OOCISTOS DE CRYPTOSPORIDIUM SPP.
RESUMO
Protozoários ciliados são componentes importantes da teia alimentar em vários habitats, especialmente em ambientes aquáticos. Estes organismos são importantes bioindicadores para avaliação da qualidade ambiental. As espécies de protozoários parasitos patogênicos Giardia e Cryptosporidium representam uma preocupação significativa para a saúde humana, pois são responsáveis por inúmeros surtos em todo o mundo. A predação de cistos e oocistos por cinco espécies de protozoários ciliados a partir de amostras de água superficial colhidas do Rio Atibaia em Campinas, São Paulo, Brasil foi verificada em condições de laboratório. As espécies de protozoários ciliados foram selecionadas com base no seu modo de nutrição e somente os bacterívoros e suspensívoros foram considerados para os experimentos. As espécies Blepharisma sinuosum, Euplotes aediculatus, Oxytricha granulifera, Spirostomum minus complexo e Stentor coeruleus ingeriram cistos e oocistos, as formas de resistência de Giardia spp. e Cryptosporidium spp., respectivamente. Esta é a primeira vez que a ingestão de cistos de Giardia por protozoários ciliados é relatada. Esses achados podem contribuir para uma melhor compreensão da remoção biológica destes agentes patogênicos em ambientes aquáticos.
Palavras-chave: cistos de Giardia spp., oocistos de Cryptosporidium spp., predação, protozoários ciliados.
ABSTRACT
Ciliated protozoa are important components of the microbial food web in various habitats, especially aquatic environments. These organisms are useful bioindicators for both environmental quality assessment and the wastewater purification process. The pathogenic parasitic protozoan species Giardia and Cryptosporidium represent a significant concern for human health, being responsible for numerous disease outbreaks worldwide. The predation of cysts and oocysts in five ciliate species from water samples collected in Campinas, São Paulo, Brazil were verified under laboratory conditions. The ciliated protozoan species were selected based on their mode of nutrition, and only bacterivorous and suspension-feeders were considered for the experiments. The species Blepharisma sinuosum, Euplotes aediculatus, Oxytricha granulifera, Spirostomum minus -complex, and Stentor coeruleus ingested cysts and oocysts, the resistance forms of Giardia spp. and Cryptosporidium spp., respectively. This is the first time that the ingestion of Giardia cysts by ciliated protozoa has been reported. These findings may contribute to a better understanding of the biological removal of these pathogens from aquatic environments.
INTRODUÇÃO
Ambientes aquáticos apresentam uma grande diversidade de organismos procarióticos e eucarióticos, tais como bactérias, protistas, e micrometazoários (DÍEZ et al., 2001; SIGEE, 2005). Protozoários ciliados tem uma distribuição cosmopolita e desempenham um papel importante no processo de transferência de matéria e energia a níveis tróficos superiores nos ecossistemas aquáticos, por se alimentarem de bactérias e organismos microscópicos além de também servirem como fonte de alimento (DOPHEIDE et al., 2009; NAWROT e MIECZAN 2012, 2014).
Os protozoários ciliados comumente ocorrem como formas de vida livre (LYNN, 2008) e a estrutura das comunidades, bem como a densidade e a distribuição refletem as características físicas, químicas ebióticas de seu ambiente (ZHOU et al., 2008; BAGATINI et al. 2013; NAWROT e MIECZAN, 2014). Ao longo de sua história natural, protozoários ciliados apresentaram várias estratégias evolutivas em resposta aos microambientes (plantônicos ou bentônicos), estilo de vida (livre ou séssil) e modo de nutrição (filtradores ou carnívoros) (RADEK e HAUSMANN, 1996; HAUSMANN, 2002).
Em ambientes naturais, os protozoários ciliados predadores exibem uma grande variedade de estratégias de alimentação, tais como modificações da ciliatura oral, o que representa importante adaptação por parte desses organismos (SHERR e SHERR, 2002; SIGEE, 2005). Os ciliados filtradores usam o batimento dos cílios orais para gerar correntes de água que trazem partículas alimentares, as quais ficam retidas no aparato ciliar oral, sendo conduzidas ao citóstoma e ingeridas (FINLAY e FENCHEL, 1996).
Estes organismos são também seletivos com relação às suas presas (VERITY, 1991; STROM e LOUKOS 1998). A morfologia, mobilidade e tamanho da presa são considerados características importantes durante o processo de filtração, o que evidencia que a aquisição da presa não ocorre de maneira aleatória (VERITY, 1991). No entanto, outros estudos têm enfatizado que a preferência alimentar dos protozoários ciliados ainda é mal compreendida (MONTAGNES et al., 2008; DOPHEIDE et al., 2011).
Segundo com Fenchel (1980), protozoários ciliados discriminam partículas de acordo com seu tamanho, o que está relacionado com a morfologia da boca, e pode conduzir a seleção de bactérias ou outras partículas. Para Wilks e Sleigh (1998), a alimentação destes organismos pode ser afetada pela ampla gama de tamanhos das partículas e também por alterações nas concentrações de diferentes tipos de presas.
Giardia spp. e Cryptosporidium spp. são protozoários intestinais patogênicos encontrados em águas superficiais no mundo todo (BETANCOURT et al., 2014). Tais parasitos são uma preocupação significativa para a saúde humana, pois estima-se que eles são a principal causa dos 4 bilhões de casos de diarréia que ocorrem globalmente a cada ano (BALDURSSON e KARANIS 2011; KOTLOFF et al., 2012; SWAFFER et al., 2014). Esses organismos estão entre os parasitas entéricos mais comumente encontrados em seres humanos, entretanto apresentam uma ampla gama de hospedeiros e infectam mamíferos, aves, e répteis (HUNTER e THOMPSON, 2005).
Embora os organismos patogênicos não sejam considerados preferências alimentares de protozoários ciliados, algumas espécies dos ciliados bacterívoros podem apresentar bactérias endossimbiontes, incluindo bactérias patogênicas para os seres humanos, em seu citoplasma (BOSCARO et al., 2012). Estas bactérias não são digeridas e podem permanecer viáveis e se multiplicar dentro dos hospedeiros temporários (STOTT et al., 2003). No entanto, essa capacidade dos protozoários de vida livre de se comportarem como hospedeiros de organismos patogênicos precisa ser melhor investigada no âmbito das necessidades condições naturais (VAEREWIJCK et al., 2011).
Organismos de vida livre coexistem em sistemas naturais e artificiais (estações de tratamento de esgoto) com cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp., nos quais interações antagônicas entre estes organismos podem ocorrer por meio de promoção de uma redução na resistência e possível inactivação desses organismos patogênicos (STOTT et al., 2001, 2003; BICHAI et al. 2010; MONIS et al., 2014). A relação entre protozoários ciliados e patogênicos é intrigante e, apesar da relevância do tema, tem sido pouco estudada em todo o mundo (BOSCARO et al., 2012; MONIS et al., 2014). Há alguns relatos da ocorrência da predação de oocistos de Cryptosporidium spp. por microrganismos, contribuindo para a remoção dessas formas no esgoto (FAYER et al. 2000; STOTT et al., 2001, 2003) e na água (KING et al., 2007; MONIS et al., 2014).
Uma ampla variedade de organismos aquáticos são capazes de ingerir oocistos de Cryptosporidium, incluindo microcrustáceos (MÉNDEZ-HERMIDA et al., 2007), nematóides (HUAMANCHAY et al., 2004), rotíferos (FAYER et al., 2000; STOTT et al., 2001; KING et al., 2007), amebas (STOTT et al., 2003; KING et al., 2007) e protozoários ciliados (STOTT et al., 2001, 2003; KING et al. 2007). Mais recentemente, Monis et al. (2014) relataram que os oocistos podem ser eficazmente removidos da interface sedimento-água, especialmente quando um grande número de predadores estão presentes. Em recente pesquisa por autores deste estudo
(GREINERT-GOULART, 2013; BONATTI et al., 2014) encontramos cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. coexistindo com ciliados em sistemas combinados de tratamento de esgoto e em água superficial do Rio Atibaia. O Rio Atibaia é uma importante fonte hídrica na cidade de Campinas (Sudeste do Brasil) mas tem qualidade da água classificada como insatisfatória devido à descarga de águas residuais urbanas não tratadas (SANASA, 2015).
Vários estudos têm relatado a presença de Giardia sp. e Cryptosporidium sp. em amostras de água na Região Metropolitana de Campinas (FRANCO et al 2001;. CANTUSIO NETO et al., 2006, 2010; SATO et al., 2013). Além disso, como os protozoários ciliados têm um papel importante em teias alimentares, é relevante o conhecimento de quais espécies podem exercer predação sobre protozoários patogênicos em condições de laboratório, e se tal fato pode contribuir indiretamente para a qualidade da água sob condições naturais.
O objetivo do presente estudo foi avaliar a predação de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. por espécies de protozoários ciliados que foram altamente abundantes no Rio Atibaia. O estudo avaliou pela primeira vez a predação de cistos de Giardia sp. por protozoários ciliados.
MATERIAL E MÉTODOS
Durante o estudo, amostras de água superficial e sedimento do Rio Atibaia foram colhidas em dois pontos amostrais, a fim de verificar a diversidade de protozoários ciliados. O Rio Atibaia está localizado na cidade de Campinas, no estado de São Paulo, no sudeste do Brasil.
As amostras de água superficial foram colhidas em garrafas de plástico e as amostras de sedimento foram obtidas com uma draga Ekman (BONATTI et al., 2014). Após as coletas, as amostras foram transportadas em caixa térmica refrigerada para assegurar a sua estabilidade físico-química.
No laboratório, os protozoários ciliados foram mantidos em cultura, que foram preparadas a partir de alíquotas de 20 mL de cada tipo de amostra, colocados em uma placa de Petri com a adição de grãos de arroz integral triturados e previamente autoclavados (FOISSNER, 1992).
Os protozoários ciliados foram observados sob microscópio estereoscópico e isolados a partir de culturas com o uso de micropipetas de vidro. A fim de realizar a identificação preliminar, ciliados foram visualizados in vivo sob microscopia óptica com contraste
interferencial diferencial (DIC) em aumentos de 40× e a 100×, antes do emprego de técnica de impregnação. A identificação das morfoespécies foi feita de acordo com Foissner et al. (1991, 1992), Foissner e Berger (1996), Berger (1999, 2006) e Lynn e Small (2002).
As morfoespécie utilizadas nos experimentos para avaliar a predação dos protozoários patogênicos (cistos de Giardia e oocistos de Cryptosporidium) foram Aspidisca cicada, Blepharisma sinuosum, Epistylis plicatilis complexo, Euplotes aediculatus, Loxodes striatus, Oxytricha granulifera, Spirostomum minus complexo, Spirostomum teres, Stentor coeruleus Vorticella sp. Estes protozoários ciliados foram selecionados de acordo com os seus hábitos alimentares, tais como bacterivoros e suspensívoros os quais usam suas estruturas ciliares para a obtenção de partículas de alimentos (bactérias, algas unicelulares, e outros protozoários).
Nos experimentos de predação, 10 exemplares de cada espécie de protozoário ciliado foram isolados a partir de amostras frescas ou das culturas e mantidos durante cerca de 30 minutos em um embryo dish contendo água mineral para que pudesse ficar esse período sem alimentação.
Os anticorpos monoclonais anti-Giardia e anti-Cryptosporidium em suspensão purificada (Kit Merifluor® Meridian, Bioscience Inc.) foram utilizados para marcar os cistos e oocistos, respectivamente. Os protozoários marcados com os anticorpos foram enumerados, a fim de se obter uma suspensão concentrada que continha cerca de 14.000 oocistos/mL e 2.000 cistos/mL. Os ciliados mantidos no embryo dish foram, em seguida, colocados sobre um poço de lâmina de imunofluorescência contendo 5 µL de suspensão desses cistos e oocistos marcados. A seguir, a lâmina de imunofluorescência foi coberta com lamínula de vidro com gotas de vaselina nas quatro extremidades, para impedir a compressão dos ciliados. A lâmina com os organismos foi mantida em placa de Petri cobertas para protegê-los da exposição à luz. Após 5 minutos, a preparação foi observada sob microscopia de epi-fluorescência durante 60 minutos de exposição.
A ingestão de cistos e oocistos por espécimes de ciliados foi foto-documentada utilizando uma câmera digital colorida (modelo-Zeiss AxioCam MRC Axio Imager) acoplada a um microscópio de epi-fluorescência. O movimento e o comportamento de alimentação dos ciliados expostos aos cistos e oocistos foram observados durante todo o ensaio e a ingestão dessas formas de resistência foi registrada. O tempo máximo de exposição dos protozoários ciliados aos cistos e oocistos foi de 60 minutos.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A predação de cistos de Giardia spp. e / ou oocistos de Cryptosporidium spp. foi observada em cinco das 10 espécies testadas (50,0%), sendo estes Euplotes aediculatus, Blepharisma sinuosum, Oxytricha granulifera, Spirostomum minus complexo, Stentor coeruleus e Vorticella sp. (Fig. 1 e Fig. 2). No presente estudo foram testados ciliados que ainda não tinham sido avaliados para a predação de cistos e oocistos em estudos anteriores. A ingestão de cistos de Giardia por cinco morfoespécies de ciliados protozoários foi registrado pela primeira vez. Espécimes de B. sinuosum, E. aediculatus, O. granulifera e S. coeruleus ingeriram cistos de Giardia spp. e a maioria se alimentou com os cistos no prazo de 30 minutos de exposição (Tab. 1). Um espécime de E. aediculatus ingeriu cistos de Giardia spp. depois de 20 minutos de exposição à suspensão de cistos e oocistos, durante um intervalo de tempo entre 6 a 40 minutos. Três espécimes de O. granulifera ingeriram cistos e/ou oocistos após 40 minutos de observação.
Estudos conduzidos por Stott et al. (2001, 2003) e King et al. (2007) documentaram a ingestão de oocistos de Cryptosporidium spp. por Blepharisma sp., Euplotes sp., Euplotes patella, Holosticha sp., Paramecium sp., Paramecium caudatum, Oxytricha sp., e Stylonynchia mytillus. Embora os ciliados Aspidisca cicada, Blepharisma sinuosum, Epistylis plicatilis complexo, Loxodes striatus, Oxytricha granulifera e Spirostomum teres terem tocado e arrastado cistos e oocistos durante o movimento da ciliatura somática e oral, não houve ingestão dessas formas pelos protozoários ciliados. De acordo com Fayer et al. (2000), alguns ciliados podem selecionar seus alimentos pelo tamanho e em geral, apenas ingerir partículas dentro de uma determinada variação de tamanho.
Os ciliados hipotrichios E. aediculatus e O. granulifera apresentam grandes cavidades orais e zona adoral de membranelas proeminentes, localizada no lado ventral. Esta estrutura oral proporciona a esses ciliados a capacidade de gerar correntes de água que impulsionam as partículas orgânicas e bactérias para a cavidade oral. Estudos anteriores demonstraram que tais ciliados provavelmente são onívoros uma vez que eles se alimentam de bactérias, diatomáceas, dinoflagelados, crisófitas, criptofíceas e clorofíceas (LYNN, 2008).
Os resultados do presente estudo mostram que A. cicada, E. plicatilis complexo, L. striatus, S. minus complexo, S. teres e V. convallaria não predaram cistos de Giardia spp. (Tab. 1). A maioria das espécies ingeriu mais oocistos que cistos, possivelmente devido à sua menor dimensão (3 a 6 µm), uma vez que cistos de Giardia spp. medem entre 8 a 12 µm.
Figura 1. Fotodocumentação do experimento de predação: a. Cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium sp. presentes nas suspensões purificadas; b- c: Euplotes aediculatus contendo oocistos ingeridos; d: Oxytricha granulifera visualizada em DIC; e: O. granulifera contendo oocisto ingerido (seta); f: Spirostomum minus Complexo visualizado com imunofluorescência após predar oocistos (seta). Barras = 10 μm.
Figura 2. Stentor coeruleus durante o experimento de predação. a: organismo observado em microscopia diferencial de contraste de interferência (DIC); b: organismo observado em microscopia de epifluorescência contendo oocistos de Cryptosporidium spp. (seta), após predação; c: espécime observado após predação de cistos de Giardia spp. (seta) Barras = 20 µm.
Tabela 1. Predação de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. por diferentes morfoespécies de protozoários ciliados após 60 min de exposição a suspensão contendo cistos e oocistos marcados.
Taxon Predação de cistos Tempo para a predação (min.) Predação de oocistos Tempo para a predação (min.) Aspidisca cicada - NA - NA Blepharisma sinuosum + (n = 1) 30 - NA
Epistylis plicatilis complexo - NA - NA
Euplotes aediculatus + (n = 4) 20 +(n = 4) 6 - 40
Loxodes striatus - NA - NA
Oxytricha granulifera + (n =2) 40 + (n=3) 40
Spirostomum minus complexo - 24 + (n= 7) 24
Spirostomum teres - NA - NA
Stentor coeruleus + (n = 4) 30 + (n = 4) 30
Vorticella sp. - NA - NA
+: Ocorrência de predação; -: Não ocorrência de predação; n = número de organismos nos quais se
observou predação; NA: Não aplicável.
Heterotríqueos e espitotríqueos podem ter policinécias orais conspícuas no lado esquerdo do peristômio (LYNN, 2008). Os heterotrichios, B. sinuosum e S. coeruleus, são ciliados onívoros e se alimentam de bactérias, microalgas e outros protozoários, incluindo outros ciliados.
Stott et al. (2001) constataram que os protozoários ciliados ingeriram oocistos de Cryptosporidium parvum de forma eficaz. Estes autores demonstraram que as maiores taxas de ingestão foram observadas com P. caudatum e S. mytilus, que preferencialmente se alimentam de partículas suspensas associadas com flocos biológicos superficiais, respectivamente. Seus resultados indicam ainda que a predação por protozoários ciliados pode ser um importante fator de contribuição para a remoção de oocistos presentes no esgoto.
A remoção e inativação das formas de resistência de protozoários patogênicos de águas residuais tem ganhado importância crescente devido à contaminação de corpos d'água por efluentes de esgoto (MONIS et al. 2014). Estudos anteriores de Fayer et al. (2000), Stott et al.
(2003) e King et al. (2007) observaram aglomerados de oocistos em bolus após a sua excreção por rotíferos. Em um corpo de água ou em estações de tratamento de esgoto estes agrupamentos têm importância epidemiológica, porque eles sedimentam mais rápido e estão sujeitos a remoção uma vez que se comportam como as partículas maiores (BROOKES et al., 2004). No entanto, o destino de oocistos ingeridos por protozoários ciliados não é conhecido. De acordo com King et al. (2007), a ingestão de oocistos Cryptosporidium spp. por algumas espécies de predadores resulta em sua degradação nos vacúolos digestivos. No entanto, organismos patogênicos de veiculação hídrica, tais como Cryptosporidium spp. são capazes de manter a sua viabilidade dentro algumas espécies de amebas e protozoários ciliados (BICHAI et al. 2008). Mais estudos são necessários para verificar a infectividade de oocistos mantidos dentro vacúolos alimentares de protozoários ciliados (KING et al., 2007).
O presente estudo relatou a predação de cistos de Giardia spp. por protozoários ciliados, pela primeira vez e, em adição, aumentou o conhecimento do número de espécies que são capazes de remover os oocistos. A predação também pode ter implicações para remoção biológica em sistemas simplificados de tratamento de água de esgoto em pequenas comunidades, melhorando a qualidade do abastecimento de água e efluente tratado.
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