RESUMO
Híbridos interespecíficos de peixes podem representar importantes avanços na exploração zootécnica de representantes deste grupo animal, contudo podem se constituir em sérios riscos biológicos ao meio ambiente e às populações naturais. Logo, torna-se de grande importância a caracterização e monitoramento genético de híbridos produzidos em pisciculturas, identificando de maneira clara e acessível, os componentes das gerações parentais e híbridos. No presente estudo, caracterizou-se através da técnica de hibridização
in situ por meio de uma sonda sexo-específica exemplares de peixes híbridos “Piaupara”,
diferenciando-os de seus respectivos parentais, fêmea de Leporinus macrocephalus (Piauçu) e macho de Leporinus elongatus (Piapara). A aplicação desta metodologia demonstrou um padrão de hibridização diferente entre machos e fêmeas de L. elongatus e
L. macrocephalus, principalmente devido ao fato de algumas regiões dos cromossomos
portadores da NOR de L. elongatus apresentarem homologia com a sonda. Desta forma, as marcações obtidas foram consideradas como diagnósticas pelos padrões espécie e sexo- específicos, diferenciando as espécies parentais. Isto permitiu encontrar um claro modelo sexo-específico na distinção do híbrido “Piaupara”, comprovando que esta técnica fornece um bom marcador para a caracterização do híbrido entre L. macrocephalus e L. elongatus. Além disso, os dados obtidos mostraram-se como importantes recursos metodológicos para a compreensão dos sistemas cromossômicos sexuais no gênero Leporinus, adicionando informações sobre a origem e estabelecimento de um novo sistema sexual recentemente descrito para o gênero Leporinus.
INTRODUÇÃO
Apesar da maioria das espécies de peixes não apresentarem cromossomos sexuais diferenciados, um interessante aspecto encontrado em peixes Neotropicais é a enorme diversidade de mecanismos de diferenciação sexual que inclui desde fêmeas ou machos heterogaméticos, até sistemas simples (XX:XY e ZZ:ZW) ou múltiplos (X1X2Y, XY1Y2 e ZW1W2) (Almeida-Toledo e Foresti, 2001). Na maioria dos casos a
diferença entre os homólogos sexuais envolve blocos heterocromáticos e este fato é muito bem estabelecido em sistemas ZZ:ZW, em que perda ou ganho de heterocromatina são as principais causas de diferenciação entre estes cromossomos (Haaf e Schmid, 1984; Galetti e Foresti, 1986; Moreira-Filho et al., 1993; Venere et al., 2004; Vicari et al., 2006). Já os sistemas múltiplos de heteromorfismos ligados ao sexo geralmente envolvem rearranjos cromossômicos Robertsonianos ou translocação em tandem, sendo que algumas vezes podem resultar em perda de heterocromatina (Almeida-Toledo et al., 1988; Bertollo et al., 1997; Almeida-Toledo et al., 2000a).
No gênero Leporinus (Anostomidae), sete espécies apresentam o sistema simples de cromossomos sexuais do tipo ZZ/ZW (Galetti et al., 1981a; Galetti e Foresti, 1986 e 1987; Galetti et al., 1995a; Molina et al., 1998). Segundo estes autores, neste sistema sexual, um grande cromossomo subtelocêntrico e com o braço longo totalmente heterocromático é o típico cromossomo W, presente somente no cariótipo de fêmeas; em contraste, o cromossomo Z, presente em ambos os sexos, é um submetacêntrico e heterocromático apenas na porção final do braço longo.
Recentemente, dois novos relatos de cromossomos sexuais no gênero Leporinus foram descritos, com um mecanismo atípico e morfologicamente diferente ZZ:ZW em L. aff. brunneus (Venere et al., 2004) e um sistema múltiplo Z1Z1Z2Z2:Z1W1Z2W2 para a espécie L. elongatus, que aparentemente apresentava o
sistema ZZ:ZW padrão do gênero (Parise-Maltempi et al., 2007). Neste último, através do isolamento de um novo elemento repetitivo e seu posterior uso como sonda sexo- específica pela técnica de FISH, somado com informações de Ag-NOR e bandamento C, foi inferido que L. elongatus apresenta preferencialmente um sistema múltiplo de cromossomos sexuais envolvendo os cromossomos portadores da NOR.
Atualmente, cruzamentos interespecíficos para produção de linhagem híbrida envolvendo as espécies Piauçu (Leporinus macrocephalus) e Piapara (Leporinus elongatus) estão sendo produzidos em pisciculturas brasileiras sem qualquer monitoramento. A hibridação interespecífica visa principalmente ao aumento da produtividade e a obtenção de linhagens estéreis (Bartley et al., 2001). No entanto, híbridos de peixes podem representar sérios riscos biológicos ao meio ambiente, “contaminando geneticamente” estoques naturais ou cultivados e competindo de diversas formas com as linhagens parentais (Ryman e Utter, 1987; Toledo-Filho et al., 1994; Allendorf et al., 2001). Logo, torna-se de grande importância a caracterização e monitoramento genético de híbridos produzidos em pisciculturas, identificando de maneira clara e acessível, as formas parentais e os híbridos.
A partir desta nova ocorrência de cromossomos sexuais em L. elongatus, os objetivos deste estudo foram verificar se o DNA repetitivo isolado de L. elongatus está distribuído diferentemente nos cromossomos sexuais de L. macrocephalus e assim, buscar marcadores sexo-específicos na identificação de híbridos envolvendo estas espécies, que fornecerão subsídios para um monitoramento adequado nas pisciculturas e na orientação de programas de conservação biológica.
MATERIAIS E MÉTODOS
Na linhagem parental, 19 exemplares de Leporinus macrocephalus (14 machos e 5 fêmeas) e 20 indivíduos de Leporinus elongatus (12 machos e 8 fêmeas) foram analisados citogeneticamente. Cruzamentos artificiais realizados entre estas espécies resultaram na produção do híbrido interespecífico “Piaupara”, usando como fêmeas L. macrocephalus e como machos L. elongatus, cujas análises genéticas compreenderam 21 exemplares (8 machos e 13 fêmeas). Todas as amostras foram obtidas do estoque pertencente à Piscicultura Kabeya, Penápolis (SP), Brasil, que também é o local onde os híbridos foram produzidos artificialmente. Os componentes dos estoques parentais de L. elongatus e L. macrocephalus, cultivados nesta piscicultura, foram coletados na região do Pantanal Sul mato- grossense. Os exemplares analisados foram identificados e depositados na coleção de peixes do Laboratório de Genética de Peixes, UNESP, Bauru (SP), Brasil.
Para os estudos citogenéticos, os exemplares foram previamente submetidos à técnica de estimulação mitótica (Oliveira et al., 1988). Em seguida, as preparações cromossômicas foram obtidas de fragmentos de tecidos de rins e brânquias, utilizando o método descrito por Foresti et al. (1981). A morfologia cromossômica foi determinada de conformidade com o proposto por Levan et al. (1964). Para realização da técnica de hibridização fluorescente in situ foram utilizadas a sonda sexo-específica (LeSpeI) isolada de Leporinus elongatus, preparada e cedida pela Dra. Patricia Pasquali Parise Maltempi e a sonda de genoma total extraída de preparações cromossômicas de L. macrocephalus. A marcação da sonda sexo-específica foi por meio da incorporação da biotina-dATP pela técnica de nick translation (BionickTM Labelling System-Gibco.BRL).
A sonda de genoma total foi marcada com o nucleotídeo Tetramethyl-rhodamine-5- dUTP (Roche Diagnostics) pela técnica de PCR. Após as marcações, procedeu-se a
técnica de hibridização utilizada por Porto-Foresti et al. (2002). As lâminas foram contra-coradas com iodeto de propídio ou DAPI.
Para a extração da sonda genômica, alíquotas (3 µl) do material citogenético de Leporinus macrocephalus foram colocadas em tubo de microcentrífuga e mantidas na estufa a 37ºC permitindo a evaporação do metanol. Em seguida, o material (pellet) foi ressuspendido na solução de PCR e as reações foram realizadas de acordo com Telenius et al. (1992), com um volume final de 20 µl: 1x tampão da Thermosequenase, 150 µM de cada dNTP e 2 M do primer DOP (5’- CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG -3’). A solução foi aquecida a 90ºC por 10 min e posteriormente, adicionado 2 µl da enzima Thermosequenase (4U l-1). O programa da PCR consistiu em: desnaturação inicial a 95ºC/3 min e 10 ciclos de 94ºC/1,5 min, 30ºC/3 min e 72ºC aquecido lentamente em 4 min (aproximadamente 0,2ºC seg-1),
seguidos por 35 ciclos de 94ºC/1,5 min, 56ºC/1,5 min e 72ºC/1,5 min. Alíquotas (2 µl) do produto de PCR foram então marcadas para o procedimento de FISH repetindo 35 ciclos de 94ºC/1,5 min, 56ºC/1,5 min e 72ºC/1,5 min, com a presença de 20 M do nucleotídeo Tetramethyl-rhodamine-5-dUTP (Roche Diagnostics). Após a PCR, adicionou-se 20 µl da solução de hibridação (50% formamida deionizada, 10% dextran sulfate, 2XSSC e 20 mg/ml de albumina fetal bovina).
RESULTADOS
A aplicação da técnica de hibridização in situ através da sonda sexo- específica (LeSpeI), isolada de L. elongatus por restrição enzimática (Parise- Maltempi et al., 2007), demonstrou que nas preparações cromossômicas dos indivíduos parentais e híbridos não houve homologia entre a sonda e o cromossomo
diferentes padrões sexo-específicos entre os parentais L. macrocephalus e L. elongatus.
Em fêmeas de L. macrocephalus observou-se apenas algumas regiões do cromossomo W hibridizadas, sendo três evidentes marcações localizadas na região distal do braço longo e distribuídas de forma intercalada em outras regiões cromossômicas (Figura 1a). Já nos exemplares machos, nenhum cromossomo mostrou homologia pela sonda LeSpeI e desta maneira, utilizou-se a sonda de genoma total conjuntamente como controle da técnica, que hibridizou em todos os cromossomos, principalmente nas regiões de DNA repetitivo dos telômeros e centrômeros (Figura 1b).
Figura 1 - Metáfase de fêmea (a) de L. macrocephalus marcada pela sonda LeSpeI, evidenciando o
cromossomo W (seta). Em (b), metáfase de macho de L. macrocephalus evidenciando somente marcação pela sonda genoma total.
As fêmeas de L. elongatus também revelaram o cromossomo W hibridizado em alguns loci, com três marcações localizadas na região distal do braço longo e distribuídas de forma intercalada em outras regiões cromossômicas, revelando o mesmo padrão do cromossomo W de L. macrocephalus. Além disso, apresentaram marcações na região telomérica do braço curto e outras dispersas no braço longo de um cromossomo submetacêntrico, enquanto o seu homólogo apresentou marcado
b a
somente a região telomérica do braço curto. Estes cromossomos foram identificados como o par cromossômico portador da NOR, evidenciado pela constrição secundária e por ser o par número 2 do cariótipo, como descrito por outros autores (Koehler et al., 1997; Hashimoto et al., Capítulo 1). Os machos também apresentaram marcações nos cromossomos portadores da NOR. Contudo, as marcações foram iguais em ambos os cromossomos homólogos, onde apenas a região telomérica do braço curto teve homologia com a sonda (Figura 2).
Figura 2 - Metáfases de fêmea (a) e macho (b) de L. elongatus, marcadas pela sonda LeSpeI. Abaixo
esquemas evidenciando os pares cromossômicos da NOR e sexuais.
Ao se aplicar a técnica de FISH com a sonda sexo-específica nas preparações cromossômicas do híbrido “Piaupara” observou-se o padrão de hibridização esperado, conforme representado na Figura 3a, em que as fêmeas apresentaram hibridizado o cromossomo W proveniente de L. macrocephalus e somente um cromossomo portador da NOR herdado de L. elongatus (Figura 3b). Os
b a
machos tiveram apenas um cromossomo da NOR proveniente de L. elongatus marcado pela sonda (Figura 3c).
DISCUSSÃO
No gênero Leporinus, tendo em vista as similaridades dos cromossomos Z e W indicadas pela coloração convencional e pelo bandamento C, foi sugerido que
Figura 3 - Representação esquemática do padrão esperado para o híbrido (a). Metáfases
de fêmea (b) e macho (c) do híbrido “Piaupara” marcadas pela sonda LeSpeI.
b c
este sistema seja único, envolvendo os mesmos cromossomos em todas as espécies que os apresentam (Galetti e Foresti, 1986 e 1987). Segundo os autores, este sistema deve ter se desenvolvido através de um processo de heterocromatinização em um cromossomo Z indiferenciado. Um processo posterior de acúmulo desta heterocromatina, possivelmente acompanhado de mudanças qualitativas, resultou na diferenciação do cromossomo W (Galetti e Foresti, 1986 e 1987; Galetti et al., 1995a). Esta hipótese é corroborada com a aplicação de outras técnicas citogenéticas por Molina e Galetti (2006) e também no presente estudo, em que se observou uma família de DNA repetitivo marcado pela sonda apenas no cromossomo W e ausente no cromossomo Z, o que evidencia um acúmulo de heterocromatina e mudanças qualitativas na diferenciação do W.
A aplicação da sonda LeSpeI pela técnica de FISH, que identifica regiões de DNA satélite nos cromossomos de Leporinus elongatus (Parise-Maltempi et al., 2007), possibilitou encontrar um padrão de distribuição no cromossomo W similar entre as duas espécies parentais (L. elongatus e L. macrocephalus), o qual poderia ser explicado pela ocorrência de duplicações em tandem envolvendo estas regiões. Esta situação em comum para as duas espécies reforça a hipótese proposta inicialmente por Galetti e Foresti (1986 e 1987), em que este mecanismo de diferenciação foi originado apenas uma vez durante a história evolutiva deste grupo e compartilhado pelas sete espécies tendo por origem um ancestral comum. O uso de outras técnicas citogenéticas também tem sido útil na confirmação da heterogeneidade e na caracterização de diferentes padrões de heterocromatina nos cromossomos sexuais das espécies de Leporinus (Nakayama et al., 1994; Molina et al., 1998; Molina e Galetti, 2006), sugerindo que modificações espécie-específicas tenham ocorrido neste grupo, dando origem à diversificação.
Um estudo envolvendo a produção de sondas de DNA sexo-específicas foi realizado anteriormente por Nakayama et al. (1994) na espécie L. elongatus. Neste estudo, os autores isolaram duas seqüências relacionadas aos cromossomos sexuais desta espécie: L’5 que hibridizou com ambos os cromossomos Z e W e L’46 que marcou parte de uma região cromossômica específica do W. Estas seqüências aparentemente não apresentaram nenhuma significância biológica, desde que não são parte de seqüências codificantes e também não mostraram clara similaridade com qualquer seqüência conhecida e nem com o elemento LeSpeI (Nakayama et al., 1994; Parise-Maltempi et al., 2007). No entanto, estas seqüências podem representar uma acumulação no genoma que, direta ou indiretamente favoreceram a diferenciação dos cromossomos sexuais, como visto no presente estudo para as espécies L. elongatus e L. macrocephalus.
Segundo Porto-Foresti et al. (2006), até recentemente os estudos cariotípicos nos peixes eram considerados principalmente como uma ferramenta para estudos básicos e evolutivos e pouco utilizados no manejo e monitoramento de estoques. Contudo, o emprego de marcadores citogenéticos tem sido considerado muito eficaz e acessível na identificação de híbridos, tendo como principal objetivo a caracterização e diferenciação das espécies parentais e das linhagens de híbridos interespecíficos artificiais (Toledo-Filho et al., 1994; Ocalewicz et al., 2006). Segundo os autores, além de serem considerados de baixo custo, os métodos citogenéticos constituem uma maneira bastante precisa de se verificar tanto os níveis de ploidia como a procedência dos complementos cromossômicos dos parentais nos produtos resultantes da hibridação interespecífica em peixes.
Entre as espécies de peixes Neotropicais, estudos citogenéticos visando a caracterização de híbridos foram realizados com as espécies Piaractus mesopotamicus x Colossoma macropomum e Leporinus macrocephalus x Leporinus
elongatus (Almeida-Toledo et al., 1987; Hashimoto et al., Capítulo 1). Para estas espécies, híbridos e parentais apresentaram números diplóides iguais, com cariótipo similar em número e morfologia, não sendo possível diferenciá-los com o uso das técnicas citogenéticas usuais. Nestes casos, bandamentos cromossômicos específicos e técnicas de coloração diferenciadas foram também utilizados na tentativa de encontrar marcadores diferenciais.
No estudo de Hashimoto et al. (Capítulo 1), como os cariótipos de híbridos “Piaupara” e os respectivos parentais se demonstraram indistinguíveis após coloração com Giemsa, a aplicação da técnica de banda C e a coloração por nitrato de Prata revelaram ser muito eficientes como diagnósticos na correta identificação das espécies parentais e do híbrido. Assim, o estudo envolvendo a identificação destes híbridos demonstrou a necessidade de se obter vários marcadores como forma de enriquecer a análise. Neste sentido, a aplicação da técnica de FISH com sonda sexo-específica também evidenciou marcações diagnósticas em cromossomos de L. elongatus que diferiram de L. macrocephalus, principalmente por regiões dos cromossomos portadores da NOR de L. elongatus que se apresentaram diferenciadas pela sonda, determinando um padrão espécie e sexo- específico na diferenciação destas espécies.
Consequentemente, a aplicação desta metodologia possibilitou encontrar um claro modelo sexo-específico na identificação do híbrido “Piaupara”, comprovando que este método fornece um bom marcador citogenético para diferenciação de parentais e híbridos. Evidenciado pelas características herdadas de apenas um conjunto cromossômico de cada parental, considera-se que o cromossomo marcador na identificação do híbrido é o cromossomo portador da NOR de L. elongatus, cujo diagnóstico decorre da presença de marcações em um único
Segundo Parise-Maltempi et al. (2007), as diferentes marcações envolvendo os cromossomos da NOR em L. elongatus revelaram um novo sistema sexual para a espécie. De acordo com os autores, avaliando a presença de dois cromossomos exclusivos em fêmeas de L. elongatus, considera-se que estes deveriam ser identificados como W1 e W2, em que o cromossomo W representa o W1 e o
cromossomo da NOR, que apresenta um bloco intersticial marcado pela presença do elemento LeSpeI, corresponderia ao W2. Diante disso, foi proposto que o sistema
cromossômico sexual simples ZW primeiramente descrito por Galetti et al. (1981a) seria preferencialmente um sistema múltiplo do tipo Z1Z1Z2Z2:Z1W1Z2W2, em que o
par portador da NOR, equivalente ao par 2 do cariótipo, estaria representando os componentes Z2W2.
Como observado no presente estudo, o DNA repetitivo LeSpeI localizado no braço longo do cromossomo W e em algumas regiões do par portador da NOR de L. elongatus compartilham de uma natureza comum. De acordo com Parise-Maltempi et al. (2007), este padrão repetitivo disperso no genoma do segmento LeSpeI sugere que esta seqüência poderia pertencer à classe de elementos transponíveis dispersos (TE) (Oliveira et al., 1999; Bodvarsdottir e Anamthawat-Jonsson, 2003; Ziegler et al., 2003). Porém, apesar do processo de hibridização Southern blot usando LeSpeI gerar bandas entre 450 e 3.000 pb, como observado para maioria dos TE (Tafalla et al., 2006), não foi possível identificar características de TE nos fragmentos isolados de LeSpeI (Parise-Maltempi et al., 2007). Desta forma, não se pode descartar a hipótese de que durante a evolução destes cromossomos possam ter ocorrido rearranjos estruturais, tais como translocação e duplicações, que possibilitariam explicar este grau de homologia entre o cromossomo W e o par portador da NOR encontrado em L. elongatus. Esta situação pode ser reforçada devido aos indícios da presença de NOR no cromossomo W de L. elongatus,
aumentando a similaridade entre estes cromossomos, como descrito por Molina e Galetti (2006), quando a identificação da Ag-NOR é realizada em preparações cromossômicas previamente submetidas à substância 5-BrdU.
Já em L. macrocephalus, verifica-se que não existe dispersão de heterocromatina no cromossomo portador da NOR, demonstrando que os elementos transponíveis repetitivos não se dispersaram no genoma desta espécie ou que rearranjos cromossômicos envolvendo estas regiões não teriam ocorrido. Também deve ser considerada a hipótese da ocorrência de alguma destas situações seguida da perda posterior desta heterocromatina durante a história evolutiva da espécie.
Considera-se que os dados apresentados contribuem com subsídios para um melhor monitoramento da hibridação interespecífica envolvendo estas espécies e outros projetos de hibridação a serem desenvolvidos em pisciculturas brasileiras. De outro lado, as informações geradas podem contribuir para a melhor compreensão dos sistemas cromossômicos sexuais no gênero Leporinus, adicionando dados sobre a origem e estabelecimento deste novo sistema sexual.