School of Agriculture, Food Science and Veterinary Medicine, University College Dublin, Belfield, Dublin 4, Ireland
Resumo
A produção in vitro de embriões bovinos é um processo ineficiente; enquanto a maturação e a fertilização procedem aparentemente de modo normal, a proporção de embriões que atingem o estágio transferível (blastocisto) raramente é superior a 40% e aqueles que atingem esse estágio estão freqüentemente comprometidos em qualidade e capacidade. Existem evidências consideráveis sobre a influência significativa da origem folicular no potencial de desenvolvimento do oócito e parece que uma vez que o oócito é removido do folículo sua capacidade de desenvolvimento é limitada. As evidências sugerem que, enquanto as condições de cultivo durante a produção in vitro de embriões bovino possam ter impacto sobre o potencial de desenvolvimento inicial do embrião, a qualidade intrínseca do oócito é o fator chave que determina a proporção de oócitos que se desenvolverão até o estágio de blastocisto. Esse trabalho destaca alguns dos problemas associados com a produção in vitro de embriões e discute algumas das maneiras de superar esses problemas. Palavras - chave: MIV, FIV, CIV, qualidade do embrião.
Introdução
Em rebanhos bovinos, a produção in vitro (PIV) de embriões tem sido utilizada em larga escala por mais de duas décadas (Gordon, 2003). É justo dizer que seu principal uso tem sido na pesquisa, como forma de compreender o que acontece durante o desenvolvimento embrionário normal in vivo em bovinos, como meio para alcançar outras tecnologias, tais como transferência nuclear, bem como uma ferramenta para examinar o que acontece de modo incorreto durante o processo de desenvolvimento, e na verdade, como modelo a partir do qual conclusões para outras espécies possam ser extrapoladas. Dada a heterogeneidade que esperamos de embriões PIV, em termos de qualidade, uma questão é, como fazer um bom modelo?
Existem diversos desafios associados à tecnologia PIV. Estes desafios já existem ou são derivados do fato de que a origem dos oócitos utilizados (estágio do ciclo estral, estágio da onda folicular, etc.) é desconhecida e, portanto a qualidade do oócito é variável; existem várias diferenças na capacidade dos espermatozóides para fertilizar oócitos in vitro visto que são coletados de diferentes touros; e alterações nas condições da cultivo pós-fertilização podem alterar drasticamente a qualidade do embrião. Além disso, após a transferência, a qualidade de embriões PIV é consideravelmente menor que a de embriões produzidos in vivo, o que tem sido freqüentemente associado com anormalidades fetais e neonatais (revisado por [2]).
Geralmente é aceito que embriões produzidos in vitro para fins de transferência são de qualidade inferior àqueles produzidos in vivo. Existem muitos indícios na literatura que apóiam essa afirmação com base em dados morfológicos, de criotolerância, perfis de expressão de transcrito e, é claro, sobre as taxas de gestação após transferência (revisado por Fair et al., 2006). No entanto, esta informação deve ser qualificada pela ressalva de que existem muitos tipos de sistemas de cultivo in vitro e alguns são claramente melhores que outros. O significado prático dessa percepção é refletido pelos dados estatísticos sobre o comércio de transferência de embriões elaborados a cada ano pela IETS; em 2006, o último ano para o qual existem dados disponíveis, mostra que as transferências de embriões produzidos in vivo e de embriões PIV continuou a aumentar em pouco menos de um milhão de transferências. Em todo o mundo, mais de 670.000 embriões produzidos in vivo foram transferidos, dos quais aproximadamente metade foi transferido a fresco e metade congelados. Em contrapartida, cerca de 292.000 embriões PIV foram transferidos no mesmo ano dos quais a maioria (aproximadamente 75%) foi transferida a fresco (Thibier, 2007).
Antes de abordar alguns dos problemas associados aos embriões PIV, vale considerar o “padrão de ouro” com os quais os comparamos - embriões produzidos in vivo. Na literatura há inúmeros exemplos de estudos que comparam o desenvolvimento, a morfologia, a bioquímica ou a biologia molecular de embriões PIV sob diferentes condições de cultivo in vitro (CIV). Enquanto tais estudos freqüentemente destacam as diferenças nos parâmetros avaliados com relação a certos constituintes ou às modificações da atmosfera gasosa na qual os cultivos estão, relativamente poucos estudos fazem comparação com embriões in vivo. Isto é talvez compreensível, levando-se em conta que os recursos disponíveis para a maioria dos laboratórios de FIV limitam a interpretação dos dados de alguma forma.
ISSN 1678-0345 (Print) ISSN 1679-9216 (Online) Acta Scientiae Veterinariae 36(Supl. 2): s349-s360, 2008.
Na minoria dos estudos que fazem comparação com embriões in vivo, pode-se questionar a adequação ou a normalidade do uso dos embriões in vivo. Alguns grupos, incluindo o nosso, têm utilizado embriões produzidos por MIV/FIV, mas que foram cultivados in vivo em oviducto de ovelha (por exemplo, Rizos et al., 2002) ou de vaca (Tesfaye et al., 2007) como se fossem embriões produzidos in vivo de verdade. Porém, enquanto tais embriões são muito semelhantes aos embriões in vivo em muitos aspectos, incluindo os mais importantes, a taxa de gestação e o seu histórico de desenvolvimento são muito diferentes. Normalmente, quando embriões produzidos completamente in vivo são utilizados em pesquisa, devido às dificuldades na obtenção de número suficiente de bovinos mono- ovulatórios, eles são obtidos por superovulação de uma doadora, inseminação e recuperação não cirúrgica. Sabe-se que a superovulação traz uma série de problemas, tais como potencializar folículos destinados a atresia, e assim, induzir a ovulação de oócitos comprometidos, bem como induzir mudanças no trato uterino que possam afetar o transporte de gametas (Hyttel et al., 1991). Dito isto, enquanto “desviantes” da maturação podem ocorrer após superestimulação, pouca ou nenhuma evidência deve existir para sugerir que, se um embrião obtido por superovulação alcançar o estágio de blastocisto ele é menos estável que um oriundo de uma gestação a partir de uma única ovulação (ou seja, não-estimulada).
O objetivo desta pequena revisão é esclarecer alguns dos problemas associados aos embriões PIV e discutir alguns meios de solucionar esses problemas. Ao invés de repetir o que já foi amplamente dito em outras revisões recentes (ver Hansen et al., 2006 e artigos relacionados), algumas áreas selecionadas foram escolhidas.
Lidando com problemas
Existem diferenças em nível morfológico, ultraestrutural, fisiológico, transcricional e metabólico entre embriões PIV e in vivo e isso pode sugerir que deveria haver uma ampla variedade de ferramentas disponíveis para identificar aqueles embriões PIV com características mais próximas dos embriões in vivo. Apesar disso, muitas avaliações são ainda baseadas em análises morfológicas subjetivas. Em parte, isso ocorre porque muitos dos testes são invasivos e, portanto, no processo de identificação de bons embriões eles são destruídos, e em parte porque muitas evidências são equivocadas, com relatos conflitantes em toda a literatura sobre a sua utilidade. Além disso, por diversas razões, muitos ensaios são realizados com “pools” de embriões ao invés de embriões individuais, pois resultados individuais são difíceis de interpretar. Então, como poderemos melhorar a proporção de bons embriões, aqueles com maior probabilidade de estabelecer e manter uma gestação após a transferência?
Melhorar a qualidade do oócito - antes ou após a remoção do folículo?
A origem folicular do oócito tem influência significativa sobre o seu potencial de desenvolvimento e parece que depois que o oócito é removido do folículo seu potencial de desenvolvimento é limitado. Enquanto a adição de uma variedade de gonadotrofinas, esteróides e fatores de crescimentos tem sido relatado por aumentar o desenvolvimento do blastocisto, esse aumento tende a ser modesto e raramente se aproxima, por exemplo, daquele obtido com oócitos maturados in vivo (Rizos et al., 2002). A capacidade intrínseca de desenvolvimento do oócito, avaliado pelo desenvolvimento até o estágio de blastocisto, tem sido positivamente relacionada com o tamanho do folículo antral do qual ele é removido (Lonergan et al., 1994), com o estágio da onda folicular (Hendriksen et al., 2004; Machatkova et al., 2004), e com o local de maturação (in vivo vs in vitro) (Rizos et al., 2002; Dieleman et al., 2002).
É possível manipular o crescimento folicular e de que modo a capacidade de desenvolvimento do oócito imaturo é afetado após sua remoção. Um período de “inércia” entre o estímulo hormonal e a coleta do ovário (Blondin et al., 1997a) bem como o intervalo de tempo entre a coleta do ovário e a aspiração do oócito (Blondin et al., 1997b) afetam significativamente o desenvolvimento subseqüente do oócito. Em um estudo recente, os melhores resultados foram obtidos quando os animais receberam 6 injeções de FSH com um período de inércia de 48 horas; administrando o LH 6 horas antes da aspiração ovariana resultou em 80% de oócitos que atingiram o estágio de blastocisto in vitro (Blondin et al., 2002). Posteriormente, contudo, em um estudo retrospectivo, examinando os dados coletados em um período de 5 anos, a variação no tratamento de superovulação em termos do tipo de FSH em associação com um período mais curto ou mais longo de inércia não afetou a resposta ovariana ou a taxa de desenvolvimento embrionário após a FIV (Durocher et al., 2006).
Duas grandes abordagens têm sido tomadas para melhorar a capacidade de desenvolvimento do oócito após sua retirada do folículo. A primeira tem sido a adição de substâncias promotoras de crescimento nos meios de cultivo (gonadotrofinas, esteróides, fatores do crescimento). Embora modestas melhorias no desenvolvimento possam ser alcançadas, o rendimento do blastocito raramente é acima de 50% (Thompson, 2000). A segunda abordagem tem sido tentar mimetizar as condições intrafoliculares para o oócito onde a meiose está parada. Uma explicação para o desenvolvimento insatisfatório dos oócitos imaturos obtidos de ovários de novilhas abatidas é que eles são obtidos primeiramente a partir de folículos de tamanhos pequeno e médio os quais, se selecionados para se tornarem Lonergan, P. 2008. Produção in vitro de embriões bovinos – Lidando com problemas. In vitro-produced bovine embryos –
dominantes, ainda estão distantes do período da possível ovulação. Em contraste, o folículo que ovula o oócito maduro em metáfase II cresce a um tamanho de 15 a 20 mm. Deste modo, oócitos submetidos à maturação in vitro, embora capazes de elevadas taxas de maturação nuclear, tiveram tempo insuficiente para maturação citoplasmática normal. Além disso, o oócito maturado in vivo se dá na presença do líquido folicular e por um estímulo ‘positivo’ iniciado pelo aumento súbito de LH; em contraste, para a maturação in vitro do oócito, após sua remoção do líquido folicular ‘negativo’ (do ponto de vista regulatório), se dá sem o estímulo positivo iniciado pelo aumento súbito de LH. Portanto, não é surpreendente que os resultados são um pouco diferentes. Muitos autores têm dado atenção para a inibição artificial do recomeço da meiose, utilizando diversos métodos celulares e químicos, em um esforço para permitir o desenvolvimento citoplasmático in vitro na ausência de maturação nuclear (revisado por Sirard, 2001). Esses estudos mostraram que é possível manter a meiose parada fora do folículo por 24 a 48 horas e liberar o oócito dessa fase sem afetar o desenvolvimento do blastocisto ou o desenvolvimento fetal. No entanto, nenhuma destas abordagens, até agora, tem contribuído para melhorar a capacidade de desenvolvimento.
Esses dados iriam apoiar a idéia de que o desenvolvimento máximo do oócito é fixo uma vez que ele é removido do folículo.
Cultivo embrionário in vivo – um meio para melhorar a qualidade do embrião
Modificações nas condições de cultivo, particularmente no cultivo pós-fertilização podem ter impacto significativo na qualidade dos blastocistos; contudo melhorias significativas no rendimento dos blastocistos somente podem ser conseguidas por melhorias na qualidade do oócito submetido à maturação in vitro (Rizos et al., 2002; Lonergan et al., 2006).
Tem sido mostrado por vários autores que cultivos de embriões bovinos em oviduto de ovelhas são um meio adequado para o desenvolvimento de embriões do estágio de zigoto a blastocisto (por exemplo, Lonergan et al., 2003) e até mesmo nos estágios iniciais de alongamento (Rexroad and Powell, 1999). Embora não seja perfeito, uma vantagem desse sistema de cultivo in vivo é a capacidade de produzir grande número de embriões em um ambiente “próximo ao in vivo” e de uma forma rentável. Apesar do rendimento do blastocisto após o cultivo in vivo não ser superior àquele após o cultivo in vitro, a qualidade dos blastocistos têm sido significativamente melhorada (Rizos et al., 2002).
No entanto, a transferência heteróloga e o cultivo de embriões nunca são totalmente satisfatórios do ponto de vista experimental. Recentemente, a endoscopia tem sido usada com sucesso para acessar os ovidutos de bovinos para o cultivo in vivo de embriões fertilizados em ovidutos homólogos ou maturados in vitro (Besenfelder et al., 2001; Tesfayne et al., 2007). Enquanto esta técnica requer um nível significativo de habilidade e experiência (atualmente apenas praticado rotineiramente por um grupo a nível mundial para a transferência tubária de embriões), ela também é muito promissora para estudos comparativos do desenvolvimento do embrião e de expressão gênica in vivo e in vitro (Rings et al., 2008).
Avaliação da qualidade do embrião Secreção de interferon-tau
O interferon-tau (IFN-τ) é secretado pelas células mononucleadas do trofoblasto extra-embrionário primitivo, o qual forma a principal parte da placenta em ruminantes e desempenha um papel essencial no reconhecimento materno da gestação (Spencer et al., 2004). Os embriões bovinos começam a expressar IFN-τ com a formação do blastocisto (Farin et al., 1990) e portanto, poderia ser aceitável supor que a capacidade de um embrião para produzir grandes quantidades dessa proteína in vitro teria correlação com a sua habilidade para estabelecer uma gestação. No entanto, existe uma variabilidade considerável entre os embriões com relação à quantidade de IFN-τ por eles produzida que pode estar relacionada com a origem do embrião (Stojkovic et al., 1999), com a idade em que ocorre a formação do blastocisto (Kubisch et al., 1998, 2000), com o tamanho do grupo em que está o cultivo (Larson e Kubisch, 1999), ou com o sexo do embrião (Larson et al., 2001). Essa variabilidade até então, tornaram as medidas de secreção de IFN-τ inconvenientes para seleção de bons embriões para transferência. De fato, Kubisch et al. (2004) observaram uma relação negativa entre o início da produção de IFN-τ e a competência de desenvolvimento. No estudo de Neira et al. (2007), uma positiva relação entre a produção de IFN e o desenvolvimento in vitro de embriões de boa qualidade foi observado, independente da origem do embrião (in vitro ou in vivo), e embriões produzidos completamente in vitro produziram mais IFN que aqueles produzidos in vivo.
Anormalidades cromossômicas
Utilizando hibridização in situ, demonstrou-se que uma elevada porcentagem de blastocistos bovinos produzidos Lonergan, P. 2008. Produção in vitro de embriões bovinos – Lidando com problemas. In vitro-produced bovine embryos –
in vitro são mixoplóides (>70%) comparado com aqueles produzidos in vivo (25%) (Viuff et al., 1999). Isso indica que o processo de produção in vitro de embriões leva a formação de embriões anormais, mas não indica em qual(is) etapa(s) do processo as mudanças deletérias ocorrem. Os mesmo autores, posteriormente, demonstraram que as anormalidades cromossômicas numéricas foram detectadas no início do Dia 2 em ambos embriões in vivo ou in vitro (Viuff et al., 2000, 2001) e aumentaram do Dia 2 para o Dia 5. Deste modo, as condições de maturação do oócito, fertilização e o início do cultivo do embrião in vitro podem aumentar a proporção de embriões com anormalidades cromossômicas, mas a importância relativa desses três passos é desconhecida.
Utilizando condições conhecidas de cultivo para produzir blastocistos de diferentes qualidades, examinamos se o ambiente de cultivo pós-fertilização tem efeito na incidência de anormalidades cromossômicas em blastocistos bovinos (Lonergan et al., 2004). Os blastocistos foram produzidos após o cultivo in vitro de embriões PIV, em fluido sintético de oviducto, na ausência ou presença de soro ou in vivo, no oviducto de ovelha. Um total de 10.025 núcleos foi marcado em 122 blastocistos com uma média de 82,2 núcleos por embrião analisado. A freqüência de blastocistos diplóides normais foi de 21,4%, 8,8% e 34,8% em embriões produzidos por cultivo em SOF-SFB, em SOF+SFB e no oviducto de ovelha, respectivamente, e o restante mostrou algum grau de mixoploidia. A omissão de soro do SOF resultou em uma redução não significativa na incidência de mixoploidia (91,2 vs 78,6%). O cultivo in vivo, no entanto, resultou em uma significativa (p < 0,01) redução na incidência de mixoploidia comparado à cultivo in vitro na presença de soro (65,2 vs 91,2%, respectivamente).
Expressão gênica diferencial
Numerosos relatos têm surgido na literatura ao longo da última década relacionados aos padrões de expressão gênica total, múltipla ou única de embriões bovinos provenientes de cultivo (revisado por Wrenzycki et al., 2005). Além disso, o meio de cultivo utilizado e as condições do cultivo podem também afetar a expressão gênica; por exemplo, a abundância relativa de transcritos específicos em embriões bovinos produzidos in vitro é alterada em resposta às mudanças de oxigênio do meio no processo de pós-compactação (Harvey et al., 2007). Infelizmente, as análises de abundância de transcrito são um procedimento invasivo e enquanto esses estudos têm elegantemente demonstrado como embriões PIV diferem de seus homólogos produzidos in vivo, o significado funcional de tais diferenças são difíceis de testar e interpretar. Poucos estudos, tem tentado correlacionar as diferenças na abundância de mRNA observadas no estágio de blastocisto, tais como as descritas acima, com a capacidade do embrião em estabelecer uma gestação. Um estudo recente (El-Sayed et al., 2007) abordou a relação entre o perfil transcricional de embriões e o sucesso da gestação baseado em análise de expressão gênica de biópsias de blastocisto antes de serem transferidos para as receptoras. Dados de análises de microarray revelaram um total de 52 genes regulados diferencialmente entre embriões que resultaram em um bezerro nascido vivo versos àquele que não resultou em gestação. As biópsias do bezerro nascido vivo apresentaram expressão maior de genes necessários para a implantação, metabolismo de carboidratos, transdução do sinal e desenvolvimento placentário, enquanto aqueles que a não conseguiram estabelecer uma gestação apresentaram mais transcritos para citocinas inflamatórias, proteínas ligadas a aminoácido, fatores de transcrição, metabolismo de glicose e inibição da implantação.
Conclusões
A produção de embriões in vitro proporciona um recurso inestimável para o estudo do desenvolvimento inicial de mamíferos e um meio para alcançar outras tecnologias como transferência nuclear transgenese. O embrião bovino PIV é, sem dúvida, muito diferente em muitos aspectos de seu homólogo in vivo (“normal”) e claramente existem alguns problemas associados com embriões produzidos dessa forma. Contudo, devido ao fato de que uma proporção significativa de embriões PIV são aparentemente normais e capazes de desenvolver uma progênie normal e saudável, tais embriões são susceptíveis de serem mantidos como modelos de desenvolvimento muito importante para o futuro.
Referências
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