UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA
TAÍS RONDELLO BONATTI
Caracterização molecular das espécies de Giardia spp. e Cryptosporidium spp. e levantamento das espécies de protozoários de vida livre presentes em amostras de água superficial e do
sedimento do Rio Atibaia, Campinas, São Paulo.
CAMPINAS 2016
TAÍS RONDELLO BONATTI
Caracterização molecular das espécies de Giardia spp. e Cryptosporidium spp. e levantamento das espécies de protozoários de vida livre presentes em amostras de água
superficial e do sedimento do Rio Atibaia, Campinas, São Paulo.
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Biologia Animal na área de Relações Antrópicas, Meio Ambiente e Parasitologia.
ORIENTADORA: Profa. Dra. Regina Maura Bueno Franco CO-ORIENTADORA: Dra. Isabel Cristina Vidal Siqueira-Castro
CAMPINAS 2016 ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA TESE DE DOUTORADO DEFENDIDA PELA ALUNA TAÍS RONDELLO BONATTI E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. REGINA MAURA BUENO FRANCO.
Campinas, 21 de outubro de 2016.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Regina Maura Bueno Franco (Orientadora) Prof. Dr. Marcelo Vasconcelos Meireles
Profa. Dra. Semíramis Guimarães Ferraz Viana Profa. Dra. Gisela Umbuzeiro
Prof. Dr. Danilo Ciccone Miguel Profa. Dra. Lyda Patrícia Sabogal Paz Profa. Dra. Selma Giorgio
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico este trabalho aos meus pais,
AGRADECIMENTOS Agradeço à Deus;
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo financiamento do projeto (processo número 2011/50244-8);
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de estudos.
À minha família pelo apoio e preocupação;
Agradeço à minha irmã e principalmente aos meus pais que sempre me motivaram, entenderam as minhas faltas e momentos de afastamento e reclusão e me mostraram a importância do estudo;
Desejo agradecer especialmente à minha orientadora Profa. Dra. Regina Maura Bueno Franco por me orientar desde a iniciação científica, pela disponibilidade, confiança, atenção, paciência, dedicação e profissionalismo em todos esses anos;
À minha co-orientadora Dra. Isabel, pela infinita paciência, apoio, disponibilidade e por todos os ensinamentos sobre o maravilhoso mundo dos protozoários ciliados;
A todos os docentes e funcionários do departamento de Biologia Animal;
Ao Dr. Maurício Durigan pelo auxílio no início do trabalho no laboratório de Biologia Molecular;
Ao biólogo Nilson Branco pelo apoio durante a realização do trabalho;
Ao Dr. Vagner Fiuza pela imensa ajuda com os ensaios moleculares, pelo apoio e amizade;
A amiga Liane Nakada pela ajuda com os testes estatísticos;
Ao querido amigo Prof. Dr. Diego Averaldo Guiguet Leal pelo apoio e amizade; À querida amiga Klélia Carvalho pelo incentivo;
Ao Caio pelo apoio nos meus piores e melhores momentos;
Aos amigos do laboratório e do departamento Ana Rita Nardi, Carolina Ortiz Pineda, Clarisse Boni, Juliane Araújo, Meylin Batista, Sandra Yamashiro, Suellen Zatti, Vanessa Perdigão, por todo apoio e momentos que tornaram mais leve a caminhada do doutorado.
RESUMO
O conhecimento acerca da biodiversidade de protozoários ciliados e dos patogênicos pode permitir inferências sobre o grau de contaminação de um corpo hídrico assim como as possíveis fontes que levam a ela e, portanto, contribuir para o monitoramento da qualidade da água. O presente estudo teve como objetivo avaliar a qualidade da água e do sedimento de dois pontos próximos à captação de água para abastecimento público do Rio Atibaia (Campinas, SP) por meio da caracterização morfológica de comunidades biológicas de protozoários ciliados e de patogênicos (Giardia spp. e Cryptosporidium spp.). Amostras de água e sedimento de dois pontos do Rio Atibaia (P1 e P2), foram colhidas mensalmente durante 24 meses. Para o estudo da ciliatofauna foram realizadas análises qualitativa (observação in vivo e após impregnação pela prata) e quantitativa (enumeração in vivo e impregnação quantitativa pela protargol - QPS). Para a pesquisa e caracterização de Giardia spp. e Cryptosporidium spp. foram empregadas metodologias específicas para detecção de cistos e oocistos nos diferentes tipos de amostra e purificação por separação imunomagnética (IMS). Para a caracterização molecular dos cistos de Giardia spp. e oocistos Cryptosporidium spp. isolados das amostras da água e do sedimento do rio Atibaia, as alíquotas purificadas por IMS e positivas na leitura por imunofluorescência, foram submetidas a extração do DNA e posterior nested PCR. Para os protozoários ciliados, 73 táxons pertencentes a 53 gêneros foram identificados em amostras de água superficial e de sedimentos. O número de morfoespécies registradas no P2, tanto na água quanto no sedimento foi maior o que sugere que a riqueza pode estar sendo influenciada pela qualidade da água nesse ponto. Nas amostras de água bruta superficial, os cistos de Giardia spp. foram detectados em 62,5 % delas e, oocistos de Cryptosporidium spp., em 25,0 %. Considerando as amostras de sedimento, os cistos de Giardia spp. foram detectados em 35,4% delas enquanto a positividade para oocistos de Cryptosporidium spp. foi de 16,6 %. Um total de 57 amostras positivas para Giardia sp. foram submetidas ao sequenciamento. A maioria das amostras foi caracterizada como sub-genótipo AII o que evidencia o caráter humano da contaminação por esgoto das águas do Rio Atibaia, e ressalta o grau de impactação de tal corpo hídrico. Não foi amplificado o DNA das amostras positivas para Cryptosporidium spp. confirmadas pela imunofluorescência, devido à presença de inibidores nas amostras analisadas. Paralelamente, a predação de cistos e oocistos por cinco espécies de protozoários ciliados a partir de amostras de água superficial colhidas do Rio Atibaia foi verificada em condições de laboratório. As espécies Blepharisma sinuosum, Euplotes aediculatus, Oxytricha granulifera, Spirostomum minus complexo e Stentor coeruleus ingeriram
cistos e oocistos. Esses achados relacionados a predação podem contribuir para uma melhor compreensão da remoção biológica destes agentes patogênicos em ambientes aquáticos.
Palavras-chaves: cistos de Giardia spp., oocistos de Cryptosporidium spp., protozoários ciliados, água superficial, sedimento.
ABSTRACT
The knowledge of the biodiversity of ciliated protozoa and pathogens may allow inferences about the degree of contamination of a water body as well as possible sources that lead to it and thus contribute to the monitoring of water quality. This study aimed to evaluate the quality of water and sediment from two points near the water catchment for public supply of Atibaia River (P1 and P2) through the morphological characterization of biological communities of ciliated and pathogenic protozoa (Giardia spp. and Cryptosporidium spp.). Water and sediment samples from two points of Atibaia River, Campinas, SP, were collected monthly for 24 months. For ciliated protozoa study, it was conducted conducted qualitative analysis (in vivo observation and silver impregnation) and quantitative (in vivo enumeration and quantitative protargol staining - QPS). For research and characterization of Giardia spp. and Cryptosporidium spp. specific methods for detection of cysts and oocysts in different sample types and purification of the pathogenic protozoan were employed such as immunomagnetic separation. The molecular characterization of Giardia spp. cysts and Cryptosporidium spp. oocysts isolated from samples of water and sediment from the Atibaia river, aliquots purified by IMS and positive by immunofluorescence, were subjected to DNA extraction and subsequent nested PCR. For ciliate protozoa, 73 taxa belonging to 53 genera were identified in samples of surface water and sediment. The number and frequency of detected ciliate species in water and sediment samples were higher in 2. The number of registered morphospecies at P2, both in water and sediment was higher, suggesting that at this point, richness can be influenced by the water quality. For surface water samples, Giardia spp. was detected in 62.5% of them while Cryptosporidium spp. in 25.0%. Considering the sediment samples, Giardia spp. was detected in 35.4% of them while Cryptosporidium spp. the positivity was 16.6%. A total of 57 samples positive for Giardia was subjected to sequencing. Most of the samples was characterized as sub-genotype AII which highlights the human origin of the sewage contamination of the Atibaia River and highlights the impact degree of such water body. The DNA from Cryptosporidium spp. was not amplified even though samples were positive by immunofluorescence. This may have occurred due to the presence of inhibitors in the samples. At the same time, predation of cysts and oocysts by five species of ciliated protozoa from surface water samples taken from the Atibaia River in Campinas, São Paulo, Brazil was tested in laboratory conditions. The species Blepharisma sinuosum, Euplotes aediculatus, Oxytricha granulifera, Spirostomum minus Complex and Stentor coeruleus ingested cysts and oocysts. These findings related to predation can contribute to a better understanding of biological removal of these pathogens in aquatic environments.
Key words: Giardia spp. cysts, Cryptosporidium spp. oocysts, ciliated protozoa, surface water, sediment.
LISTA DE FIGURAS PG Material e Métodos... 50 Figura 1. Localização dos pontos de amostragem (P1 e P2) no Rio Atibaia, Campinas, São Paulo (22o54´42.42´´S e 46o57´33.87´´O) ... 50 Figura 2. Coleta de amostras de sedimento por meio de amostrador de Ekman; a) evidência da coluna sedimentar colhida; b) interface água-sedimento preservada. ... 51 Figura 3. Etapas da técnica de impregnação quantitativa pelo proteinato de prata (QPS): a) filtração das amostras fixadas em membrana; b) membrana após filtração; c) conservação em isopropanol a 30%; d) inclusão da membrana no ágar; e) passagem das membranas na bateria de coloração; f) montagem de lâminas permanentes. ... 60 Capítulo I - Checklist de protozoários ciliados encontrados em amostras de água superficial e sedimento do Rio Atibaia, Campinas, São Paulo. ... 67 Figura 1. Local da coleta de amostras: a) Brasil; b) Região Metropolitana de Campinas e coordenadas geográficas dos pontos de coleta no Rio Atibaia. ... 70 Figura 2. Protozoários ciliados encontrados em amostras de água superficial e sedimento do Rio Atibaia, Campinas, São Paulo. Organismos in vivo (a; c; e; f; i; j; k; l; m; o; p); Impregnados pelo protargol (b; d; g; n) e eletromicrogafia (h). a-b: Acineria uncinata; c-d: Aspidisca cicada; e: Brachonella spiralis; f-h: Blepharisma sinuosum; i: Campanella umbellaria; j: Caenomorpha sp.; k: Cinetochilum margaritaceum; l: Chilodonella uncinata; m-n: Coleps hirtus; o: Colpidium colpoda; p: Cyclidium glaucoma. Barras = 10 μm. ... 73 Figura 3. Protozoários ciliados encontrados em amostras de água superficial e sedimento do Rio Atibaia, Campinas, São Paulo. Organismos in vivo (a; b; e; g; I; j; k; m; n; q; r; s; t); Impregnados pelo protargol (c; f; h; l; o; u) e eletromicrografias (d; p). a: Frontonia leucas; b-d: Gastrostyla setifera; e-f: Glaucoma frontata; g-h: Halteria grandinella; i: Holophrya sp.; j: Lagynus elegans; k-l: Lembadion lucens; m: Litonotus sp.; n-p: Loxodes striatus; q: Metopus sp.; r: Microthorax pusillus; s: Metacineta sp.; t-u: Stentor coeruleus. Barras = 10 μm. ... 74
Capítulo II - Relação entre protozoários patogênicos (Giardia spp. e Cryptosporidium spp.) e protozoários ciliados (Ciliophora) na avaliação de dois pontos de um corpo hídrico em área endêmica. ... ... 91 Figura 1. Localização dos pontos de amostragem (P1 e P2) no Rio Atibaia, Campinas, São Paulo (22o54´42.42´´S e 46o57´33.87´´O). ... 95 Figura 2. Relações filogenéticas entre isolados de Giardia duodenalis obtidas por meio do alinhamento de 511 nucleotídeos da região codificante do gene β-giardina com o emprego de máxima verossimilhança utilizando o modelo Tamura-Nei e distribuição Gamma... 106 Figura 3. Protozoários ciliados ocorrentes nas amostras de água e sedimento do Rio Atibaia. Organismos in vivo (a; c; e; f; g; j; k; l; m; n; p; q), impregnados pelo Protargol (b; d; h; o) e eletromicrografia (i). a-b: Acineria uncinata; c-d: Aspidisca cicada; e: Brachonella spiralis; f: Campanella umbellaria; g-i: Blepharisma sinuosum; j: Caenomorpha sp.; k: Chilodonella uncinata; l: Cinetochilium margaritaceum; m: Cyclidium glaucoma; n-o: Coleps hirtus; p: Colpidium campylum; q: Colpidium colpoda. Barra = 10 µm. ... 110 Figura 4. Fotomicrografias de protozoários ciliados ocorrentes nas amostras de água e sedimento do Rio Atibaia. Organismos in vivo (a; b; d; m; o), impregnados pelo Protargol (c; e; j; l; n; p), por Prata à Seco (f; g) e eletromicrografias (h; i; l). a: Carchesium polypinum; b-c: Epistylis plicatilis Complexo; d-i. Euplotes aediculatus; j-l: Euplotes woodroffi; m: Euplotes eurystomus; n-o: Euplotes sp1.Barra = 20 µm. ... 111 Figura 5. Fotomicrografias de protozoários ciliados ocorrentes nas amostras de água e sedimento do Rio Atibaia. Organismos in vivo (a; b; e; g; i; k; l; m; q; s; t); ao Protargol (c; f; h; j; o; r). a: Frontonia leucas, b-d: Gastrostyla setifera, e-f: Glaucoma scintilans, g-h: Glaucoma frontata; i-j: Halteria grandinella; k: Holophrya sp, l: Lagynus elegans, m: Litonotus sp.; n-p: Loxodes striatus; q-r: Lembadion lucens, s: Metopus sp.; t: Metacineta sp. Barras: 10 µm (i; j; l; m; n; o; p; q; r; s; t) e 50 µm. ... 112 Figura 6. Fotomicrografias de protozoários ciliados ocorrentes nas amostras de água e sedimento do Rio Atibaia. Organismos in vivo (a; c; e; g; i; k; m), impregnados ao Protargol (b; d; f; h; j; l; n) e eletromicrografias (j; l; o). a: Microthorax pusillus; b-c: Oxytricha granulifera; d-e: Paramecium aurelia Complexo; f-g: Paramecium caudatum; h-j:
Pleurotricha lanceolata;; l-m: Spirostomum teres; n-p: Pseudourostyla nova; q: Pseudovorticella sp.; n-o. Barras: 10 µm (a; b; c; e;f; h; i; j; k; l) e 50 µm (d; g; m; n; o; p; q).... 113 Figura 7. Fotomicrografias de protozoários ciliados ocorrentes nas amostras de água e sedimento do Rio Atibaia. Organismos in vivo (a; d; g; h; l; n), impregnados pelo Protargol (b; e; f; i; j; m; o) e eletromicrografia (c). a-c: Spirostomum minus; d-f: Stentor coeruleus; g: Tetrahymena pyriformis; h-i: Strobilidium caudatum; j: Sterkiella histriomuscorum Complexo; l-m: Stylonychia bifaria; n-o: Tetmemena pustulata. Barras = 10 µm (g; l; m; n; o), 20 µm (e; f; h; i; j) e 50 µm (a; b; c; d). ... 114 Figura 8. Fotomicrografias de protozoários ciliados ocorrentes nas amostras de água e sedimento do Rio Atibaia. Organismos in vivo (a; c; e-h), impregnados pelo Protargol (b; d) e eletromicrografia (f). a-b: Trithigmostoma cucullulus; c-d: Urocentrum turbo, e: Vorticella convalaria; f-i: Vorticella spp. Barras = 20 µm. ... 115 Figura 9. Abundância média de protozoários ciliados registrados em amostras de água superficial (AS) em dois pontos de coleta (P1 e P2) no Rio Atibaia, Campinas, SP, ao longo de 24 meses. ... ... 117 Figura 10. Abundância média de protozoários ciliados registrados em amostras de sedimento (SD) em dois pontos de coleta (P1 e P2) no Rio Atibaia, Campinas, SP, ao longo de 24 meses. 118 Capítulo III - Primeiro relato da predação de cistos de Giardia sp. por protozoários ciliados e confirmação da predação de oocistos de Cryptosporidium spp. ... 149 Figura 1. Fotodocumentação do experimento de predação: a. Cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium sp.; b-c: Euplotes aediculatus contendo oocistos ingeridos; d: Oxytricha granulifera visualizada em DIC; e: O. granulifera contendo oocisto ingerido (seta); f: Spirostomum minus Complexo visualizado com imunofluorescência após predar oocistos (seta). Barras = 10 μm. ... 156 Figura 2. Stentor coeruleus durante o experimento de predação. a: organismo observado em microscopia diferencial de contraste de interferência (DIC); b: organismo observado em microscopia de epifluorescência contendo oocistos de Cryptosporidium spp. (seta), após predação; c: espécime observado após predação de cistos de Giardia spp. (seta) Barras = 20 µm. ... 157
LISTA DE TABELAS PG Revisão da Literatura
Tabela 1. Espécies e genótipos reconhecidos de Giardia e a distribuição dos hospedeiros. .... 24 Tabela 2. Genes mais comumente usados para a caracterização molecular de Giardia. ... 25 Tabela 3. Espécies válidas de Cryptosporidium spp. e os principais hospedeiros. ... 30 Tabela 4. Sumário dos principais genes alvos usados para a detecção e identificação das espécies / genótipos de Cryptosporidium. ... 33 Tabela 5. Estudos que relataram a presença cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. em amostras de água superficial no Estado de São Paulo. ... 39 Tabela 6. Classificação do corpo hídrico de acordo com o sistema sapróbrio. ... 44
Material e Métodos
Tabela 7. Condições da nested PCR para a amplificação de fragmentos de genes de Giardia sp. ... ... 55 Tabela 8. Sequências de referência utilizadas para o estudo molecular dos genes beta-giardina e 16S rRNA obtidas do GenBank. ... 56 Tabela 9. Condições da nested PCR para a amplificação de fragmentos do gene 18S SSU rRNA de Cryptosporidium sp. ... 58 Tabela 10. Classes de tamanho dos protozoários ciliados. ... 65 Capítulo I - Checklist de protozoários ciliados encontrados em amostras de água superficial e sedimento do Rio Atibaia, Campinas, São Paulo. ... 67 Tabela 1. Lista das morfoespécies de protozoários ciliados (Filo Ciliophora) encontradas nas amostras de água superficial colhidas dos pontos 1 (P1) e 2 (P2) do Rio Atibaia, Campinas, São Paulo. ... 75
Tabela 2. Lista das morfoespécies de protozoários ciliados (Filo Ciliophora) encontradas nas amostras de sedimento colhidas dos pontos 1 (P1) e 2 (P2) do Rio Atibaia, Campinas, São Paulo. ... 78 Tabela 3. Lista das espécies de protozoários ciliados encontrados no Rio Atibaia de acordo com a saprobidade. ... 83 Capítulo II - Relação entre protozoários patogênicos (Giardia spp. e Cryptosporidium spp.) e protozoários ciliados (Ciliophora) na avaliação de dois pontos de um corpo hídrico em área endêmica. ... 91 Tabela 1. Classes de tamanhos dos protozoários ciliados. ... 100 Tabela 2. Média e variação dos parâmetros físicos e químicos para amostras de água e sedimento do Rio Atibaia, Campinas. SP. ... 101 Tabela 3. Positividade para protozoários patogênicos (Giardia spp. e Cryptosporidium spp.), media do número de cistos e oocistos / L, valores mínimos e máximos em amostras de sedimento (SD) e água superficial (AS) em dois pontos de coleta do Rio Atibaia, Campinas, SP, de março de 2012 a abril de 2014. ... 103 Tabela 4. Resultados da nested-PCR com amplificação de fragmento do gene beta-giardina e 16S rRNA e da Reação de Imunofluorescência Direta empregando anticorpos monoclonais anti-Giardia para amostras de água bruta superficial e sedimento do Rio Atibaia, de março de 2012 a abril de 2014.
104
Tabela 5. Distribuição dos táxons (quatro níveis taxonômicos) de protozoários ciliados registrados nos pontos de coleta (P1 e P2) em amostras de água superficial (AS) e sedimento (SD) n Rio Atibaia, Campinas, SP. ... 107 Tabela 6. Frequência (%) das morfoespécies, fonte de alimentação e índice sapróbico dos ciliados encontrado em amostras de água superficial (AS) e sedimento (SD) dos pontos P1 e P2 do Rio Atibaia, Campinas, São Paulo. ... 108
Tabela 7. As morfoespécies de protozoários ciliados mais frequentes (%) encontradas em amostras de água superficial (AS) e sedimento (SD) nos pontos P1 e P2 do Rio Atibaia, Campinas, SP. ... 116
Tabela 8. Protozoários ciliados detectados em amostras de água nos pontos P1 e P2 por meio da quantificação in vivo e pelo QPS em 24 meses de coleta no Rio Atibaia, Campinas, SP. .... 120
Tabela 9. Correlações de Spearman entre os parâmetros físicos e químicos, protozoários patogênicos e ciliados para amostras de água superficial. ... 123 Tabela 10. Correlações de Spearman entre os parâmetros físicos e químicos, protozoários patogênicos e ciliados para amostras de sedimento. ... 124 Tabela 11. Índices de diversidade de Shannon, equitabilidade e dominância de Berger-Parker. ... ... 125 Capítulo III - Primeiro relato da predação de cistos de Giardia sp. por protozoários ciliados e confirmação da predação de oocistos de Cryptosporidium spp. ... 149 Tabela 1. Predação de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. por diferentes morfoespécies de protozoários ciliados após 60 min de exposição a suspensão contendo cistos e oocistos marcados. ... 158
SUMÁRIO Introdução ... 19 Revisão da Literatura ... 23 1. Protozoários patogênicos ... 23 1.1. Gênero Giardia ... 23 1.2. Gênero Cryptosporidium ... 27
2. Contaminação de mananciais para abastecimento humano e surtos de veiculação hídrica causados por Giardia spp. e Cryptosporidium spp. ... 34
3. Detecção e ocorrência dos protozoários patogênicos em água e sedimento ... 37
4. Protozoários ciliados ... 41
5. Rio Atibaia ... 46
6. Questões sobre as condições climáticas atuais e escassez hídrica ... 47
Objetivos ... 49
Material e Métodos ... 50
1. Local de estudo e coleta ... 50
2. Análises físicas e químicas ... 51
3. Metodologia de pesquisa de Giardia spp. e de Cryptosporidium spp. ... 52
3.1. Pesquisa dos protozoários patogênicos em água superficial ... 52
3.2. Pesquisa dos protozoários patogênicos no sedimento ... 52
3.3. Purificação dos protozoários patogênicos por Separação Imunomagnética (IMS) ... 53
3.4. Visualização dos protozoários patogênicos nas amostras concentradas de água superficial e de sedimento ... 53
3.5. Caracterização molecular de Giardia spp. e Cryptosporidium spp. ... 53
3.5.1. Estudo molecular de Giardia spp. ... 54
4. Metodologia de Estudo da Ciliatofauna ... 59
5. Teste experimental de predação ... 62
6. Análises Estatísticas ... 63
Resultados ... 66
Capítulo I - Checklist de protozoários ciliados encontrados em amostras de água superficial e sedimento do Rio Atibaia, Campinas, São Paulo. ... 67
Capítulo II - Relação entre protozoários patogênicos (Giardia spp. e Cryptosporidium spp.) e protozoários ciliados (Ciliophora) na avaliação de dois pontos de um corpo hídrico em área endêmica. ... 91
Capítulo III - Primeiro relato da predação de cistos de Giardia sp. por protozoários ciliados e confirmação da predação de oocistos de Cryptosporidium spp. ... 149
Discussão Geral ... 164
Conclusões ... 168
Referências Bibliográficas ... 169
Anexo ... 190
INTRODUÇÃO
O acesso à água potável é essencial para a saúde, um direito humano básico e um componente eficaz para a proteção da saúde, fundamental na erradicação da fome e da injustiça social (OMS, 2011).
A água para consumo humano é captada de águas superficiais e de aquíferos subterrâneos e, após seu uso, geralmente é retornada a esses corpos hídricos (AJEAGAH, 2013; OMS, 2014). Aproximadamente 780 milhões de pessoas em todo o mundo, a maioria de países em desenvolvimento, não têm acesso a uma fonte de água potável (OMS / UNICEF, 2012). A contaminação da água é uma questão de muita relevância, pois trata-se ainda da principal fonte de patógenos de veiculação hídrica nos países desenvolvidos e em desenvolvimento, os quais podem causar mortalidade como ilustrado em vários surtos já registrados anteriormente, como os de Milwaukee, em 1993, e Las Vegas, em 1994 (KARANIS et al., 2007; CHALMERS, 2012; OMS, 2014; SAMENDRA et al., 2014).
Segundo a Organização Mundial de Saúde, a diarreia acarreta 10,5% de aproximadamente 8 milhões de mortes anuais de crianças com menos de cinco anos de idade (para comparação, a malária causa 7,0% dessas mortes e HIV / AIDS, apenas 2,0%) (LIU et al., 2012). O uso de água contaminada continua a ser uma questão premente no desenvolvimento dos países uma vez que cerca de 1,8 bilhões de pessoas utilizam, ao redor do mundo, uma fonte de água potável que recebe contaminação fecal e 187 milhões de pessoas ainda dependem da água superficial não tratada (OMS / UNICEF, 2012; BAIN et al., 2014).
No Brasil, o tratamento de esgoto chega a apenas 39,0%, mais de 35 milhões de brasileiros não tem acesso ao abastecimento de água tratada e mais da metade da população não conta com rede de coleta de esgoto (SNIS, 2016; TRATA BRASIL, 2016). De acordo com a Divisão de Doenças de Transmissão Hídrica e Alimentar (Centro de Vigilância Epidemiológica, Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo), foram registrados 315 mil casos de doença diarreica aguda no Estado de São Paulo em 2014, o que corresponde a uma média de 863 casos por dia.
Tais registros ressaltam o agravo desse cenário frente à crise hídrica enfrentada desde 2012 na qual diferentes municípios do Brasil têm experimentado reduções da pluviosidade, delineando um quadro complexo de escassez hídrica. Esse fenômeno climático tem causado grandes impactos na oferta de água para o abastecimento público e outros usos, como irrigação e geração de energia elétrica (ANA, 2014; JACOBI et al., 2015). As chuvas abaixo da média
contribuem para o agravamento da oferta de água em bacias hidrográficas caracterizadas como críticas, em razão da baixa disponibilidade hídrica qualitativa e/ou quantitativa. A Agência Nacional de Águas (ANA) destaca que alguns municípios da região Nordeste como também a região da Metropolitana de São Paulo apresentam maior vulnerabilidade hídrica, caracterizada pelo baixo volume dos mananciais atualmente explorados (ANA, 2014; JACOBI et al., 2015). Protozoários patogênicos como Giardia spp. e Cryptosporidium spp. representam uma preocupação significativa para a saúde humana e animal, sendo que a prevenção da contaminação de águas para abastecimento continua a ser um foco importante para as empresas de tratamento e distribuição de água potável (SWAFFER et al., 2014; TRIVIÑO-VALENCIA et al., 2016). Esses organismos são frequentemente encontrados em águas superficiais no mundo todo e estima-se que estejam entre as principais causas dos 4 bilhões de casos de diarreia que ocorrem globalmente a cada ano, além de serem os principais agentes patogênicos responsáveis pela morte de crianças menores que cinco anos de idade (BALDURSSON e KARANIS, 2011; KOTLOFF et al., 2012; STRIEPEN, 2013; BETANCOURT et al., 2014).
Tais protozoários estão ainda entre os parasitos entéricos mais comuns em humanos, mas também infectam uma ampla gama de hospedeiros como mamíferos, aves e répteis (HUNTER e THOMPSON, 2005). As fases infectantes, cistos e oocistos respectivamente, são eliminados em grandes números nas fezes humanas e animais (108-109 por grama de fezes) e são ambientalmente robustos, o que facilita a transmissão desses parasitos por meio da água, o veículo de transmissão mais comumente relatado (CACCIÒ et al., 2005; PLUTZER et al., 2010; PRYSTAJECKY et al., 2014).
As infecções humanas por Giardia spp. e Cryptosporidium spp. são transmitidas via fecal-oral, quer como resultado da transmissão pessoa a pessoa ou por meio de transmissão secundária, como ingestão de alimentos ou água contaminados (PRYSTAJECKY et al., 2014). As manifestações clínicas da giardiose são bastante variáveis e vão desde a ausência de sintomas até diarreia aguda ou crônica, desidratação, dor abdominal, náuseas, vômitos e perda de peso (CACCIÒ e RYAN, 2008), além de sintomas extra intestinais (CANTEY et al., 2011). A criptosporidiose é normalmente uma doença auto-limitante em hospedeiros imunocompetentes, mas pode representar risco de morte em indivíduos imunocomprometidos e crianças (BOUZID et al., 2013).
O desenvolvimento e utilização de ferramentas moleculares para detecção de espécies / genótipos de Giardia e Cryptosporidium teve grande expansão nos últimos anos, o que possibilitou uma melhor compreensão da ampla variedade de hospedeiros e da dinâmica de
transmissão destes dois protozoários patogênicos (THOMPSON e ASH, 2016). Atualmente são aceitos oito grupos genéticos de Giardia duodenalis (A – H) com base em polimorfismo de proteínas ou DNA e apenas dois deles (A e B) estão relacionados com infecções em humanos e animais, enquanto que os restantes (C a H) são hospedeiro específicos e não infectam humanos (MONIS et al., 2009; RYAN e CACCIÒ, 2013). Para Cryptosporidium spp., são reconhecidas 31 espécies sendo que 16 delas, juntamente com alguns genótipos, já foram reportadas em seres humanos (RYAN et al., 2014; LI et al., 2015; HOLUBOVÁ et al., 2016; KVÁC et al., 2016).
Protozoários ciliados são eucariotos altamente diferenciados e especializados. São organismos heterocarióticos que possuem dois tipos de núcleos: um ou mais micronúcleos diplóides envolvidos no processo sexual (conjugação) e, um ou vários nódulos macronucleares responsáveis principalmente pelo controle do metabolismo (LYNN, 2008; AGATHA, 2011; ORSI et al., 2012). Os ciliados ocorrem em quase todos os habitats da Terra, desde o interior do gelo e do fundo do mar até órgãos internos de animais (LYNN, 2008). Entretanto, embora mais de 4.500 morfoespécies de ciliados tenham sido descritas, eles ainda são ignorados dentro da arena da conservação da biodiversidade. Uma das razões é a crença generalizada de que a maioria desses organismos tem distribuições cosmopolitas, em contraste com a biogeografia altamente heterogênea de Metazoa (FOISSNER et al., 2008; COTTERILL et al., 2013).
Os ciliados planctônicos e bentônicos fornecem um importante elo intermediário entre os produtores primários (algas e bactérias) e os níveis tróficos superiores (metazooplâncton e peixes) em ecossistemas de água doce (ZINGEL et al., 2007). Tais organismos são reconhecidos bioindicadores por apresentarem características como aceleradas taxas de crescimento, distribuição ubíqua em ecossistemas aquáticos e facilidade de amostragem (LYNN, 2008; ZHANG et al., 2012; XU et al., 2014).
Devido a essas características, o levantamento taxonômico das espécies de ciliados pode ser fundamental para a avaliação e biomonitoramento da qualidade da água, pois tais organismos respondem prontamente às ações antrópicas como, por exemplo, a descarga de matéria orgânica em corpos hídricos (ZHANG et al., 2012). Além disso, com o aumento do estresse ambiental, impactos antropogênicos e o declínio global da biodiversidade, há uma necessidade urgente de métodos para avaliar a qualidade ambiental que sejam rápidos, confiáveis e de baixo custo o que pode ser proporcionado pela avaliação dos protozoários ciliados (JIANG et al., 2014).
De acordo com Foissner et al. (2008), entre 83-89% das espécies de ciliados de vida livre ainda não foram descobertas. Poluentes da água tais como esgotos domésticos e industriais
além dos pesticidas, podem causar graves problemas devido à contaminação ambiental e levar a grandes perdas de biodiversidade desses microrganismos (CARVALHO, 2006; MANSANO et al., 2016). No Brasil, ainda são escassos os levantamentos de biodiversidade de protozoários ciliados realizados em ambientes de água doce (PAIVA e SILVA NETO, 2004; PAULETO et al., 2009; REGALI-SELEGHIM et al., 2011; MENDONÇA, 2012; VELHO et al., 2013).
Na literatura, são claras as evidências da existência de distintas rotas de transmissão e fontes de infecção sendo que a água contaminada pode conter diferentes grupos genéticos de Giardia e múltiplas espécies de Cryptosporidium (NICHOLS et al., 2014). Assim, a detecção e caracterização molecular desses dois protozoários patogênicos são fundamentais para o entendimento da complexidade da epidemiologia desses protozoários no ambiente, bem como fornecer informações sobre as possíveis fontes de contaminação. A elucidação do conhecimento da diversidade de protozoários ciliados e da epidemiologia dos patogênicos pode permitir inferências sobre o grau de contaminação de um corpo hídrico assim como as possíveis fontes que levam a ela e, portanto, contribuir para o monitoramento da qualidade ambiental.
REVISÃO DA LITERATURA
1. Protozoários patogênicos 1.1. Gênero Giardia
Giardia duodenalis (sin. Giardia intestinalis ou Giardia lamblia) é um protozoário patogênico entérico que afeta todos os grupos de animais vertebrados sendo, na atualidade, o parasito mais frequentemente detectado em humanos (FAO, 2014; THOMPSON e ASH, 2016).
De acordo com a recente revisão de classificação dos organismos eucarióticos, Giardia spp. pertence ao Reino Excavata, Filo Metamonada, Classe Fornicata, Ordem Diplomonadida e Família Giardiinae (ADL et al., 2012).
Tal protozoário possui algumas características que não são usuais, como a presença de dois núcleos diploides ativos, ausência de mitocôndrias e peroxissomos e a presença de uma organela de adesão denominada disco adesivo ventral (THOMPSON e MONIS, 2004).
As técnicas de biologia molecular tem fornecido informações relevantes para a caracterização de Giardia e a análise das diferenças genéticas revolucionou a compreensão de sua taxonomia, genética de populações e epidemiologia da giardiose em humanos e animais. Ensaios com uso da reação em cadeia da polimerase (PCR) têm sido utilizados para a detecção de Giardia em amostras clínicas e ambientais, além de serem também empregados para a diferenciação nos níveis de espécies e genótipos (THOMPSON e MONIS, 2004; CACCIÒ et al., 2005; WIELINGA e THOMPSON, 2007; FENG et al., 2011; RYAN e CACCIÓ, 2013).
Atualmente são aceitas seis espécies de Giardia: G. ardeae e G. psittaci em aves, G. microti e G. muris em roedores e G. duodenalis em mamíferos. Outra espécie, Giardia varani, foi descrita a partir de um lagarto (Varanus salvator) comumente encontrado na Ásia, entretanto, ainda não foi confirmada geneticamente (UPTON e ZIEN, 1997; RYAN e CACCIÓ, 2013).
Giardia duodenalis é a única espécie encontrada em humanos; entretanto já foi descrita em outros mamíferos incluindo animais domésticos e gado e pode ser considerada como um complexo de espécies uma vez que os membros não apresentam variação na sua morfologia, mas são distribuídos em oito grupos (A a H), com base na análise genética (MONIS et al., 2003; FENG et al., 2011).
Até o momento, são considerados os seguintes grupos genotípicos para Giardia duodenalis: A, subdivido em AI, amplamente distribuído geograficamente e com grande potencial zoonótico; AII, que consiste inteiramente de genótipo específico para humanos; e B
que compreende dois subconjuntos, III e IV dos quais apenas o segundo é específico para humanos (SPRONG et al., 2009; PLUTZER et al., 2010; RYAN e CACCIÒ, 2013). Os grupos genotípicos C e D são específicos de cães, enquanto E infecta somente gado bovino e suíno; F, foi descrito em gatos; G, em ratos domésticos e roedores silvestres; H, é encontrado somente em mamíferos marinhos (PLUTZER et al., 2010; RYAN e CACCIÒ, 2013) (Tab. 1).
Tabela 1. Espécies e genótipos reconhecidos de Giardia e a distribuição dos hospedeiros
Adaptado de Ryan e Cacciò (2013) e Thompson e Ash (2016).
O gene SSU rRNA (subunidade menor do RNA ribossômico) é um marcador comumente usado para determinar espécies e genótipos de Giardia e diferentes regiões têm sido alvo de diferentes aplicações. As extremidades variáveis 5´ e 3' do locus desse gene podem ser usadas para identificar os genótipos mais estreitamente relacionados, enquanto que as regiões mais conservadas fornecem informações suficientes apenas para a diferenciação das espécies de Giardia (FENG et al., 2011). Outros marcadores comumente usados são o gdh (glutamato desidrogenase), tpi (triosefosfato isomerase), β-giardina, EF-1α (fator de elongação
Espécie Genótipo Hospedeiros
Giardia duodenalis A Humanos e outros primatas, cães, gatos, bovinos e algumas espécies de animais silvestres
B Humanos e outros primatas, cães, gatos e algumas espécies de animais silvestres
C Cães e outros canídeos D Cães e outros canídeos E Bovinos (herbívoros)
F Gatos
G Roedores
H Mamíferos marinhos
Giardia agilis - Anfíbios
Giardia ardeae - Aves
Giardia psittaci - Aves
Giardia microti - Roedores
1α) e ITS1-5.8S-ITS2 (região que compreende o gene 5.8S rDNA e os dois espaçadores internos transcritos (ITS1 e ITS2) (CACCIÒ et al., 2005; FENG e XIAO, 2011) (Tab 2).
Tabela 2. Genes mais comumente usados para a caracterização molecular de Giardia. Gene/ locus Principal Aplicação Relatos dos usos e benefícios dos
genes específicos 16S rDNA Identificação de espécie e grupos
genotípicos
Comumente usado, proporciona maior sucesso na amplificação. Gene de
múltiplas cópias. GDH Identificação de espécie e grupos
genotípicos
Comumente usado, amplificação tem sucesso variável. Gene de cópia única. TPI Identificação de espécie e grupos
genotípicos
Comumente usado, sucesso de amplificação variável; útil quando existe suspeita de infecção mista. Gene
de cópia única. β-giardina Identificação de espécie e dos grupos
genotípicos
Comumente usado, sucesso de amplificação variável; Fornece identificação do gênero (Giardia).
Gene de cópia única. EF-1α Identificação de espécie e grupos
genotípicos
Não é comumente usado; sucesso de amplificação variável. Gene de cópia
única.
ITS1-5.8S-ITS2
Identificação de espécie Recentemente introduzido na literatura; maior sucesso na amplificação. Gene
de cópias múltiplas. Adaptado de Thompson e Ash (2016) e Cacciò et al. (2005)
A transmissão de cistos de Giardia spp. é feita por meio da via fecal-oral, frequentemente pela ingestão de água e alimentos contaminados. O ciclo de vida é direto e os cistos já atingem o ambiente em estado infeccioso (CAMA e MATHINSON, 2015). Durante a passagem pelo trato gastrointestinal, os cistos são expostos a alterações do pH e à bile o que faz com que excistem e, em seguida, tornem-se trofozoítos. Por meio da motilidade flagelar, os trofozoítos se instalam na luz do intestino delgado até encontrarem um lugar adequado para
fixarem-se nas microvilosidades intestinais (ANKARKLEV et al., 2010). A fixação do trofozoíto é mediada pelo disco adesivo ou ventral que permite ao parasito resistir aos movimentos peristálticos (PALM et al., 2005). À medida que os trofozoítos migram no trato digestivo, mudanças com relação a quantidade de colesterol e outros lipídios desencadeiam a diferenciação em cistos que serão posteriormente liberados com as fezes (SINGER, 2012).
As manifestações clínicas da giardiose são bastante variáveis e vão desde a ausência de sintomas até a ocorrência de diarreia aguda ou crônica, desidratação, dor abdominal, náuseas, vomitos e perda de peso (ECKMANN, 2003; CACCIÒ e RYAN, 2008). A gravidade da doença pode ser determinada por fatores como a virulência do parasito assim como o estado nutricional e do sistema imunológico do hospedeiro (CACCIÒ e RYAN, 2008).
Os sintomas podem aparecer de 7 a 21 dias após a ingestão de cistos e geralmente incluem diarreia, flatulência, dor epigástrica, náuseas, vômitos, perda de peso e chegam a ter duração de até 7 semanas (FARTHING, 1997; HOMAN e MANK, 2001; TAUBER, 2016). Todos estes sintomas têm sido correlacionados com disfunções do intestino delgado, incluindo uma diminuição da área de superfície de bordadura em escova, atrofia de vilosidades e microvilosidades, imaturidade do enterócito, deficiências de enzimas da bordadura intestinal, má absorção de gorduras, eletrólitos, xilose, lactose, ferro, vitamina A e vitamina B12 (ADAM, 2001). A má absorção de nutrientes e eletrólitos cria um gradiente osmótico que atrai água para a luz intestinal, o que resulta em distensão, peristaltismo rápido, e, por fim, a diarreia (CACCIÒ, 2015).
Existem ainda relatos de complicações extra intestinais pela giardiose as quais podem incluir patologias oculares tais como iridociclite, coroidite e hemorragias retinianas. Crianças são mais suscetíveis a lesões na retina acompanhada pela liberação de camadas de grânulos de pigmentos na retina os quais promovem o aparecimento de pontos escuros (PETOELLO-MANTOVANNI et al., 1990; HALLIEZ e BURET, 2013). A maioria dos sintomas extra-intestinais desaparecerem com a terapia adequada para a giardiose, embora, para crianças nem sempre seja eficaz quando são verificadas alterações na retina (CORSI et al., 1998; CANTEY et al., 2011).
Outros sintomas também já foram observados tais como a artrite apesar de ainda pouco relatada, além de coceira e urticária (CANTEY et al., 2011; HALLIEZ e BURET, 2013). Alguns estudos relatam que a giardiose pode desencadear hipocalemia, especialmente em idosos hospitalizados e parece estar relacionada a perda de potássio devido ao número de episódios de diarreia por dia (ADDISS et al., 1994). Cantey et al. (2011) sugerem que os
sintomas extraintestinais da giardiose não são raros e contribuem para o atraso no diagnóstico da doença. Ademais, apenas especula-se os mecanismos envolvidos em tais sintomas que podem ser devido a metabólitos secundários liberados pelo parasito, alterações na captação do antígeno pelo intestino delgado durante o curso da doença, talvez em associação com a proliferação de mastócitos e o desenvolvimento de processos alérgicos, presença de antígenos bacterianos em fluidos sinoviais possivelmente relacionados ao aumento da permeabilidade intestinal, disfunção da barreira intestinal, entre outros (HALLIEZ e BURET, 2013).
Em 2004, a OMS (Organização Mundial de Saúde) reconheceu a giardiose como doença negligenciada e ressaltou sua ligação com a pobreza (SAVIOLI et al., 2006). Taxas de infecção já foram relatadas tanto em países desenvolvidos quanto naqueles em desenvolvimento e podem variar de 8 a 30% (FENG et al., 2011; CACCIÒ, 2015). Essas taxas podem ser mais elevadas se indivíduos com diarreia forem levados em consideração, entretanto, o cenário epidemiológico atual é muito influenciado pelo fato de muitos países não relatarem os dados referentes à infecção por giardiose devido a falta de programas de monitoramento e pela alta taxa de portadores assintomáticos o que sugere que essa doença seja subdiagnosticada e subestimada (CACCIÒ e SPRONG, 2010; CACCIÒ, 2015).
Outro fator relevante é que os cistos apresentam grande resistência às condições ambientais e podem sobreviver mais de dois meses em água superficial com temperaturas entre 0 a 4oC, além de persistirem frente aos desinfetantes comumente usados em estações de tratamento de água (FENG et al., 2011; PRYSTAJECKY et al., 2015).
A identificação aprimorada e confiável de espécies de Giardia a partir de hospedeiros infectados, além da água e alimentos contaminados, é necessária para o entendimento dos padrões de transmissão além de elucidar a complexa epidemiologia da giardiose (CACCIÒ et al., 2015).
1.2. Gênero Cryptosporidium
Cryptosporidium spp. é um protozoário patogênico responsável pela criptosporidiose em humanos e animais (CLODE et al., 2015). Trata-se de um dos parasitos de veiculação hídrica mais prevalentes no mundo todo e uma das principais preocupações em Saúde Pública uma vez que o oocisto, a forma infectante, é resistente aos desinfetantes mais comuns tais como o cloro, adotado nas estações de tratamento de água (PAPARINI et al., 2015; BALDURSSON e KARANIS, 2011).
Esse protozoário era anteriormente classificado como pertencente à Classe Coccidia (FAYER, 2004), mas estudos como os de Carreno et al. (1999), Karanis et al. (2008) e Karanis e Aldeyarbi (2011) ressaltaram, por meio da observação de estádios ao longo do processo de excistamento e do sequenciamento do gene 18S rRNA, a relação morfológica e filogenética mais próxima com as gregarinas do que com os coccídios. Tais achados não tiveram a adequada atenção pela comunidade científica, entretanto, Clode et al. (2015) retomaram tais pesquisas e, atualmente, Cryptosporidium está classificado na Classe Cryptogregaria que se caracteriza por conter organismos epicelulares, possuir uma organela alimentar como a das gregarinas (epimerito) mas que não apresentam apicoplasto (CAVALIER-SMITH, 2014).
Outro achado muito relevante de estudos in vitro e in vivo foi a verificação de que formas do ciclo de vida de Cryptosporidium podem se desenvolver em ambiente extracelular, ou seja, fora de uma célula hospedeira (HIJJAWI et al., 2010; KOH et al., 2014).
A possibilidade de Cryptosporidium se multiplicar em biofilmes nas estações de tratamento de água ou esgoto apresenta novos desafios para o gerenciamento correto desses recursos frente aos maiores riscos de ocorrência de surtos de veiculação hídrica (CLODE et al., 2015). Além disso, biofilmes microbianos podem ser formados no interior do intestino humano o que implica em grande importância quanto à suscetibilidade do hospedeiro, assim como no curso da infecção (CLODE et al., 2015).
A criptosporidiose já foi relatada em 95 países e seis continentes, tanto em pacientes imunocompetentes como em imunocomprometidos (pacientes VIH positivos, transplantados e aqueles em quimioterapia) (FAYER et al., 2000; RYAN et al., 2014) e ganhou destaque com o início da pandemia de SIDA (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida) nos anos 80, na qual o Cryptosporidium surgiu como uma ameaça à vida para as pessoas infectadas. Nos dias de hoje, os grupos de risco para a criptosporidiose também incluem crianças até cinco anos de idade, idosos, diabéticos, desnutridos, pacientes hospitalizados em unidades de tratamento intensivo e aqueles que fazem hemodiálise além dos portadores de refluxo gastro-esofágico (CACCIÒ e PUTIGNANI, 2014; PULESTON et al., 2014).
Essa parasitose é prevalente em países em desenvolvimento, provavelmente devido a alta intensidade de contaminação ambiental e pelas deficiências em infra-estrutura sanitária e higiene precária (XIAO, 2009). Atualmente, a criptosporidiose tem um caráter re-emergente especialmente em crianças de 0 a 5 anos de idade em países em desenvolvimento, particularmente na África (CLODE et al., 2015).
Um dos fatores que contribui significativamente para o sucesso da dispersão de Cryptosporidium spp. no ambiente é o grande número de oocistos que são eliminados dos hospedeiros no ambiente (RYAN et al., 2014). Um bezerro pode liberar mais de 5x106 oocistos por grama de fezes e tal fato representa uma das maiores ameaças à contaminação ambiental e transmissão para humanos (CACCIÒ e PUTIGNANI, 2014). Outro fator relevante é que os oocistos são resistentes frente às condições ambientais adversas e podem sobreviver por muitos meses em clima temperado e condições adequadas de umidade (RYAN et al., 2014).
A baixa dose infecciosa também é importante na disseminação da parasitose. Em estudo com voluntários imunocompetentes realizado em Houston (Texas, Estados Unidos), a dose média infectante para Cryptosporidium hominis foi de 10 a 83 oocistos e, para Cryptosporidium parvum, de 10 a 1000 oocistos (CHAPPELL et al., 2006). Em 2011, Chappell et al. verificaram o desenvolvimento da criptosporidiose também em voluntários imunocompetentes que ingeriram 105 oocistos de Cryptosporidium meleagridis.
Cerca de 31 espécies de Cryptosporidium spp. são aceitas até o momento e mais de 50 genótipos foram descritos, entretanto, apenas duas espécies são responsáveis por mais de 90% dos casos registrados de criptosporidiose: C. hominis e C. parvum (RYAN et al., 2014; RYAN e HIJJAWI, 2015; LI et al., 2015; KVÁC et al., 2016; HOLUBOVÁ et al., 2016; RYAN et al., 2016) (Tab. 3). Além dessas, outras espécies também já foram registradas em humanos como C. muris, C. bovis, C. meleagridis, C. ubiquitum, C. cuniculus, C. canis, C. felis, C. suis, C. andersoni, C. fayeri, C. tyzzeri, C. viatorum, C. scrofarum e C. erinacei (RYAN e HIJJAWI, 2015).
A espécie C. meleagridis é a terceira mais comun em humanos e a prevalência varia de 0,9% a 20,6%, sendo menor nos países industrializados em comparação àqueles em desenvolvimento, entretanto, alguns estudos realizados em pacientes infectados pelo vírus HIV, indicam que a prevalênia dessa espécie é semelhante à de C. parvum (GATEI et al., 2002; CAMA et al., 2007; IQBAL et al., 2011; SILVERLAS et al., 2012).
Tabela 3. Espécies válidas de Cryptosporidium spp. e os principais hospedeiros.
Espécie Principais hospedeiros Infecciosidade para o ser humano
1. C. andersoni Gado bovino Sim
2. C. avium Pássaros Não
3. C. baileyi Galinhas Não
4. C. bovis Gado bovino Sim
5. C. canis Cães Sim
6. C. cuniculus Coelhos Sim
7. C. erinacei Ouriço Sim
8. C. fayeri Cangurus vermelhos Sim
9. C. felis Gatos Sim
10. C. fragile Sapos Não
11. C. galli Pássaros Não
12. C. hominis Humanos Sim
13. C. huwi Peixes Não
14. C. meleagridis Perus Sim
15. C. macropodum Cangurus cinzas Não
16. C. molnari Peixes Não
17. C. muris Ratos Sim
18. C. parvum Gado bovino Sim
19. C. proliferans Rato toupeira Não
20. C. rubeyi Esquilos Não
21. C. ryanae Bovinos Não
22. C. scophthalmi Peixes Não
23. C. scrofarum Suínos Sim
24. C. serpentis Répteis Não
25. C. suis Suínos Sim
26. C. viatorum Humanos Sim
27. C. tyzzeri Camundongos Sim
28. C. ubiquitum Cervos Sim
29. C. varanii Lagartos Não
30. C. wrairi Cobaios Não
31. C. xiaoi Ovelhas Não
A transmissão dos oocistos é feita pela via fecal-oral, de maneira direta ou indireta. Para humanos, a transmissão direta pode ser feita pelo contato pessoa a pessoa (especialmente em locais com condições de higiene precárias) e de animais para pessoas. É necessário destacar que locais como creches e ambulatórios assim como trabalhadores que lidam diretamente com animais e veterinários devem ter cuidados maiores com a higiene para evitar a transmissão. A maioria dos casos de transmissão indireta ocorre principalmente pela ingestão de água potável ou de recreação contaminadas (CACCIÒ e PUTIGNANI, 2014).
Surtos causados pela ingestão de alimentos contaminados também ressaltam essa rota de transmissão como uma via importante de aquisição da criptosporidiose (OMS, 2015). A contaminação pode ter início nos locais de produção nos quais as culturas podem entrar em contato com esterco usado na adubação, água contaminada usada na irrigação ou a partir do contato direto dos manipuladores dos alimentos (RYAN et al., 2014). O protozoário Cryptosporidium spp. já foi implicado como o quinto agente etiológico em surtos causados pela ingestão de alimentos crus tais como hortaliças além de suco de frutas e leite (ROBERTSON et al., 2013).
Cryptosporidium spp. tem um ciclo de vida monoxênico no qual todas as fases do desenvolvimento (assexuada e sexual) ocorrem dentro de um hospedeiro (GHAZY et al., 2015). O ciclo de vida inicia-se com a ingestão do oocisto pelo hospedeiro e, após o excistamento, quatro esporozoítos são liberados e invadem as células epiteliais do trato gastrointestinal. Os estádios subsequentes são intracelulares, mas extra citoplasmáticos, pois o parasito localiza-se na superfície da microvilosidade da célula epitelial hospedeira. É importante ressaltar que essa localização específica do Cryptosporidium na célula do epitélio intestinal durante o desenvolvimento, proporciona proteção contra a resposta imunológica do hospedeiro assim como do ambiente hostil do intestino; entretanto, o parasito tem acesso às reservas nutricionais e energéticas da célula hospedeira considerando que ele permanece em um vacúolo parasitóforo, e possui uma organela alimentar, circundado por uma membrana que permite a entrada de nutrientes da célula hospedeira para o parasito (TZIPORI e WARD, 2002; CLODE et al., 2015; GHAZY et al., 2015). Esse estádio é conhecido como trofozoíto e pode permanecer como uma célula única ou se associar com outros trofozoítos por meio do processo de sizígia (CLODE et al., 2015).
Esses trofozoítos que estão no vacúolo parasitóforo podem também realizar o processo de merogonia que produzirá merontes do tipo I que conterão dezenas de merozoítos do tipo I. Na sequência, esses merozoítos são liberados da célula hospedeira e iniciam a fase sexuada do
ciclo de vida e darão origem aos microgamontes e aos macrogamontes. Nessa fase, tanto a fissão binária quanto a sizígia podem ser realizadas para aumentar o potencial reprodutivo de Cryptosporidium. Um microgameta fertilizará um macrogameta para a produção de um oocisto (CLODE et al., 2015).
Os oocistos apresentam um tamanho pequeno e formato esférico com quatro esporozoítos no interior com formato de meia-lua (FAYER, 2004; CHATTERJEE et al., 2010). A parede externa do oocisto, que circunda os esporozoítos, pode proporcionar proteção sob diferentes condições de temperatura (podem permanecer infecciosos a 25ºC durante doze semanas ou a 4ºC por 24 semanas) ou umidade por vários meses, especialmente nos países de clima temperado, nos quais a temperatura em rios e lagos permanece baixa durante o ano todo, mas acima da temperatura de congelamento da água, fazendo com que essas formas permaneçam infectantes (FAYER, 2004; KING et al., 2005; KEEGAN et al. 2008; CHATTERJEE et al., 2010).
Os avanços nas ferramentas de biologia molecular implicaram em contribuições para a identificação das espécies e genótipos de Cryptosporidium e um grande número de genes tem sido utilizados para esse propósito (RUECKER, 2013). Entretanto, apenas alguns genes descritos até o momento têm as sequências disponíveis em uma ampla gama de isolados desse parasito em níveis de espécie e genótipo, tais como 18S rRNA, HSP70, COWP e genes da actina (RUECKER, 2013) (Tab. 4).
Tabela 4. Sumário dos principais genes alvos usados para a detecção e identificação das espécies / genótipos de Cryptosporidium.
Gene / locus Principal Aplicação Relatos dos usos e benefícios dos genes específicos
Subunidade ribossomal menor (18S rRNA)
Detecta e diferencia todas as espécies conhecidas e genótipos hospedeiro-específicos
O gene mais utilizado para amostras clínicas e ambientais
Proteína do choque térmico 70 (HSP 70)
C. parvum, C. hominis e outras espécies
Tipicamente usada para a detecção multilocus em amostras clínicas e ambientais
Proteína da parede externa de Cryptosporidium (COWP)
C. parvum, C. hominis e outras espécies
Segundo gene mais utilizado para amostras clínicas e ambientais
Actina C. parvum, C. hominis e
outras espécies
Tipicamente usada para a detecção multilocus
Glicoproteína 60 (GP60) C. hominis, C. parvum, C. meleagridis, C. cuniculus
Ferramenta para subgenotipagem
Adaptado de Ruecker (2013).
Os genótipos de Cryptosporidium spp. relatados compreendem isolados que ainda precisam ter a concessão do status de espécie e os que demonstraram diferenças com relação a espécies conhecidas mas ainda não estão totalmente caracterizadas (NICHOLS et al., 2014). O gene GP60 tem sido mais comumente usado para demonstrar a diversidade intra específica de C. parvum e C. hominis e tal análise tem contribuído para um melhor entendimento da criptosporidiose humana, especialmente para a investigação de surtos e para rastrear as fontes de contaminação de alimentos e água (NICHOLS et al., 2014).
Esse protozoário é, depois do rotavírus, a segunda causa mais importante de diarreia moderada a severa em crianças na África e Sul Asiático (KOTLOFF et al., 2013; STRIEPEN, 2013). Entretanto, rotavírus pode ser prevenido por meio da vacinação, o que não ocorre com Cryptosporidium. O tratamento da criptosporidiose é limitado apenas a nitazoxanida que ainda exibe eficácia moderada em crianças imunocompetentes e em pacientes HIV positivos (RYAN et al., 2014).
A prevenção de surtos e o desenvolvimento bem-sucedido de terapias anti-Cryptosporidium são amplamente dependentes de uma melhora no entendimento de sua biologia e comportamento (CLODE et al., 2015).
2. Contaminação de mananciais para abastecimento humano e surtos de veiculação hídrica causados por Giardia spp. e Cryptosporidium spp.
A contaminação da água potável por agentes patogênicos é uma questão importante no mundo todo porque ainda é a principal fonte de veiculação de doenças que causam diarréia. Segundo a OMS, a mortalidade por tais doenças é superior a 5 milhões pessoas por ano (OMS, 2008).
Muitos dos principais problemas que a humanidade está enfrentando no século XXI estão relacionados com quantidade e/ou a qualidade da água devido aos altos níveis de urbanização e a concentração das populações em grandes cidades além da grande diversidade de atividades socioeconômicas (AJEAGAH, 2013; UNESCO, 2010).
Os problemas relacionados ao saneamento, higiene e disponibilidade de água potável diferem entre países desenvolvidos e aqueles em desenvolvimento. Em países desenvolvidos, a manutenção e substituição da instalação sanitária e infraestrutura de abastecimento de água são tratados como prioridade enquanto que naqueles em desenvolvimento, nos quais a maioria dos esgotos ainda é despejada nos corpos hídricos sem tratamento adequado, a melhoria do saneamento e acesso à água potável não são abordados de maneira fundamental pelos governos (UNESCO, 2010). A maior parte do aumento da população nas áreas urbanas ocorrerá nos países em desenvolvimento sendo assim, estima-se que em 2030, 67% da população mundial ainda não estará conectada a um serviço público de sistema de esgoto (UNESCO, 2010).
Sendo assim, a água contaminada pode ser um veículo importante para surtos de doenças causadas por diversos patógenos humanos (BRUNKARD et al., 2011). Contaminantes químicos e microbiológicos podem ocorrer em águas superficiais por meio do escoamento proveniente de áreas agrícolas, de áreas de pastagens, esgoto, efluentes industriais e águas residuárias vindas de áreas urbanas (SEMENZA et al., 2012). As águas superficiais também podem ser contaminadas por fezes humanas e de animais silvestres e domésticos infectados. A contaminação pode ainda ser afetada por eventos climáticos extremos, tais como precipitação significativa (SEMENZA, 2014).
Doenças de veiculação hídrica ocorrem no mundo todo e os surtos causados pela contaminação dos sistemas de tratamento de água têm o potencial de afetar grandes números
de consumidores (KARANIS et al., 2007; PLUTZER e KARANIS, 2016). Tais surtos têm consequências econômicas além dos custos relativos aos cuidados de saúde para os pacientes afetados, como também criam uma falta de confiança na qualidade da água potável e na indústria da água em geral (KARANIS et al., 2007).
Os protozoários patogênicos Giardia e Cryptosporidium foram os principais agentes etiológicos de surtos de veiculação hídrica em um levantamento feito entre 2004 e 2010 ao redor do mundo (BALDURSSON e KARANIS, 2011), o que demonstrou que essa rota de transmissão desempenha um papel importante na epidemiologia desses parasitos (PRYSTAJECKY et al., 2015). Até o ano de 2010 foram registrados 524 surtos de diarréia atribuídos à transmissão hídrica sendo que a maioria deles foi causado por Giardia spp. e Cryptosporidium spp. (202 e 285, respectivamente) (KARANIS et al., 2007; BALDURSSON e KARANIS, 2011; PLUTZER e KARANIS, 2016). Os outros 37 surtos foram causados por outros protozoários de veiculação hídrica como Entamoeba histolytica (10), Cyclospora cayetanensis (9), Toxoplasma gondii (7), Cystoisospora belli (7), Blastocystis hominis (3), Acanthamoeba spp. (3), Balantidium coli (1) e Naegleria fowleri (1) (KARANIS et al., 2007; BALDURSSON e KARANIS, 2011; PLUTZER e KARANIS, 2016). Há amplas evidências de que a gestão inadequada da distribuição de água potável levou a surtos de giardiose e criptosporidiose tanto em países desenvolvidos como quanto naqueles em desenvolvimento (OMS, 2014).
Um levantamento feito pelo Centro de Controle de Doenças dos Estados Unidos (CDC) verificou que entre 1971 e 2011 foram registrados 242 surtos de giardiose que afetaram mais de 41.000 pessoas, somente nesse país. A principal causa de transmissão foi a hídrica (74,8%), seguida de alimentar (15,7%), contato pessoa a pessoa (2,5%) e contato com animais (1,2%) (ADAM et al., 2016). Na Europa, no período entre 2008 e 2012, foram registrados 9.577 casos esporádicos de criptosporidiose e 16.167, de giardiose (ECDC, 2014).
O maior surto já registrado de giardiose ocorreu em 2004 na Noruega (país com o maior índice de desenvolvimento humano no mundo), na cidade de Bergen. Estima-se que cerca de 48.000 pessoas foram expostas a água potável contaminada e 2.500 receberam tratamento médico. Na Noruega, mais de 90% dos quase 500 casos anuais de giardiose eram relacionados a pessoas que viajavam para fora do país (NYGARD et al., 2006). Tal surto pode ter sido causado pelo escoamento de esgoto para o lago usado como manancial após dias de chuvas muito fortes (NYGARD et al., 2006). Investigações posteriores desse surto de giardiose
indicaram que pelo menos 133 pacientes tiveram criptosporidiose sendo que Cryptosporidium parvum foi o agente etiológico identificado (ROBERTSON et al., 2006).
O maior surto de criptosporidiose por veiculação hídrica já registrado foi em Milwaukee (Wisconsin, Estados Unidos) em 1993 no qual mais de 400.000 pessoas foram afetadas devido a processos ineficazes de retro lavagem dos filtros e dosagem incorreta de coagulantes na estação de tratamento de água, o que levou a remoção inadequada de oocistos (MACKENZIE et al., 1994; SOLO-GABRIELE e NEUMEISTER, 1996).
Decorridos 17 anos após o surto de Milwaukee, o segundo maior surto de criptosporidiose ocorreu na cidade de Östersund (Suécia) no final de 2010 e envolveu cerca de 27.000 pessoas. Esse surto é também o maior de veiculação hídrica já registrado na Europa (WIDERSTRÖM et al., 2014). A suspeita era que o esgoto de algumas famílias estava sendo diretamente despejado em um córrego que desaguava em um lago a partir do qual a água potável era obtida.
Apenas seis meses depois do segundo maior surto ocorrido na Suécia outro episódio foi registrado em Skellefteå, cidade mais ao norte de Östersund, e afetou cerca de 20.000 pessoas que manifestaram sintomas da criptosporidiose (WIDERSTRÖM et al., 2014). A causa desse surto não foi estabelecida, mas considerou-se que poderia estar parcialmente relacionado com o surto de Östersund. A distribuição de água em ambas as cidades era ineficiente quanto às barreiras necessárias para impedir a passagem dos oocistos. As autoridades então reconheceram a importância dessas barreiras, a necessidade do estabelecimento de um Plano de Segurança da Água além da detecção de Giardia e Cryptosporidium nos laboratórios de diagnóstico como passos cruciais na resposta a surtos (WIDERSTRÖM et al., 2014).
Surtos de criptosporidiose e giardiose também ocorreram em pequenas e grandes comunidades devido à veiculação hídrica e tal fato indica a capacidade de Giardia e Cryptosporidium resistirem aos tratamentos padrões dos sistemas de água de pequenas comunidades rurais, mas também áreas urbanas, como visto em Milwaukee (DORE, 2015). As falhas do sistema, particularmente no processo de tratamento, são o principal fator de contribuição que permite a ocorrência de surtos além de um ineficaz tratamento com cloro e uma inadequada filtração de fontes de água superficiais (DORE, 2015).
No Brasil não há relatos de surtos de giardiose e criptosporidiose devidamente documentados uma vez que não são parasitoses de notificação obrigatória para os serviços de saúde, entretanto diversos trabalhos tem relatado a presença de cistos e oocistos em águas usadas para abastecimento humano (OSAKI et al., 2013; RAZZOLINI et al., 2010; SATO et
