TESTES DE DETERMINAÇÃO LIPÍDICA PARA OÓCITOS E EMBRIÕES Gradientes de densidade

LIPÍDIOS INTRACELULARES NOS EMBRIÕES DE BOVINOS TÊM UM EFEITO NA CRIOTOLERÂNCIA E NA VIABILIDADE DE EMBRIÕES PÓS-DESCONGELADOS

TESTES DE DETERMINAÇÃO LIPÍDICA PARA OÓCITOS E EMBRIÕES Gradientes de densidade

Partículas celulares de tecidos e fluidos biológicos podem ser separadas por gradientes de densidade. Muito dos meios do gradiente de densidade tem sido desenvolvidos desde os anos 60 e tiveram muitos avanços neste campo de pesquisa [Pertoft, H., 2000]. Um método muito praticado para estabelecer um gradiente de densidade e determinação indireta do conteúdo lipídico é pela colocação de camadas intensificadas de solução de sacarose de diferentes concentrações (ou seja, densidades) no tubo teste, com as camadas mais pesadas estando na parte inferior e as camadas mais leves na parte superior [figura 7]. A fração celular a ser separada é colocada na camada superior. A partícula irá decantar se a densidade da partícula for superior à da solução circundante. A partícula irá continuar a descer até chegar a uma posição onde a densidade da solução circundante é exatamente a mesma da densidade da partícula.

Centrifugação

Centrifugação foi introduzida em 1852 e era usada para determinar o volume de células vermelhas sanguíneas [como revisado por de Duve, 1971]. Conforme descrito anteriormente, forças centrífugas de até 16000g não possuem qualquer efeito na sobrevivência e desenvolvimento embrionário. Os lipídios (que aparecem em cores escuras) polarizam uma área dentro da zona pelúcida que ajuda o observador na quantificação dessas áreas utilizando-se um software apropriado [figura 6a].

Looney C.R., Pryor J.H., Ballard C.B., Ponchirolli-Schneider C.B., Forrest D.W. & Godke, R.A. 2008. Lipídios intracelulares nos embriões de bovinos têm um... Intracellular lipids within bovine embryos have an effect ... Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s319-s348.

Figura 7. Níveis da densidade da sacarose por empuxo em coloração estendendo-se entre 23 a 35%.

Cromatografia gasosa

Cromatografia gasosa (CG) tem sido utilizada para avaliar lipídios presentes em oócitos e embriões. O conteúdo lipídico e a composição de ácidos graxos dos oócitos bovinos imaturos frescos e maturados in vitro, cultivados em meio com ou sem soro, além de oócitos imaturos congelados-descongelados, foram analisados por CG [Kim et al., 2001]. Os pesquisadores também avaliaram a composição de ácidos graxos de oócitos bovinos, suínos e ovinos imaturos por cromatografia em fase gasosa, além de blastocisto bovinos cultivados em meio isento de soro ou suplementado com soro [McEvoy et al. 2000; Ryuichi et al. 1999]. Estudos demonstraram que a cromatografia em fase gasosa é eficaz na determinação da composição de ácidos graxos de oócitos e embriões de diferentes mamíferos, entretanto, de 4 a 100 embriões ou oócitos são necessários para determinar lipídeos utilizando esta abordagem. Um ensaio por meio de kit foi desenvolvido para determinar diferentes classes de lipídios em oócitos e embriões, quantificando triglicérides, colesterol total, fosfolipídios (fosfolipídios contendo fosfocolina) e teor de ácidos graxos não-esterificados de oócitos bovinos imaturos e maturados in vitro [Kim et al., 2001]. Com kit para ensaios lipídicos, um “pool” de 100 oócitos e embriões é usado para determinar diferentes classes de lipídios. A desvantagem para os profissionais que usam este teste seria a perda de valiosos oócitos, que seriam utilizados na produção de embriões bovinos PIV.

Colorações lipídicas específicas

Composição lipídica ultraestrutural em oócitos e embriões de suínos e bovinos pode ser avaliada utilizando colorações lipídicas específicas. Gotas lipídicas em zigotos, mórulas e blastocistos de bovinos, produzidos in vivo e in vitro, foram coradas com Sudan Black B e avaliadas por microscopia eletrônica de transmissão [Abe et al. 2002; Croseir et al., 2000; Tominaga et al., 2000]. Os pesquisadores avaliaram características morfológicas da transição da gota lipídica de oócitos suínos durante a fertilização e início do desenvolvimento embrionário de blastocistos in vivo e in vitro utilizando o corante Azul de Toluidina e microscopia eletrônica de transmissão (MET) [Kikuchi et al., 2002]. A combinação de alguns corantes e da microscopia eletrônica pode determinar o tamanho e a densidade das gotas lipídicas intracelulares em embriões. No entanto, estas técnicas não permitem a análise de todo o oócito ou embrião, porque algumas fatias embrionárias ou do oócito são perdidas durante o processo. Os pesquisadores também estão usando Vermelho do Nilo para avaliar o conteúdo lipídico de um único oócito de bovino, suíno e de murinos [Genicot et al., 2005]. O pico de fluorescência observada corresponde aos lipídios neutros, que são principalmente triglicérides. A fluorescência resultante emitida quando oócitos são marcados com Vermelho do Nilo é específica para porções lipídicas [Genicot et al., 2005]. Leroy et al. estabeleceram uma correlação entre a cor de oócito e embriões com a intensidade de fluorescência após coloração com corante Vermelho do Nilo [Leroy et al., 2005]. Oócitos e embriões escuros emitiam quantidade maior de fluorescência, quando comparados com oócitos e embriões granulados e pálidos. O estudo demonstrou ainda que mórulas cultivadas em meio suplementado com soro também emitiam um montante mais elevado do que fluorescência de embriões cultivados em meio sem soro. Em geral, corante Vermelho do Nilo é sensível o suficiente para detectar lipídios intracelulares em oócitos e embriões com resultados rápidos e precisos.

Escores de condição corporal e teste sanguíneo

Os testes utilizando escores de condição corporal dos animais (BCS) e níveis de colesterol e triglicérides anteriores à aspiração do oócito podem ser indicadores de lipídios intracelulares em oócitos e embriões. Recentemente, Ballard et al. demonstraram que a retirada de sangue de doadoras Bos indicus em grupos com BCS elevado mostraram que níveis circulantes elevados de triglicérides e colesterol estão correlacionados com o elevado teor de lipídios de oócitos M-II [Ballard et al., 2008]. As maiores concentrações circulantes de colesterol e triglicérides observadas nas doadoras resultaram de unidades com muito Vermelho do Nilo nos oócitos na fase M-II. Esses dados indicaram que oócitos M-II de doadoras Brahman tiveram mais lipídios intracelulares em comparação com as raças do tipo Inglês. Outros usos da manipulação da dieta do animal doador para alterar a criotolerância das células têm sido utilizados em sêmen de garanhões e javali [Brinsko et al., 2005 & Maldjian et al., 2005].

Morfologia embrionária visual

Tem sido demonstrado que concentrações circulantes de colesterol e triglicérides são indicadores de níveis visuais de cor em embriões de bovino [Leroy et al., 2004]. A densidade de cor de embriões da espécie suína tem sido associada com teor de porções lipídicas [Abe et al., 1999; Abe et al., 2002]. Tem sido relatado que bovinos com alto nível de colesterol e baixos níveis de triglicérides circulantes produzem embriões significativamente mais escuros comparados com doadoras que tiveram baixos níveis circulantes de colesterol e embriões com densidade menor [Leroy et al., 2005]. Estas observações, no entanto, são altamente subjetivas entre os observadores. Doadoras com elevados níveis circulantes de colesterol no momento da colheita dos embriões têm sido associados com baixas taxas de prenhez após a transferência de embriões em fase de mórula em vacas sincronizadas [Hill et al., 1998].

CRIOPRESERVAÇÃO

As técnicas de criopreservação, desde o primeiro bovino nascido em 1973 oriundo de um embrião congelado/ descongelado, apresentaram melhoras genéticas e aumento na exportação e transferência em bovinos de corte e leiteiro [Wilmut I., & Rowson LEA, 1973; AETA report 2006]. Em 2006, 126 profissionais que fizeram de transferência de embriões reportaram que aproximadamente 500.000 embriões foram transferidos ou congelados, somente nos Estados Unidos (AETA, 2006). Dos totais congelados, gado de corte teve aproximadamente 3 vezes de aumento em relação ao leiteiro e aumento de duas vezes na transferências, respectivamente, indicando uma maior demanda na produção de carne. Estes embriões exportados também aumentaram significativamente, de 3.572 (2005) para 4.936 (2006). Mesmo com todas estas melhorias, os embriões congelados geralmente produzem menores taxas de prenhez quando comparados com embriões transferidos a fresco (63,4% e 72,9%, respectivamente) [Hasler, 2001; Massip, 2001]. Índices de sobrevivência pós-descongelamento são afetados pela qualidade dos embriões, sendo que embriões de qualidade maior produzem um grande número de prenhez do que os de baixa qualidade [Looney et al., 1996] [Van Wagtendonk et al., 1995]. Já é bem documentado que transferência de embriões a fresco produz uma porcentagem entre 8,5-14 maiores nas taxas de prenhez do que embriões congelados-descongelados, devido em parte ao dano celular associado aos lipídios intracelulares [Hasler, 2001; Seidel, 2006]. O processo de criopreservação envolve a exposição às baixas temperaturas, mesmo antes da ocorrência do procedimento do congelamento, submetendo às células a um alto estresse celular resultando em interações de solutos e água, com formações estelares de cristais de água [Dobrinsky, 1996; Visintin et al., 2002; Shaw et al., 2000]. A formação de grandes cristais de gelo intracelulares é letal aos embriões durante o processo de criopreservação, e podem ser evitados osmoticamente se índices de congelamento de 1ºC/min ou menos forem obtidos [Seidel GE, comunicação pessoal]. Em contraste, se taxas de congelamento são muito lentas, membranas celulares podem ser danificadas (efeito da solução) durante rápida reidratação. Taxas de congelamento de 0,3 a 0,5/min são as mais comumente utilizadas em embriões com temperaturas entre -5 a -9°C à temperaturas ainda mais baixas de -33 a -40°C antes da utilização do nitrogênio líquido [Visintin et al., 2002]. Pequenas quantidades de água ainda permanecem na célula, uma vez que os embriões são expostos ao nitrogênio líquido, mas geralmente não há conteúdo hídrico intracelular suficiente para causar danos se os protocolos de congelamento/descongelamento forem usados corretamente.

O entendimento do balanço entre a permeabilidade da membrana celular, estágio e a idade do embrião em relação aos agentes crioprotetores e metabolismo lipídico irão facilitar bastante o método de criopreservação, beneficiando na melhora dos resultados pós-descongelamento de sobrevivência embrionária, desenvolvimento e prenhez.

Estrutura interna do embrião

Microtúbulos (tubulina) e microfilamentos (actina) são as estruturas do citoesqueleto que fornecem à célula sua capacidade de mobilidade [Dobrinsky, 1996]. Estes filamentos protéicos fornecem à célula uma forma tridimensional e estão constantemente mantendo o embrião em sua forma mais adequada, segregação cromossômica, Looney C.R., Pryor J.H., Ballard C.B., Ponchirolli-Schneider C.B., Forrest D.W. & Godke, R.A. 2008. Lipídios intracelulares nos embriões de bovinos têm um... Intracellular lipids within bovine embryos have an effect ... Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s319-s348.

transporte de organelas e movimentos intracelulares [Dobrinsky, 1996]. Fosfolipídios, colesterol e proteínas são os maiores componentes da membrana celular e, com exceção das proteínas, podem ser manipulados pela dieta animal ou por arranjos nos meios de cultivo [Seidel, 2000]. Se estas estruturas se apresentarem danificadas, a comunicação do citoesqueleto é perdida possivelmente causando crescimento lento ou retardado ou levando até a morte embrionária. Protegendo estas proteínas e organelas (ex: mitocôndria, núcleo) durante a fase de desidratação do congelamento/ vitrificação com a correta concentração de agentes crioprotetores (solutos orgânicos como etileno glicol, DMSO, glicerol) é a chave para sua sobrevivência e desenvolvimento [Dobrinsky, 2002].

Processo de congelamento lento

Desde os anos 60, técnicas de criopreservação em embriões de mamíferos bem sucedidas têm sido baseadas em dois fatores importantes: crioprotetores e índices de aquecimento [Vajta & Kuwayama 2006]. Para serem efetivos, agentes crioprotetores devem ser altamente solúveis, contendo um baixo peso molecular, com permeabilidade e sobrevivência maximizadas, além de possuir uma baixa toxicidade com o aumento nos níveis de concentração [Miyamoto H. & Ishibashi T, 1978]. Estresse osmótico, vindo de volumes flutuantes de água e crioprotetores nas células, limitam a flexibilidade da membrana plasmática celular. Dependente da composição da membrana celular e seu estado de permeabilidade, níveis de estresse osmótico podem ser diminuídos se a concentração correta de criopreservativos estiver em níveis adequados [Seidel G.E., 2006]. Outra propriedade importante das membranas celulares para a manutenção das funções normais é que elas permaneçam relativamente fluídas, do que em estado de gel [Seidel G.W., 2006; Zeron et al., 2001]. Se as células mudam para um estado de gel enquanto estão sendo submetidas às baixas temperaturas, danos celulares sob o processo de descongelamento podem ocorrer. A composição da membrana atua como importante papel nestas fases de mudanças durante o congelamento. Glicerol foi considerado como um dos primeiros crioprotetores utilizados para o congelamento de embriões bovinos, utilizando-se o protocolo pós-descongelamento em 3 passos de reidratação, em oposição ao etileno glicol, no qual é mais permeável e pode ser descongelado e transferido para recipientes sincronizados no mesmo instrumento de trabalho [Hasler et al., 1997; Pryor et al., 2007]. Dependendo dos níveis de concentração, o etileno glicol é considerado não tóxico em várias espécies de embriões de mamíferos, mas não limitados a camundongo, bovinos, ovinos e suínos [Valdez et al., 1992; Pryor et al., 2007; Cocero MJ et al., 1996; Dobrinksky et al., 2000]. Níveis de etileno glicol de até 3,6 M foram encontrados como sendo compatíveis com embriões bovinos controles não-congelados, mas a concentração padrão utilizada comumente no congelamento de embriões bovinos em laboratórios é em torno de 1,5 M [Sommerfeld & Niemann, 1999 & Pollard and Liebo 1993].

Outros fatores que afetam as taxas de prenhez incluem, mas não são limitadas por: nível de qualidade e estágio e crioprotetores utilizados durante o procedimento de criopreservação [Looney et al., 1996]. Hasler relatou um efeito da qualidade do embrião nas taxas de prenhez de embriões congelado e descongelados em glicerol e etileno glicol [Hasler J.F, 2001]. Embriões com grau de qualidade 1, 2 e 3 resultou em taxas de prenhez de 57,1, 52,9 e 32,1%, respectivamente. Além disso, embriões de vacas Holandesas congelados tanto em etileno glicol ou glicerol apresentaram baixa taxa de prenhez comparada com embriões de gado de corte. Embriões criopreservados de Bos indicus ou Bos taurus também mostraram ser diferentes quando congelados em diferentes crioprotetores [Arreseigor et al., 1998; Looney, resultados não-publicados]. Embriões coletados de doadoras de Bos indicus demonstraram uma taxa diminuída de prenhez após o processo de criopreservação em etileno glicol comparado com glicerol (15,4% e 32,9% P<0,01, respectivamente), contudo, embriões congelados de Bos indicus em glicerol e etilino glicol tiveram diminuição do que os embriões similarmente tratados de Bos taurus [Arreseigor et al., 1998]. Com as recentes mudanças feitas no etileno glicol disponível comercialmente (Bioniche, USA) diretamente transferidos pós-descongelamento, taxas de prenhez apresentaram melhoras com acréscimos de 39% (em vacas Jersey) até limites de 59% (Bos indicus) e 65% (Bos taurus), dependendo da raça [Steel & Hasler, 2004; Looney, dados não-publicados]. A baixa taxa de prenhez de embriões pós-descongelados de Bos indicus e Bos taurus é conceito característico da taxa de prenhez encontradas em bovinos Jersey e Holandes [Steel & Hasler, 2004]. Embriões congelados Jersey em glicerol e etileno glicol produziram baixa taxa de prenhez comparados com embriões Holandeses. Taxas de prenhez utilizando embriões congelados frescos com glicerol e etileno glicol foram consideradas menores em doadoras Jersey do que Holandes. Todavia, a quantidade de acúmulos de lipídios nas duas linhagens não foi avaliada, houve taxa de prenhez significantemente maior em embriões congelados-descongelados de Holandes quando comparados com embriões congelados-descongelados de doadoras Jersey. Quando se avaliou taxas de prenhez de embriões frescos transferidos e coletados de doadoras Jersey e Holandesas, não houve diferenças. Muitas observações na criopreservação de embriões entre Bos taurus e Bos indicus são baseados nas taxas de prenhez após a transferência de embriões congelados-descongelados, contudo, há pouca referência científica sobre o conteúdo intracelular entre Bos indicus e Bos taurus.

Vitrificação

A técnica de vitrificação foi primeiramente introduzida em 1985, 1986 e 2000 em embriões de camundongos, bovinos e porcos, respectivamente, e é considerada como meio alternativo para diminuir a velocidade do processo de Looney C.R., Pryor J.H., Ballard C.B., Ponchirolli-Schneider C.B., Forrest D.W. & Godke, R.A. 2008. Lipídios intracelulares nos embriões de bovinos têm um... Intracellular lipids within bovine embryos have an effect ... Acta Scientiae Veterinariae. 36(Supl. 2): s319-s348.

congelamento [Rall WF, Fahy, 1985; Massip et al.1986; Dobrinsky et al., 2000]. Esta nova técnica de criopreservação consiste em rápido congelamento sem a utilização de uma máquina de congelamento, diminuindo o potencial de danos associados com a formação de cristais de gelo, e têm muito a oferecer em relação aos oócitos crioprotegidos, embriões PIV e outros gametas com dificuldade no congelamento [Niemann, 1991; Rall WF, 1992; Sommerfeld V. & Niemann H., 1999]. Pesquisadores estão constantemente modificando os seguintes parâmetros, buscando a combinação ideal para a maximização da criosobrevivência, no qual incluem: mudança da concentração, temperatura e adição padronizada de crioprotetores, utilizando-se diferentes carreadores embrionários para auxiliar as taxas de congelamento; testando em qual estágio do desenvolvimento embrionário o embrião sobreviverá melhor e se os embriões foram produzidos in vivo ou in vitro. [Pryor, 2007, Nedambale et al. 2004; Leibo SP & Mapletoft GJ, 1998; van Wagtendonk et al. 1997; Vajta et al.,1999; Kuwayama M. 2006, Yeoman et al. 2001, Park et al. 1999, Cho et al. 2002, Dinnyes et al. 2000].

A maioria dos crioprotetores utilizados na vitrificação é consideravelmente melhorada quando comparado ao processo de congelamento lentificado. Níveis de concentração de 7,0 M de etileno glicol (suplementado com Ficoll e galactose), num período de 45 segundos, não foram deletérios para embriões bovinos PIV com taxas de desenvolvimento e eclosão de 56,4% [Pryor et al. 2007; Martinez et al., 1998]. Contudo, tempos de exposição excedendo 3,0 minutos em 8,0 M causou danos celulares [Pollard & Leibo, 1993]. Estas concentrações são mais elevadas na medida em que aumentam as taxas de congelamento e diminuem os danos pelo frio (isto é, danos nos conteúdos lipídicos intracelulares, lipídios contidos nas membranas e no citoesqueleto, passagem rápida através da faixa de temperatura de +15o _{a -5}o_{C) [Vajta G., 2000]. Entretanto, as mudanças osmóticas adicionadas aos efeitos}

tóxicos do aumento da molaridade dos crioprotetores durante o resfriamento pode frequentemente ser mais danosos do que o processo atual de vitrificação [Kuwayama et al., 1994; Dobrinksky JR., 1996]. Descobrir o equilíbrio adequado para a permeabilidade e proteção celular com poucos danos celulares continua sendo um desafio para criobiologistas desbravarem.

Em 1997 uma grande pesquisa de campo foi conduzida comparando vitrificação e congelamento lento em embriões bovinos de 7 dias in vivo [van Wagtendonk-de Leeuw et al. 1997]. Embriões foram vitrificados em palhetas de 0,25 mL, e sob aquecimento, as palhetas foram agitadas para a mistura dos crioprotetores com as colunas diluentes da sacarose antes da transferência direta em receptoras sincronizadas. Os pesquisadores demonstraram que a vitrificação poderia ser realizada sob condições do campo sem diminuir significantemente as taxas de prenhez (vitrificação: 44,5% vs. congelamento lento/glicerol/descongelamento em 3-passos de descongelamento: 45%). Recém- nascidos vivos de leitões pós-transferidos também tiveram resultados da vitrificação com ou sem delipidação [Cuello et al., 2004; Dobrinsky et al., 2000]. Este método tem melhorado as taxas de prenhez de bovinos pela modificação da fase lipídica na transição de temperatura, no qual consequentemente altera a sensibilidade ao resfriamento [Horvath and Siedel, 2006]. Recentemente, Pryor et al. demonstraram que taxas de prenhez de embriões congelados derivados de Brahman congelados in vivo podem ser melhoradas pela vitrificação, quando comparado com a transferência direta convencional [Pryor et al., 2007]. Embriões foram congelados/vitrificados utilizando-se palhetas de 0,25 mL para transferência direta de palhetas pós descongelamento/aquecimento. A facilidade desta técnica diminuiu consideravelmente o tempo pós-descongelamento/aquecimento, eliminando o uso de microscópio e transferidores rápidos.

Coleta e transferência embrionária

Todas as doadoras bovinas superovuladas foram coletadas sem cirurgia no dia 7 pós-estro. Resumidamente, as doadoras receberam CIDR e 2 mL IM do composto (50 mg progesterona + 2,5 mg Estradiol 17) no dia 0. Três dias e meio após a queda dos incrementos de FSH (Folltropina, Bioniche) foram iniciados no dia 4 com 2,5 mL de Estrumato (DVM Resources, Buda, TX. EUA) administrado duas vezes no dia 6 (intervalo de 12 horas). No dia 7, CDIR foi removido com o esperado cio (estro) após 24-36 horas. Doadoras foram selecionadas utilizando-se 2 unidades de sêmem descongelado 12-16 horas após confirmação do estro, e novamente em 20-24 horas com uma unidade de sêmem. Coletas não-cirurgicas foram realizadas pela inserção de um cateter Foley 18-20 esterilizado (PETS, Canton, TX, EUA) no corpo do útero, semeando no local por inflação do instrumento com ar e cuidadosamente infundido com solução de Ringers Lactato (DVM Resources, EUA) suplementado com 0,01% BSA (20% concentrado de BSA, Partnar, Port Huron, MI, EUA). O meio contendo os embriões foi coletado em um filtro esterilizado (PETS). O filtro contendo os embriões lavados com meio de lavagem (Bioniche, Pullman WA, EUA) e visualizados utilizando-se um esteromicroscópio de 75 X. Os embriões foram classificados seguindo os padrões da Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS) e então foram armazenados em palhetas de 0,25 mL para transferência ou preparo para o congelamento. Todos os embriões (frescos ou congelados/descongelados) foram transferidos em receptoras sincronizadas no dia 7 pós-estro (dia 0 = estro). Os embriões foram congelados em etileno glicol 1,5M como previamente citado [Pryor et al., 2007]. Rapidamente, todos os embriões foram equilibrados por 5 minutos em etileno glicol 1,5M excluído de sacarose (Freezer Vigro acrescentado de meio Bioniche), colocados em palhetas de 0,25 mL estéril (1 por palheta) e então congelados numa taxa de 0,5o_{C/min de –6}o_{C a –32}o_{C utilizando}

um controle de congelamento CL5500 (Biogenics, Napa, CA., EUA), antes de serem armazenados em LN₂.Os embriões foram descongelados por 7 segundos no ar (22ºC) e imediatamente colocados em banho-maria a 30o_{C por}

10 segundos. As palhetas foram secas, desrotuladas e imediatamente carregadas em aplicadores (“¼ cc cassou guns”) para transferência em receptoras sincronizadas.

Resultados das prenhez

Estes dados foram coletados por um período de 6 anos para Brahman e 1 ano para Angus. Um total de 2.765

No documento FACTORS AFFECTING FOLLICLE WAVE DYNAMICS and THEIR IMPACTS on FERTILITY IN BOVINE FEMALES (páginas 170-181)