MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Aspectos éticos

O presente trabalho foi submetido à apreciação do Comité de Ética em Pesquisas Médicas, do Hospital São José de Doenças Infecciosas (ANEXO IV). Como o desenho proposto era de análise retrospectiva, não foi aplicado o termo de consentimento livre e esclarecido aos pacientes fontes.

4.2. Local e população do Estudo

O estudo foi realizado no Hospital São José de Doenças Infecciosas, tendo como população fonte os pacientes em terapia antiretroviral, que apresentavam falência e preenchiam os critérios para solicitação de Genotipagem pelo programa RENAGENO, do Ministério da Saúde. A partir de março/2002, estes pacientes tiveram acesso aos testes de Genotipagem. Os exames foram coletados pelo LACEN (Laboratório Central do Estado) e interpretados com a ajuda do médico de referência em Genotipagem (MRG) deste hospital. O estudo teve desenho retrospectivo.

4.3. Critérios de inclusão e exclusão

Foram incluídos pacientes que preencheram os critérios para realização de Genotipagem pela RENAGENO, no período de abril/2002 a março/2004. Estes critérios foram estipulados pelo Ministério da Saúde para orientação sobre o uso devido destes, em vista do seu alto custo para o país, evitando a utilização inadequada deste exame.

Assim, definiu-se que, para se submeter à genotipagem pela RENAGENO, os pacientes portadores de HIV com evidências de falha terapêutica aos antiretrovirais deveriam preencher as condições descritas na

Tabela 9. Critérios para indicação de Genotipagem e condições exigidas para realização do exame pela RENAGENO.

A - Critério de Indicação do Exame

Falha * em esquema utilizando terapia dupla;

Primeira falha virológica** de esquema triplo com ITRNN (Inibidores Não Nucleosídeos da Transcriptase Reversa);

Primeira falha virológica** de esquema triplo com IP (Inibidor da Protease);

Segunda falha virológica** com esquema com IP (esquema com 3 drogas).

Observações:

1. Gestante em falha terapêutica poderá realizar o exame desde que preencha os critérios de indicação da RENAGENO.

2. Paciente com genotipagem anterior, demonstrando multiresistência, não poderá realizar outro teste.

3. Não será indicada realização do exame a pacientes em falha com esquema que contenha quatro ou mais drogas. O Ritonavir como adjuvante farmacológico não será considerado como droga ativa.

B - Condições exigidas para realização do exame de genotipagem # Paciente com boa adesão ao tratamento

Paciente apresenta-se em utilização do tratamento antiretroviral no período da coleta.

Carga Viral maior que 5.000 cópias/ml.

Última carga viral realizada no máximo 2 (dois) meses antes da data da solicitação.

# Nas UF, em que a quantidade de solicitações elegíveis ultrapassarem a quota de testes prevista, será utilizada segundo os critérios de priorização para realização da genotipagem: Carga Viral < 500.000 cópias/ml, já que valores acima destes sugerem alta probabilidade de presença de cepa selvagem e problemas de adesão terapêutica ou problemas farmacocinéticos; e tempo de falha ao tratamento < 1 ano

* falha em terapia dupla: será considerado o paciente com queda significativa de linfócitos CD4 (diminuição >25% no valor absoluto e/ou no seu valor percentual) desde que o último valor tenha sido menor que 350 células/mm3 e/ou aumento da carga viral (sempre acima de 5.000 cópias/ml) e /ou falha clínica.

** conforme definido no documento Recomendações para Terapia-Anti Retroviral em Adultos e Adolescentes Infectados pelo HIV –2004 (Aumento > 1 log na Carga Viral caracteriza falha virológica).

O período de estudo foi definido como os dois primeiros anos de utilização dos testes de Genotipagem segundo os critérios acima definidos, isto é, de abril/2002, quando foi realizado a primeira Genotipagem no Ceará pela RENAGENO, a março/2004. Neste período, 101 pacientes tiveram suas amostras de sangue coletadas para realização de Genotipagem e avaliação de resistência viral. Não foi excluído nenhum dos exames coletados, independente de idade ou resultados de exames.

As amostras sanguíneas dos pacientes foram enviadas para realização dos testes de Genotipagem em laboratório de referência da RENAGENO, que foram processadas utilizando o sistema ViroSeq da Celera

Diagnostics.

4.4. Sistema ViroSeq para realização de Genotipagem

Inicialmente, é realizada detecção da Carga Viral do paciente, utilizando o método quantitativo RNA HIV-1 LCx (Laboratório Abbott, Abbott Park, Ill.) e processando volume de 1 ml plasmático. Os limites superiores e inferiores da quantificação para amostra do volume especificado foram definidos como 1.000.000 (log 6) e 50 (1.7 log) cópias /ml respectivamente.

A Genotipagem é realizada utilizando o sistema ViroSeq. A análise começa com o isolamento do RNA HIV-1, que envolve centrifugação em alta velocidade do plasma para liberar partículas virais, lise destas com um agente caotrópico para liberação do RNA viral, e precipitação com isopropanol- etanol para recuperação do RNA. Logo após, retira-se uma alíquota de 10 microlitros do RNA resuspenso que é utilizado para transcrição reversa (65o C por 30 segundos, 42o C por 65 minutos, 99o C por 5 minutos) com TR do vírus da leucemia murina Moloney, seguido por um PCR de 40 ciclos (50o C por 10 minutos, 93o C por 12 minutos, 93o C por 20 segundos, 64o C por 45 segundos, 66º C por 3 minutos, 72º C por 10 minutos) com DNA polimerase da AmpliTaq (Empresa Applied Biosystems, Foster City, Calif.). O PCR obtem um produto com DNA de 1,8 kb e é realizado com o sistema de controle de contaminação Amperase uracil N-glicosilase para reduzir o risco de contaminação do PCR com produtos de reações de amplificações prévias, estes produtos são purificados utilizando colunas giratórias e analisados por eletroforese de agarose gel antes do sequenciamento.

O sequenciamento de DNA é realizado utilizando terminators premisturados BigDye (Empresa Applied Biosystems), reagentes sequenciadores com sete diferentes iniciadores (primers). As condições para ciclos de sequenciamento (25 ciclos) são estipuladas em 96º C por 10 segundos, 50º C por 5 segundos, e 60º C por 4 minutos. O terminator químino BigDye provê 99,91% de acurácia em 580 bases para o analisador genético ABI PRISM 3100. Dados sequenciais são, então, analisados, utilizando o sistema genotípico ViroSeq, o qual fornece dados sequenciais dos iniciadores para uma sequência contígua que poderá ser inspecionada para identificação de mutações de resistência a drogas. Sequências processadas incluem a região codificadora para aminoácidos da protease de 1 a 99 e aminoácidos TR de 1 a 335.

A análise de concordância do sequenciamento de iniciadores é feita através da comparação das sequências de nucleotídeos geradas pelo ViroSeq que são alinhadas com os iniciadores sequenciais ViroSeq B, C, F, G e H pelo método Clustal W (Madison, Wis.). Assim, identificando as concordâncias nucleotídicas entre iniciador oligonucleotídico e sequências alvo. Como os iniciadores A e D não são incluídos na sequência processada, sequências originais geradas a partir do F são alinhadas com A e D para obtenção de resultados (Eshleman et al, 2004), (FIGURA 12).

Figura12. Esquema de Genotipagem do HIV-1___

Inicialmente, o RNA do HIV-1 é resuspenso e utilizado para transcrição reversa por técnica de PCR, obtendo um produto de DNA de 1,8 kb. 1. O PCR obtem um produto com DNA de 1,8 kb, 2. Incubação do DNA amplificado para processamento, 3. Controle de amplificação, 4. PCR é realizado com o sistema de controle de contaminação Amperase uracil N-glicosilase, 5. Produtos de PCR são purificados, utilizando colunas giratórias e analisados por eletroforese de agarose gel antes do sequenciamento, 6. Sequenciamento de DNA é realizado utilizando terminators premisturados com sete diferentes primers, 7. Identificação das mutações, 8. Imagem de eletroforese das mutações, 9. Dados sequenciais são, então, analisados, utilizando o sistema genotípico ViroSeq.

Fonte: Illumina SNP Genotyping, San Diego, CA (www.illumina.com).

4.5. Avaliação do perfil de resistência aos antiretrovirais analisado pelo

Banco de dados de Stanford

Dados epidemiológicos, clínicos e laboratoriais sobre os pacientes foram coletados a partir de formulário padronizado pela RENAGENO (ANEXO