephalus (Piauçu) (Figura 1a) e Leporinus elongatus (Piapara) (Figura 1b) e seus respectivos híbridos (Figura 1c), foram coletados exemplares do estoque de cultivo provenientes da piscicultura Kabeya (Penápolis, SP) (Figura 2). Os estoques parentais de L. elongatus e L. macrocephalus cultivados nesta piscicultura foram derivados de amostras de peixes coletados no pantanal Sul Mato-grossense.
Figura 1 - Exemplar de Piauçu (Leporinus macrocephalus) (a), de Piapara (Leporinus elongatus) (b) e
exemplares de seu respectivo híbrido interespecífico (“Piaupara”). b a
A piscicultura Kabeya (Figura 2), situada em Glicério, região de Penápolis, SP, possui completa infra-estrutura para comercialização de peixes. O interesse desta empresa estava inicialmente voltado à engorda de peixes, mas se deparou com um mercado escasso na produção de alevinos, surgindo a partir daí uma nova meta, relacionada à reprodução destes organismos. Na área comercial, atende a pisciculturas, pesque-pagues e associações de criadores. Por mais de dez anos dedica-se à criação e comercialização de alevinos ou exemplares juvenis de diversas espécies tropicais.
Os peixes coletados foram transportados para o laboratório a fim de processamento do material. Nas análises cromossômicas, para a obtenção de cromossomos mitóticos, foram extraídos fragmentos de tecido da porção anterior do rim dos exemplares, enquanto que para os estudos moleculares foram coletadas amostras de sangue, fígado ou nadadeira com o intuito de se proceder à extração e purificação do DNA. A seguir, os peixes foram numerados e registrados em caderno
de campo. Por fim, os animais utilizados nos estudos genéticos foram fixados em formol 10%, conservados em etanol 70%, identificados e depositados na coleção de peixes do Laboratório de Genética de Peixes da UNESP, Campus de Bauru, SP.
Em uma primeira etapa de coleta, foram analisados citogeneticamente 19 exemplares de Leporinus macrocephalus (Piauçu) e 20 exemplares de Leporinus elongatus (Piapara), provenientes da piscicultura Kabeya (Penápolis, SP) (Tabela 1). Além destes animais, 30 exemplares adicionais foram também marcados com tags (marcadores magnéticos) (Figura 3a e 3b) e mantidos vivos em tanques da piscicultura Kabeya. De todos os animais analisados citogeneticamente e identificados com marcadores magnéticos, foram coletadas amostras de material biológico (fígado, sangue ou nadadeira) e preservados em etanol 95% para a realização das análises moleculares (Figura 3c).
Tabela 1 - Propriedade, espécies de peixes e número de exemplares analisados e marcados das
espécies parentais utilizadas nos programas de hibridação.
Local de Coleta Espécie Número de exemplares Analisados Marcados
Piauçu - Leporinus macrocephalus 19 30 Piscicultura Kabeya
(Penápolis, SP) Piapara - Leporinus elongatus 20 30
Nesta fase do trabalho, tomou-se o cuidado para que os animais utilizados nas análises fossem representantes de gerações parentais provenientes de capturas na natureza e não decorrentes de gerações sucessivas (F1, F2,...), resultantes de
programas de reprodução induzida nas instalações da piscicultura Kabeya, o que evitou a possibilidade de possível “contaminação genética” das amostras.
Figura 3 - Marcação de exemplares com tags magnéticos. (a) introdução de um pequeno tag na
região dorsal da musculatura do animal. Após a introdução do tag, sempre que necessário este pode ser identificado com um equipamento leitor (b). Coleta de material para análises moleculares (c).
Em uma segunda etapa de coleta, a partir de cruzamentos interespecíficos artificiais realizados na piscicultura Kabeya, deu-se início ao estudo do processo de hibridação entre as espécies Leporinus macrocephalus e Leporinus elongatus, originando os híbridos interespecíficos “Piaupara” (fêmea de L. macrocephalus e macho de L. elongatus) e “Piapaçu” (fêmea de L. elongatus e macho de L. macrocephalus) (Figura 4).
Após o período de crescimento, foram analisados citogeneticamente 21 exemplares do híbrido interespecífico “Piaupara” (Tabela 2). Não foi possível analisar geneticamente o híbrido interespecífico “Piapaçu”, pois em todos os cruzamentos realizados os indivíduos não sobreviveram após a primeira semana de eclosão, tornando-se inviável seu desenvolvimento e criação nas instalações da piscicultura Kabeya. No intuito de verificar se este fenômeno também ocorria em outras pisciculturas, foram realizadas visitas e entrevistas com outros criadores, sendo obtidas informações sobre a dificuldade de produção do híbrido interespecífico “Piapaçu”, o que sugere a ocorrência de uma possível inviabilidade
a b
deste híbrido similarmente em outras instalações de produtores e pisciculturas em geral. Análises específicas para verificar esta suposta inviabilidade se mostram extremamente necessárias. CRUZAMENTOS Fêmea Piauçu L. macrocephalus X Macho Piapara L. elongatus Fêmea Piapara L. elongatus X Macho Piauçu L. macrocephalus “P i a u p a r a” “P i a p a ç u”
Figura 4 - Esquema dos cruzamentos envolvendo as espécies parentais originando seus
respectivos híbridos interespecíficos.
Além dos animais estudados citogeneticamente, também foram marcados 30 exemplares adicionais com tags (marcadores magnéticos) (Figura 3a e 3b) e mantidos vivos em tanques da piscicultura Kabeya. De todos os animais analisados citogeneticamente e identificados com marcadores magnéticos foram coletadas amostras de material biológico (fígado, sangue ou nadadeira) e preservados em etanol 95% para a realização das análises moleculares (Figura 3c).
Tabela 2 - Propriedade e número de exemplares híbridos estudados e marcados.
Local de Coleta Espécie Número de exemplares Analisados Marcados
“Piaupara”
(fêmea do piauçu e macho da piapara) 21 30 Piscicultura Kabeya
(Penápolis, SP)
“Piapaçu”
2.2 Métodos
Métodos para as análises citogenéticas
Nas análises citogenéticas foram utilizados os métodos de estimulação de mitoses (Lozano et al., 1988; Oliveira et al., 1988), preparações diretas de células renais in vivo (Foresti et al., 1981), coloração das regiões organizadoras de nucléolo (NORs) com nitrato de Prata (Howell e Black, 1980), caracterização dos padrões de heterocromatina constitutiva pela banda C (Sumner, 1972) e hibridização fluorescente in situ (FISH) (Porto-Foresti et al., 2002). Algumas modificações foram realizadas nessas técnicas como padronização. Para montagem dos cariótipos, utilizou-se a técnica descrita por Levan et al. (1964). A marcação dos exemplares seguiu o procedimento descrito por Porto-Foresti (2001).
2.2.1 Estimulação de mitoses
Com o objetivo de se obter maior número de mitoses foi utilizada a técnica de estimulação de divisão celular por injeção de uma solução de fermento biológico, descrita inicialmente por Cole e Leavens (1971) para anfíbios e répteis, utilizada por Lee e Elder (1980) para pequenos mamíferos e por Lozano et al. (1988) e adaptada por Oliveira et al. (1988) para peixes. O procedimento utilizado consistiu em:
1 preparar uma solução de fermento biológico (Fleischmann) na seguinte proporção:
0,5 g de fermento, 0,5 g de açúcar e 7 ml de água destilada;