Para avaliação da ciliatofauna do Rio Atibaia foram realizadas análises qualitativas e quantitativas ao longo do período de estudo. As amostras frescas, in natura, foram analisadas em até seis horas após a coleta.
Primeiramente, foram colhidas as amostras de água superficial por meio de coletor de abertura larga; em seguida, as de sedimento tomando-se precauções para que a entrada do amostrador de Ekman não provocasse o aparecimento de ondas o que poderia acarretar ressuspensão do sedimento superficial. Os amostradores foram lavados com água destilada entre as coletas dos pontos P1 e P2.
As amostras de água superficial colhidas foram divididas em dois volumes, sendo 500 mL para análise in vivo e 250 mL fixadas em 50 mL de Bouin aquoso. Para estimar a abundância dos protozoários ciliados nas amostras de água superficial, duas análises quantitativas foram realizadas: (i) quantificação in vivo em câmara de Sedgewick-Rafter e (ii) método de impregnação quantitativa pelo protargol (QPS). A metodologia do QPS foi introduzida a partir de abril de 2013 e realizada até março de 2014 com o objetivo a recuperação de ciliados diminutos (<20 µm).
Para a análise quantitativa dos protozoários ciliados in vivo, a amostra de água superficial de cada ponto amostral foi homogeneizada de forma manual e lentamente, sendo uma sub amostra de 200 mL, colocada em um béquer, e a partir dessa, alíquotas de 1 mL foram retiradas e distribuídas na câmara de quantificação. Três leituras (contagens), de 40 campos cada, foram realizadas em em microscopia de contraste interferencial diferencial (DIC) em aumento de 200X e a média das contagens foi considerada para a determinação da abundância dos organismos por L de amostra.
Alíquotas de 10 a 20 mL (dependendo da turbidez) de água superficial dos dois pontos foram filtradas em membranas de ésteres de celulose (25 mm x 5 µm Millipore®) com o uso de sistema de filtração com bomba de vácuo e porta filtro (Millipore®). Cada amostra foi filtrada em triplicatas. As membranas receberam a inclusão de ágar aquecido e, após o resfriamento, foram preparadas para posterior passagem pelas soluções da técnica de impregnação quantitativa pelo protargol (QPS) (Fig. 3), como segue: permanganato de potássio (0,2%), ácido oxálico (2,5%), protargol (0,6%), hidroquinona (0,4%), cloreto de ouro (0,5%), tiossulfato de sódio (2,5%). Após a passagem por essas soluções, as membranas foram desidratadas em álcool isopropílico em diferentes concentrações (30%, 50% e 70%). Finalmente as membranas foram então embebidas em solução de xilol e álcool isopropílico (1:1) e, após período de secagem, foram montadas entre lâmina e lamínula com resina (Entellan).
Figura 3. Etapas da técnica de impregnação quantitativa pelo proteinato de prata (QPS): a) filtração das amostras fixadas em membrana; b) membrana após filtração; c) conservação em isopropanol a 30%; d) inclusão da membrana no ágar; e) passagem das membranas na bateria de coloração; f) montagem de lâminas permanentes.
Quanto ao sedimento, cada amostra de 500 mL colhida, foi homogeneizada manualmente e uma alíquota de 200 mL foi colocada em um béquer para promover a sedimentação do material. Após sessenta minutos, foi colhido 1 ml da interface água- sedimento e posteriormente diluído em água mineral para melhor observação e quantificação dos ciliados na câmara de Sedgewick-Rafter, de acordo com procedimento descrito por Bradley et al. (2010). Três leituras de 40 campos foram realizadas e a média das contagens, considerando o fator de diluição, foi utilizada para expressar a abundância dos ciliados por litro de amostra.
Alíquotas de cada material foram observadas in vivo em placas de Petri sob microscópio estereoscópico, onde os espécimes de protozoários ciliados foram triados com o auxílio de micropipetas de vidro e observados em lâminas sob microscopia com DIC em aumento de 400X a 1000X. Aspectos morfológicos dos ciliados in vivo foram observados e foto-documentados por meio de câmera digital científica colorida, modelo Axiocam MRC – Zeiss, acoplada ao microscópio Axio Imager.
Com o objetivo de recuperar espécies encistadas (FOISSNER, 1999; FOISSNER et al., 2002) e promover o crescimento de um maior número de espécimes para a realização das técnicas de identificação, culturas foram preparadas em placas de Petri, a partir da adição de 20 mL da amostra e de um grão de arroz, com casca e macerado, previamente autoclavado, para promover o crescimento de populações bacterianas que serviram de alimento inicial para os ciliados. A partir das culturas, os protozoários ciliados foram triados e preparados para técnicas de microscopia óptica empregada na identificação das espécies - técnica ciliatológica de impregnação pelo protargol (proteinato de prata) segundo Dieckmann (1995).
Para visualizar detalhes da morfologia externa dos ciliados, foi realizada microscopia eletrônica de varredura de acordo com Silva-Neto (2012). As preparações foram feitas com uma solução fixadora de 1 mL de glutaraldeído (12%), 2 mL de tetróxido de ósmio 2% e 1 mL de tampão cacodilato de sódio a 0,2 M. Na sequência, as etapas de desidratação e secagem pelo ponto crítico foram conduzidas de um modo diferente, colocando os organismos dentro de tubos de vidro ocos, para evitar que os organismos ficassem aderidos à parede do tubo e facilitar a recuperação dos mesmos na etapa seguinte de preparo do suporte porta amostra (stubs). Os tubos tinham cerca de 1 cm x 0,6 cm, com ambas as extremidades cobertas com malha de 25 µm. Na sequência, os stubs foram levados ao microscópio
eletrônico de varredura do Departamento de Biologia Celular da Unicamp, para a visualização.
As espécies de protozoários ciliados ocorrentes nas amostras de água superficial e sedimento foram registradas por meio de observações in vivo e de lâminas obtidas das técnicas ciliatológicas de impregnação pela prata já mencionadas, além da visualização de eletromicrografias de varredura. Para identificação dos protozoários ciliados foram realizadas micrometrias e observados aspectos detalhados do córtex, da infraciliatura e do aparelho nuclear (evidenciados pelo protargol) e as informações foram comparadas com guias de identificação (BERGER, 1999, 2006, 2011; FOISSNER et al., 1991, 1992, 1994, 1995, 2002; LYNN e SMALL, 2002), além de literatura complementar.